私たちはマイケル ・ ヘイマンに感謝し、フランク入植者のケイ素の生産のためのウェーハ、コア施設 MPI-B 蛋白質の浄化およびサイモン クレッチマーの支援のため、原稿のコメントのレオン ・ ハリントン。

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プロトコルを説明しました MinCDE 平面上の自己組織化の in vitro再構成サポート脂質二重膜、脂質二分子膜覆われて立体構造 PDMS 微細構造の棒形の例を使用します。これらの試金から貴重なデータを取得するために制御する最も重要な要因、蛋白質および膜の品質です。
蛋白質、蛋白質品質を確実に SDS-PAGE と質量分析法を使用して質量を確認する必要があります。さらに、タンパク質、水溶性いない集計データ、分析ゲルろ過や動的光散乱による検証する必要があります。ゲル濾過法は、タンパク質の集約された端数を削除する使用できます。慎重な pH 調整と追加されたヌクレオチドの質が重要なタンパク質に非調整または部分的に劣化したヌクレオチドの付加として株式や自己組織化の試金は蛋白質の活動、そのため廃止を除去するために十分です自己組織化。
蛋白質品質の横にある膜の品質は最も重要な不適切な膜形成はほとんどの場合、欠陥の自己組織化と artefactual 表面構造の起源のための原因。
初めてのプロトコルを実行している場合、人工脂質膜を含む低モル パーセントの Atto-655-ドープなど DiI 標識脂質 (0.05%) でラベル付けに便利です。それによりプロパティおよび膜の品質は直接判断することができます。FRAP を用いた膜の流動性を評価できます。さらがいずれかのすべてでは、あまりにも多くの小胞やないの流体膜ない膜になる洗浄されている場合、直接、SLB の洗浄品質を評価 1 つできます。開いた区域により厳密な膜を洗浄して、それゆえまた、SLB の表面に付着、小胞を削除します。クリーニングと支持面と正しいサイズの親水性、対SU の均質性膜は、流体と同質の脂質を取得するための最も重要な要因それは SUV サイズとサイズ分布を使用してチェックすると便利することができます。動的光散乱します。狭い粒径分布、膜小胞を押し出すのではなく、sonicating それらをお勧めします。クリーニング coverslips、強塩基、基本的な洗剤または水で洗浄した後に直接 coverslips を使用してトリートメントなどの他の方法は、アプリケーションと脂質の混合物によって、良好な結果をもたらす可能性があります。
紹介、オープンの部屋で平面のサポートされている脂質膜の in vitro再構成プロトコルの最初の半分が全反射顕微鏡30、FRAP などの光学系のアクセス可能な表面のレンダリングの利点分析6、単一粒子追跡原子間力顕微鏡26など表面プローブ技術と同様に、34。大均一領域で定義された濃度でより良い統計できます。さらに開いた区域アプローチは蛋白質の集中そしてさらにコンポーネント、それゆえシングルチャンバー20の蛋白質の集中を滴定する許可を迅速かつ簡単な追加を正確に制御できます。アッセイは、FtsZ22,35、ZipA22キメラタンパク質 FtsZ YFP MTS10,35など他の細菌 divisome のコンポーネントを追加して拡張できます。
他のグループは、分システム、体外、代わりに開いた区域17,18,19使用流体セルの再構成に似たようなアプローチをとっています。フロー セル利点がある、特に完全に囲まれた 3 D 環境が必要な18、流れ17,19,23の影響または膜組成23 MinCDE のパターンには調査、または蛋白質パターンは、タンパク質制限条件19の下で観察される場合。それにもかかわらず、分子の濃度の局所制御が難しくなります。膜に強く結合するタンパク質成分、特に心、彼らの出会い18,19。私たちの経験では蛋白質は頻繁チューブ、入り江、注射器やその他のマイクロ部品に非特異的結合を展示します。したがって、ローカル蛋白質濃度入力濃度18とは異なります、またフローセル、19他の人によって観測されたさまざまな異なるタンパク質パターンの入口と出口の間膜上の結果の長さの異なります。
2 番目のプロトコルの半分は、ここで提示棒状組織脂質で覆われているパターンのサポートに開いた区域アプローチを再使用の in vitro再構成膜は、生体内の蛋白質の動作の単純な模倣にもかかわらず蛋白質濃度を正確に制御がバッファー除去のため失われます。だの波長は約 1 桁大きい体外体内より棒状 microcompartments がについて 1 つ桁違いに大きい (10 x 30 μ m) 棒状大腸菌よりもセルに注意してください。
全体的に、このプロトコルは、タンパク質濃度、バッファー組成、膜特性を含むすべての条件を正確に制御できます。3 D の構造化されたサポート使用する空間拘束、生体内の複雑なマイクロ流体装置を必要とせず動作を模倣に師事する反応。

時空間パターンは規制の細胞分裂1,2形態から多細胞と細胞レベルで、複雑なタスクを調整する性質に不可欠です。反応拡散系は、これらのパターンの確立に重要な役割を果たすが、まだよく理解されています。これまでのところ反応拡散系と特徴づけられる最高の生物学的システムの典型的な例は大腸菌・ MinCDE システム3,4,5,6,7です。MinCDE システムはフューチャー部門サイトとしてセルの中心を決定するエシェリヒア属大腸菌の細胞極に細胞極から発振します。このシステムは、鉱山と空間反応行列8として膜蛋白質のアクティブ化 atp アーゼ、atp アーゼ心に基づいています。ミンツはパターン形成機構の一部ではないが、実際の機能エージェント: 主な divisome 蛋白質 FtsZ5,6の阻害剤。ミンツの心にバインドし、従って続く振動、細胞極で極大値と極小セル中央には、タンパク質の時間平均濃度勾配の結果のみを midcell9,10 時忘 FtsZ を許可.MinCDE システムは細菌2、時空間の組織配置と輸送タンパク質複合体11とプラスミド12およびセルを調整するための鍵は、ウォーカーの Atpase の大きな家族の一員部門13と染色体分離14。したがって、MinCDE 反応拡散系だけでなく、典型的な反応拡散系を表しますもの関連性細菌における時空間の組織のため注目を集めています。
MinCDE システムは、生体内での機能を解明は、タンパク質と遺伝子の削除の操作は通常細胞分裂の欠陥の結果、複雑です。さらに、膜の組成や生体内で細胞質のプロパティを変更することは非常にチャレンジングな15,16。システムと影響因子を変更は細胞分裂としてそのような本質的な機能に邪魔されてさらにその細胞の複雑な環境で解釈するは難しい。私たちと他の人ためになっているの in vitro再構成アプローチ、コア コンポーネントにシステムの削減: 心、鉱山、エネルギー源として ATP と反応行列6,17,として脂質18. このボトムアップ ・ アプローチにより、生きている細胞の複雑な詳細に自己組織化のメカニズムを調査します。旅行表面蛋白質フォーム波の波長、通常体内のより大きい大きさについてとはいえ6とパターン17,19これらの条件の下での他の種類。パターン形成に影響を与えるすべての側面を正確に制御を容易に開いた区域の使用: ATP 濃度、バッファー組成、膜組成10蛋白質プロパティ20タンパク質濃度66、としてエージェント21と他の divisome 蛋白質22混雑感など他の要因を追加。比較では、フローセル18,19,23 MinCDE システムの in vitro再構成を流れ17,23, タンパク質の影響を調査する使用ことができます。条件19、膜組成19完全 3次元閉じ込め18タンパク質パターンの制限、蛋白質/成分濃度および複雑なシーケンシャル コンポーネントを加えてより多くの正確なコントロールをレンダリングします。
この開いた区域を使用して、我々 も、1 つはどのように幾何学的な境界の影響パターン形成21、最近現象を調べることができる平面脂質二重層のサポートをパターン化調査生体内で細菌を使用されても微細構造7に成形。システム20の影響パターン形成も私にどのように定義された突然変異を調査するこのアッセイを採用しました。さらに、光、アッセイに鉱山、アゾベンゼン架橋のペプチドを導入し、全反射顕微鏡24イメージングによるパターン形成を制御できる方法を調査する同じ基本的な法形式を採用されています。
わかった、だがパターンを複製するために形成を観察生体内での in vitroシステム,監禁されたキー。サポートされている脂質二重膜で覆われただが生体外で(10 x 30 μ m) の大きい波長に調整寸法ロッド型 microcompartments の使用許可だがポール - 振動とタンパク質の勾配形成の再構成10,25。このアッセイで人工脂質膜が上に開いたまま棒状の microcompartments のいくつかの百のレプリカが含まれるパターンの PDMS 基板上に堆積します。これにより、開いた区域の反応を設定できます、それにより小さいボリュームに反応を拘束、microcompartments の縁にバッファーを下げたその後。にもかかわらず、これらのコンパートメントは片側空気バッファー インターフェイスを持って、表さない膜にフル 3 D の閉じ込めがそれ故に、蛋白質ダイナミクス体内振動10、25の真似。フル 3 D の閉じ込めと比べると、18の結果非常に類似を表わす、オープン微細構造分析は比較的単純で簡単に処理し、専門マイクロ装備整ってない所で実行することも、クリーン ルーム設備。
ここでは、提案する脂質二分子膜の in vitro光学顕微鏡によると、マイナーですべてのコンポーネントとの容易なアクセスの制御は、オープンのチャンバーを用いたパターン形成サポート MinCDE の再構成のための実験プロトコル変更、表面プローブ技術26適応可能であるも。平面脂質二分子膜の横にある蛋白質の閉じ込めにできる方法も紹介ロッド型 PDMS の微細組織に及ぼす単純なパターン化されたサポートされている脂質二重層を使用して取得します。これらのアッセイ MinCDE システム向けに最適化が転送することも FtsZ27や28最小限アクチン皮質などの膜を同様の方法で操作する他の蛋白質のシステムに。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPG</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipid extract</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt trihydrate</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9277.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Termo Fisher Scientific</td>
			<td>20491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.08418.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid 98%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>173163.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 50%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>147064.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>05288.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td>Uvasol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol 86%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2316.x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto-655-DOPE</td>
			<td>Atto Tec</td>
			<td>AD 655-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td></td>
			<td>SYLGARD 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Glue</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>6801</td>
			<td>#68 and #63 both work well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1 24x24 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td>used only for PDMS microstructures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml reaction tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030123301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture flask 2L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>e.g. 734-1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Trap HP</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7322010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL</td>
			<td>Termo Fisher Scientific</td>
			<td>66333 or 66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>automated protein purification system: &#196;kta Pure</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>e.g. Model 1510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARE-250 mixer</td>
			<td>Thinky Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner Zepto</td>
			<td>Diener electronic</td>
			<td></td>
			<td>use oxygen as process gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive displacement pipettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td></td>
			<td>Transferpettor models with glass tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM780 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-MinD_MinE</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-MinE</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-EGFP-MinD</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-EGFP-MinD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-mRuby3-MinD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His- MinC</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers

細胞の基本的な時空間組織の多くの側面は、反応拡散型システムによって支配されます。このようなシステムのin vitro再構成が実行できない彼らのメカニズムの詳細な研究が可能になります体内。ここでは、MinCDEエシェリヒア属大腸菌細胞中の細胞分裂隔壁の位置する系の生体外の再構成のプロトコルを提供します。アッセイは、のみに必要なコンポーネントの自己組織すなわち膜、心の 2 つの蛋白質と私と ATP の形でエネルギーを供給する設計されています。我々 したがってサポートされている脂質二重膜が形成が観察にオープン反応チャンバーを作製します。商工会議所のオープンな設計は、脂質二重層の最適な準備と一括コンテンツの制御操作します。2 つの蛋白質の心と、私と同様、ATP、細胞膜上一括ボリュームに追加されます。イメージングは、共焦点、広視野設計支援と同様の全反射型顕微鏡として、多くの光学系によって可能です。プロトコルのバリエーションとして、脂質二重膜は、PDMS のミクロのセル状構造、ガラスではなくパターンのサポートに形成されます。これらのコンパートメントの縁に一括ソリューションを下げるより小さいコンパートメントで反応を囲み、体内振動現象の模倣ができる境界を提供します。一緒に取られて、私たちプロトコルについて説明して空間拘束なしの MinCDE システムを再構成する濃度範囲など他の要因の追加のパターン形成に影響を与えるすべての側面を正確に制御する研究者を許可します。または蛋白質、体系的に比較的単純な実験のセットアップでシステムの複雑さを増加します。

蛋白質の浄化のプロトコルを次には、Min タンパク質は十分な純度が得られるはず。参考として図 1は心、心、鉱山、ミンツを蛍光標識の SDS-PAGE イメージを提供します。人工脂質膜の非パターン化のだが自己組織化分析を実行するプロシージャの個々 のステップは、図 2のとおりです。このプロトコルを使用すると、(図 3) 庫内正規だが表面波の旅を観察できます。波長で、チャンバ内で多少異なりますが、一般的なパターンのよいます。UV 接着剤のフォームがガラスのプロパティと異なるプロパティを持っているように見える膜表面が (図 3を参照)、定量的な比較は、商工会議所の端を使用しないでください。表面波は伝搬方向 (図 3 b) 強度をプロットすることによって分析できます。心蛍光波のリーディング エッジから高速ではなく高原は、後縁は急激に少なくし、鉱山蛍光心波の開始からほぼ直線的に増加、心後トレーリング エッジでその最大数に達した、それ6著しく落ちる。
蛋白質品質の横にある人工脂質膜の品質は MinCDE の定期的自己組織化にとって最も重要なです。一方で、膜はあまりにも過度に洗浄または基になる表面が洗浄され、従って余りに強く荷電、穴が膜で形作ることができる (図 6 a上)。一方、膜をきちんと洗っていない、または基になる表面はきれいに hydrophilized、小胞膜に固執するだろうまたは膜の流動性が損なわれます (図 6 a下)。でも明らかではない、直接標識脂質膜を観察し、これらの問題も検出できます心蛍光信号から、パターンが通常、および、マキシマの蛍光は同種ではないが、「穴」が含まれています、または図 6Aの中央のパネルのように、明るい。
PDMS 組織の棒状だが自己組織化の手順は図 4のとおりです。いくつかのプロトコルの手順は、タンパク質や脂質を再利用できるよう、繰り返される必要はありません。ようなパターン化した基板上に基板を洗浄して (プラズマ クリーニング) で hydrophilized、PDMS にサポートされている脂質二重層を形成、自己組織化の試金が 200 μ L のボリュームに設定されています。適切な膜を形成して、だが膜の自己組織化をチェックするには、部屋が作成されます。適切な膜形成、だがフォームが通常個々 の微細構造間、PDMS の表面に表面波を旅されているし、また自己組織化微細構造の下部に波を自由にすることができます、全体の上に移動します。膜で覆われた表面 (図 5 a)。バッファー除去後コンパートメント間表面を表示しない伝搬だがパターン (図 5 b)、それは完全に乾燥する必要があります。だがパターンは、まだ動いていますより多くのバッファーを削除する必要があります。タンパク質は、膜に覆われた PDMS、自己組織化は、上部インターフェイス (図 5) の空気に、棒状 microcompartments 今閉じ込められました。これらの条件の下で 2 つの蛋白質は図 5に示すように、極から極へ振動を実行できます。私の心の一部は、膜結合型では常に、またバッファー除去中にバッファー除去後の濃度は濃度を入力に匹敵します。この効果によりバッファー除去前にパターンの位置に依存するいると、濃度がまた同じ coverslip の個々 の微細構造によって異なります。シリコンのウエハ生産やシリコンウエハーから PDMS 成形は、不完全な微細構造分析 (図 6 b) に使用できませんで起因できます。さらに、バッファーのため除去組織は、プロセス中に乾く可能性があり、それ故に、さらなる分析 (図 6 b) から除外します。結果として 1 つのチャンバーに微細構造のほんの一部は目的のポール - 振動を示しています。微細構造タンパク質の動態を分析するには、kymograph は、全体構造 (図 5 e) 選択範囲を描画することによって取得できます。MinCDE はポールのポールから振動、ミンツと心はコンパートメント (図 5 階) の真ん中にコンパートメント極で最大濃度と最小濃度の時間平均濃度勾配が表示されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> 図 1: SDS-PAGE によるタンパク質精製の最終製品を表示します。彼の心 (33.3 kDa)、彼の eGFP-心 (60.1 kDa)、彼の mRuby3-心 (59.9 kDa)、彼鉱山 (13.9 kDa)、彼ミンツ (28.3 kDa) が順に表示されます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> 図 2: プロセス フロー図の個々 の手順を示すと非パターン化脂質二重膜 (手順 1-6) の自己組織化のプロトコルのタイミング。破線のボックスは、クリーニングでこれら 2 つのオプションのいずれかが使用できることを示します。円で印の付いた矢印を示すプロトコルを一時停止および後で再開できます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> 図 3: だがアッセイの共焦点顕微鏡によるイメージングします。A)正規分のスパイラル、どの波伝搬速度や強度プロット速度からの測定を得ることができます。使用濃度: 0.6 μ M (30 %egfp の心) を気 1.8 μ M 彼の地雷 (30% 彼-鉱山-Alexa647) B) A の地域の例を正規化輝度プロット マークC)全体アッセイ商工会議所の概要 (スケール バー: 1 mm、タンパク質濃度に等しい上記)。スパイラルと同様ターゲット パターンを観察することができますどちらの方向を回します。拡大領域は、UV 接着剤に波のパターンの異なる方法を示しています。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> 図 4: プロセス フロー図の個々 の手順を示すと棒状の微細構造 (手順 1-5、7、8) における自己組織化のプロトコルのタイミング。灰色の箱手順を示す製品が再利用できるプロトコルから人工脂質膜の非パターン化に。円で印の付いた矢印を示すプロトコルを一時停止および後で再開できます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> 図 5: 代表的な決算だがパターン PDMS microcompartments の棒状に形成します。A)だが進行表面波を形成する PDMS 表面の自己組織化 (1 μ M 心 (30 %egfp 心)、2 μ M 鉱山、2.5 mM ATP)。B) 、microcompartments 間の平面サーフェス上のタンパク質の自己組織化を停止バッファーは、微細構造の高さを下げたが後、。C) 1 つの棒状の microcompartment の回路図。D)バッファー除去後だがポール - 振動の代表的なイメージ。E) D に示すように強調表示された線に沿って振動の Kymograph)。F)画像と D に示すように時系列の平均蛍光強度の分布) microcompartment 極で極大値と極小区画の中央には、タンパク質のグラデーションを明確にします。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> 図 6: 否定的な実験結果の例です。A)過剰洗浄膜小胞の付着につながる最適な小胞の準備と脂質組成穴を蓄積されます。中央の 2 つのパネルは、問題となる表示分振動を観察する方法の両方の組み合わせを示します。膜が 0.05% で標識された Atto655 ドープ。(バーをスケール: 50 μ m)B)上部パネル: 乾燥してあまりにも多くのバッファー除去またはバッファーが時間の経過とともに蒸発するとき、microcompartments が発生することが。底板: ウエファーの生産や PDMS 成形中に不完全なコンパートメントを形作ることができます。(バーをスケール: 30 μ m)<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
1 の補足ファイル:彼の心のためのプラスミド マップ。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
2 の補足ファイル:彼の EGFP 心のプラスミド マップ。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
3 の補足ファイル:彼の mRuby3 心のプラスミド マップ。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
4 の補足ファイル:その鉱山のプラスミド マップ。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
5 の補足ファイル:彼ミンツのプラスミド マップ。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
6 の補足ファイル:Microcompartments のロッド型のシリコン基板の CAD ファイルです。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

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In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

我々 は開いた区域の脂質の心と私の自己組織化アッセイの in vitroのプロトコルを提供します。さらに、我々 は反応閉じ込めによる生体内での条件を模倣する脂質被覆 PDMS microcompartments のアッセイを囲む方法をについて説明します。

体外自己組織化人工脂質膜上のタンパク質パターンの再構成

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

in-vitro-reconstitution-self-organizing-protein-patterns-on-supported

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

12.1K ビュー.  Max Planck Institute of Biochemistry. 我々 は開いた区域の脂質の心と私の自己組織化アッセイの in vitroのプロトコルを提供します。さらに、我々 は反応閉じ込めによる生体内での条件を模倣する脂質被覆 PDMS microcompartments のアッセイを囲む方法をについて説明します。

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

生化学

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto the endosomal membrane. We have established a microscopy-based in vitro assay that reconstitutes the nucleation and polymerization of F-actin on early endosomal membranes in test tubes, thus rendering this complex series of reactions amenable to genetic and biochemical manipulations. Endosomal fractions are prepared by floatation in sucrose gradients from cells expressing the early endosomal protein GFP-RAB5. Cytosolic fractions are prepared from separate batches of cells. Both endosomal and cytosolic fractions can be stored frozen in liquid nitrogen, if needed. In the assay, the endosomal and cytosolic fractions are mixed, and the mixture is incubated at 37 &#176;C under appropriate conditions (e.g., ionic strength, reducing environment). At the desired time, the reaction mixture is fixed, and the F-actin is revealed with phalloidin. Actin nucleation and polymerization are then analyzed by fluorescence microscopy. Here, we report that this assay can be used to investigate the role of factors that are involved either in actin nucleation on the membrane, or in the subsequent elongation, branching, or crosslinking of F-actin filaments.

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Early endosome functions depend on F-actin polymerization. Here, we describe a microscopy-based in vitro assay that reconstitutes the nucleation and polymerization of F-actin on early endosomal membranes in test tubes, thus rendering this complex series of reactions amenable to biochemical and genetic manipulations.

体外初期エンドソームの F-アクチンの重合

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

洗剤無料補完充電プロテオリポソーム融合ペプチドを用いた脂質膜に膜タンパク質の超高速再構成。

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

脂質混合アッセイ用リポソームへの組換えショウジョウバエアラストシンの洗剤支援再構成

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

タンパク質-脂質相互作用を測定するためのマイクロスケール熱泳動の使用

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully utilized in the biochemical study of biological reactions using its nuclear extracts such as in vitro transcription and DNA replication. A significant hurdle for using C. elegans in biochemical studies is disrupting the nematode&#39;s thick outer cuticle without sacrificing the activity of the nuclear extract. While several methods are used to break the cuticle, such as Dounce homogenization or sonication, they often lead to protein instability. There are no established protocols for isolating active nuclear proteins from larva or adult C. elegans for in vitro reactions. Here, the protocol describes in detail the homogenization of larval stage 4 C. elegans using a Balch homogenizer. The Balch homogenizer uses pressure to slowly force the animals through a narrow gap breaking the cuticle in the process. The uniform design and precise machining of the Balch homogenizer allow for consistent grinding of animals between experiments. Fractionating the homogenate obtained from the Balch homogenizer yields functionally active nuclear extract that can be used in an in vitro method for assaying transcription activity of C. elegans.

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Here, we describe a detailed protocol for isolating active nuclear extract from larval stage 4 C. elegans and visualizing transcription activity in an in vitro system.

能動 カエノハブディティス・エレガンス 核抽出物の分離と インビトロ 転写のための再構成

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an enormous amount of spectra, setting challenges for quality control of the mass spectrometry spectra. To reduce the false positives, false discovery rate (FDR) quality control is necessary. Recently, we developed a software for FDR control of untargeted metabolome identification that is based on a Target-Decoy strategy named XY-Meta. Here, we demonstrated a complete analysis pipeline that integrates XY-Meta and metaX together. This protocol shows how to use XY-meta to generate a decoy database from an existing reference database and perform FDR control using the Target-Decoy strategy for large-scale metabolome identification on an open-access dataset. The differential analysis and metabolites annotation were performed after running metaX for metabolites peaks detection and quantitation. In order to help more researchers, we also developed a user-friendly cloud-based analysis platform for these analyses, without the need for bioinformatics skills or any computer languages.

We constructed an untargeted metabolomic workflow that integrated XY-Meta and metaX together. In this protocol, we displayed how to use XY-Meta to generate a decoy spectral library from open access spectra reference, and then performed FDR control and used the metaX to quantitate the metabolites after identifying the metabolomics spectra.

FDR制御ベースの非標的メタボロームにおける同定と定量化の統合ワークフロー

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...