Name: isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids
Uploaded: 2018-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
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FCP の浄化支援ありがとうラナ Adeel アフマド。教授クラウディア Büchel は役に立つ議論のため認められている原稿を読む。この作品は LD (DI1956-1/1) にドイツ語研究財団および LD へフェオドル ・ リュネン フェローシップのフンボルト財団によって支えられました。

著者が明らかに何もありません。

FCP リポソーム天然脂質組成と分光学的性質を調査するための便利なシンプルで再現性のあるツールを提供するの in vitro 。FCP リポソームの脂質環境は、自然の状態に近い実験結果を生じ、チラコイド膜内状況に似ています。
FCP アンテナのモデル システムとしてc. meneghinianaを使用していくつかの利点があります。それは比較的速い成長、他の珪藻のモデル種、 Thalassiosira pseudonana などと比較すると堅牢です。セルを破るそのままチラコイド錯体の高収率では、ビーズミルで比較的簡単。C. meneghinianaの主要なポイントは、最後年16,17,23,27,29,31 の生化学的および分光学的データの富 ,32,33,34。唯一の欠点は、という注釈付きのゲノムはまだ利用できない遺伝的操作が可能な35です。
FCPs は、最適な条件で栽培の文化から調製しました。したがって、収量、サブユニット組成と FCP の複合体の色素沈着は、ストレス条件、例えば、高い光27または栄養制限から用意されている場合に変更可能性があります。ビーズミル (1.1.3) の細胞分裂は、FCP 収量のため非常に重要で、顕微鏡による成長条件の変更のたびに監視する必要があります。空の遺骸 (シリカの殻) を勝つように、プラスチドは細胞からでリリースされている必要があります。次の重要なステップは、チラコイドの可溶化です。特定のストレス条件36の下に蓄積貯蔵脂質の量、膜可溶化効率を妨げます。したがって、洗剤の量は、過可溶化を避けるためにストレス条件下で試料を処理する前に調整する必要があります。~ 640 増加クロロフィル c 蛍光性の放出として表示されますこの問題 nm。さらへのエネルギー移動カロテノイド (500-550 nm) からクロロフィル、削減されます。これは、励起スペクトル (図 2、2 D) で見ることができます。特定のアプローチは、FCPb アンテナ複合体からイオン交換クロマトグラフィー27で FCPa を分けておくと便利かもしれません。
リポソームに FCP の転送は、次の重要なステップです。伝達効率、均一性リポソーム、イヌイットは、いくつかのパラメーターによって異なります。脂質ミセル準備及び押出成形ゆくサイズ リポソーム前駆体を提供します。この例では (2.1.3-2.1.4)、100 nm の細孔径のポリカーボネート膜 〜 50 のプロテオ リポソーム サイズ取得に使用された nm。FCP 脂質洗剤ミセルに追加量はタンパク質を定義します: リポソームの脂質比。したがって、リポソームあたり FCP の定義数が得られます。同様のアプローチでは、植物や緑の藻の LHC の複合体が自発的にクラスター化します。この事実は、時間分解蛍光、および単一分子分光22によって明らかにされた、さらに実験のための健全な基盤を提供します。
制御の透析は、リポソームに FCP の定款も欠かせません。複雑な疎水性の FCP の定款は精力的に支持されるが挿入の速度可能性があります集計の反応速度で競います。この事実はより顕著になるより疎水性およびより大きい複合体は。この例では小さい FCPa 三量体が大きい FCPb nonamer よりも高速に埋め込まれます。脂質ミセルが透析によって洗剤除去前に可溶化された FCP 錯体を十分に混合された適切な FCP 定款が必要です。ここでは、2.2.1 の混合時間を変えることができます。これは FCP の崩壊につながる可能性がありますので、混合温度を上昇することはお勧めしません。さらに、洗剤除去の「速度」は、重要です (2.2.4) 吸着剤の量によって調整することができます。リポソームの最終的なサイズが異なる場合があります。動的光散乱法と分析超遠心法電子顕微鏡は、リポソーム サイズ範囲37,38を決定する適切なメソッドです。このプロトコル自然チラコイド脂質と脂質ミセル押出のため 50 80 nm とクライオ電子顕微鏡による形状のようなほぼ球の前述の直径を見込んでいます。これらの結果は、緑色藻類 LHC22を組み込むと非常に同じ方法で得られました。このような小径のリポソームあたり 5 ~ 10 ° の強い表面の湾曲があるより大きいアンテナ複合体を曲げるし、monomerize させる可能性のある nm。このような状況は、藻類のグラナ余白の自然の曲率を模倣し、22を植物します。グラナの余白に比べると、チラコイドの主要な部分ではなくフラットに表示されます。したがって、ダメージを与えるなどの大きい複合体を検討しなければならない場合に、大きい径のリポソームの使用勧め。別の問題が発生: 複合体の向きは何ですか?FCPa、場合は方向が約 50% 右サイド アウト インサイド アウト 50% 低pH24レスポンスの測定から分かった.将来は、方法は、一方向複合体を強制する必要が。バクテリオロドプシン排出ポンプの他の研究で、ほぼすべての蛋白質は同じ方法 (右サイド アウト)39指向自発的に。
リポソームに K+を追加するときは、蛍光変化を引き起こす何の質問があります。いくつかの答えは想像がつくです。KCl 後バリノマイシンを追加する場合、K+濃度だけが責任を図 4に実験はそれ以上になる場合は蛍光の減少します。最近の研究では、K+濃度勾配が FCPa24の蛍光変化の責任概念のサポートを提供しました。同様の蛍光収率に影響を与えるかもしれないいくつかの他の要因。浸透または表面の電荷ダイナミクス効果24これら可能性があります。
合計するには、リポソームの FCP など、収穫に光のアンテナ複合体の調査の利点は、体内の条件に近い機能的なシステムを提供することです。しかし、コンポーネントの数はまだ小さい、実験結果の複雑さを減らします。光ストレス条件のシミュレーションと光防御機構の誘導が可能です。さらに、FCP 錯体の機能に関する特定の脂質種の役割を学ぶことができます。単一分子分光と他の時間分解分光法、クライオ電子顕微鏡の最近作られた進展に伴い増加するこの方法の可能性。これは光捕集システムのエネルギー伝達の研究を改善するために研究者を有効にします。これらのテクニックを組み合わせると、FCP 機能する脂質環境の貢献に関するデータ, 可溶化と集約された状態で FCP についての知識を補完することができます。

珪藻など光合成生物必要があります刻 々 変化する光条件に対処し、光合成効率を維持し、過剰な光によって写真酸化ダメージから保護する高度順化のメカニズムと対応します。光合成真核生物の主要な光保護プロセスは高エネルギー焼入れ (qE) の光ストレス条件1,2 の下で非光化学の焼入 (NPQ) への主要な貢献として発生する吸収光 ,3。光の収穫アンテナ複合体 (LHC) は、励起エネルギー移動経路の調節に関与しています。高い光に応答低pH葉緑体ルーメン、集光状態を急冷状態からアンテナ システム スイッチを誘発しました。このエネルギー散逸状態は、光酸化からのダメージを与える (PS) とチラコイド膜の他の複合体を保護します。光合成真核生物で qEは通常、2 つの要因1,2,3によって誘導します。要因の一つは、特殊な集光性タンパク質低pHに応答します。PsbS 蛋白質はより高い植物4qEを誘導します。LhcSRs5、PsbS 活動によって変調は、緑藻6で qEを誘発します。珪藻では、構造的に LHCSRs7,8,9,10に関連している Lhcx のような蛋白質を所有しています。
QEの 2 番目の要素は、アンテナのカロテノイドが de エポキシ化によって写真保護形式に変換、エポキシ化によって元に戻さキサントフィル サイクルです。植物や緑藻、ビオラキサンチンはゼアキサンチンに変換されます。珪藻の diadinoxanthin は NPQ11の程度と相関し、diatoxanthin に変換されます。珪藻集光アンテナはそれは進化植物と藻類の LHCs に関連するいくつかの特性を所有しています。光の写真の保護するために収穫からスイッチが非常に高速と NPQ 容量は植物12に比べて高い。これは珪藻が13海洋純一次生産量の 45% までに責任がある方法でさまざまな生態学的ニッチの非常に成功した 1 つの理由があります。したがって、光収穫系珪藻は光合成研究の興味深いオブジェクトです。
珪藻、峰 meneghinianaの中心の種は、チラコイド本質的な集光性色素にちなんで彼らのシステムを所有しているようなバインド - フコキサンチン、クロロフィル a と c、それゆえ FCP. 集光性タンパク質、FCPs などいくつかの膜層を構成するチラコイド膜システムに埋め込まれます。珪藻は、3 つのチラコイドのバンドを形作る。この複合体チラコイド膜で分子レベルで研究するが困難な状況です。さらに、多くのコンポーネントは、集光性 (上記参照) の規制に貢献します。したがって、さまざまな方法で複合体は、n-ドデシル-β-D-maltopyranoside (β-DDM)、膜可溶化が FCP 複合体をそのまま維持など、穏やかな洗剤を使用して膜から分離しました。可溶化された FCP を使用して分子内エネルギー転送14,15,16,17を調査する多くの分光学的研究を行った。しかし、この前者のアプローチは、エネルギー転送の規制が他のアンテナ複合体やダメージを与えると励起子相互作用を必要とするので、限られていた。したがって、これらの種類の研究が複合体間の相互作用が失われるためにを可溶化された錯体を実施できません。
アンテナ規制の重要な機能は、アンテナとチラコイド膜18のダメージを与える「分子クラウディング」です。以前は、単純なアプローチは、この効果をシミュレートするために実施された体外。アンテナ複合体のランダムな集約につながる洗剤が削除されました。いくつかの合理的なデータは、このアプローチの17,19によって得られた、洗剤除去体内の状況を反映していない、複合体は通常第三に対話していないのでいくつかの制限があります。構造体です。
リポソームを用いる元の制限のいくつかを克服します。第三構造は完全にそのままです。リポソーム膜はアンテナ複合体の準ネイティブ環境を提供します。膜は、リポソームの内部を外部環境から分離します。これらの手段では、リポソームは、輸送過程については同様のイオン ・ pH 勾配の研究の 2 つの反応区画を提供します。さらに、チラコイド膜の研究のため実験システムのパラメーターをより簡単に制御できます。リポソームは、既に光合成錯体を研究する優れたツールであること示されていた。過去の主要な焦点だった植物 LHC LHC II20に変更後の脂質組成の影響を調べた。他のアプローチで異なる LHC II 間の蛋白質蛋白質の相互作用は調査21だったまた、緑の藻でいくつかの研究を行った LHC22の間自発的なクラスタ リングについて説明します。、水生生物の生態系の珪藻の重要性を考慮した珪藻のアンテナ複合体に比較的少数の研究を行った。2 つの研究は、FCP アンテナ23と FCP の応答性の電気化学的勾配24にクラスタ リングが示した中心峰 meneghinianaのアンテナ複合体を検討しました。したがって、リポソーム、珪藻アンテナ相互作用とほぼネイティブ条件で規制を勉強する優れたツールです。リポソーム、脂質、リポソーム サイズ、密度などの多くの条件からの汎用性と周囲の水相を制御できます。さらに、メソッドのサンプルの少量が必要です。実験システムは、堅牢かつ再現性が高い。リポソームの区分により pH を勉強して、アンテナ複合体の調節に重要なイオン勾配要因。
ここでは、 c. meneghinianaから FCP アンテナ複合体の単離とその自然なチラコイド脂質リポソームについて述べる。また、可溶化された FCP の分光特性評価の模範的なデータを提供し、リポソームの FCP との比較します。メソッドは、知識と Gundermann と Büchel 2012 年23ナタリら2016年22アフマドと Dietzel 2017 年の24の改善から得られる標準化されたプロトコルをまとめたものです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg"> 図 1: ワークフローの模式図。( 1) 細胞の成長、混乱およびショ糖密度勾配; 次の FCP 分離チラコイド分離を説明する段落 1 を参照C. m.-峰 meneghiniana細胞。(2) 2 と octylglycoside (OG) 脂質界面活性剤ミセルの創造、自然チラコイド脂質混合物 (MGDG、DGDG SQDG) の調製は項で説明します。定義された脂質ミセルの大きさは、定義された孔径の膜を用いた押出によって実現されます。FCP と脂質ミセルが定義済みの脂質で統一: タンパク質比や OG と β DDM の洗剤は削除を介して制御される透析 FCP プロテオリポソームを形成します。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>500 ml centrifuge vials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>high speed centrifuge</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill VI 2</td><td>Edmund-B&amp;uuml;hler (edmund-buehler.de)</td><td></td><td>newer version: Vibrogen-Zellm&amp;uuml;hle Vl 6</td></tr><tr><td>Silibeads S 400 &amp;micro;m</td><td>Sigmund-Lindner.com</td><td>5223-7</td><td></td></tr><tr><td>Silibeads S 1,-1,3 mm</td><td>Sigmund-Lindner.com</td><td>4504</td><td></td></tr><tr><td>VitraPOR filter funnel - por1</td><td>ROBU GmbH</td><td>21121</td><td></td></tr><tr><td>polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865</td><td>Beranek Laborger&amp;auml;te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>314348</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Discovery 90SE</td><td>Sorvall</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>rotor T 865</td><td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td><td>51411</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Cell Counter Chamber (improved)</td><td>Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Mikroskop Primostar (7)</td><td>Optik-Pro (optik-pro.de)</td><td>51428</td><td></td></tr><tr><td>optical glass cuvettes (6040-OG)</td><td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td><td>&quot;6040-10-10&quot;</td><td></td></tr><tr><td>V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)</td><td>Jasco (jasco.de)</td><td>V-630</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&amp;beta;-D-Maltopyranoside</td><td>ANATRACE (anatrace.com)</td><td>D310LA</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629</td><td>Beranek Laborger&amp;auml;te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>344061</td><td></td></tr><tr><td>rotor AH629-17-mL</td><td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td><td>54285</td><td></td></tr><tr><td>Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff</td><td>Millipore (merckmillipore.com)</td><td>4307</td><td></td></tr><tr><td>Biometra Minigel-Twin</td><td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td><td>846-010-100</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td><td>1610449</td><td></td></tr><tr><td>libre office spread sheet</td><td>The document foundation</td><td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td><td></td></tr><tr><td>special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)</td><td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td><td>101-10-20</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)</td><td>Jasco (jasco.de)</td><td>FP-6500</td><td></td></tr><tr><td>SDS-loading buffer Roti-Load</td><td>ROTH (carlroth.com)</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>n-octyl &amp;beta;-D-glucopyranoside</td><td>ANATRACE (anatrace.com)</td><td>O311</td><td></td></tr><tr><td>Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1300</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1310</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1230</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>37-0150</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylcholine</td><td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td><td>P3782 SIGMA</td><td>make stock solution in chloroform</td></tr><tr><td>sonicator bath S-50TH</td><td>Sonicor (getmedonline.com</td><td>SONICOR-S-50TH</td><td></td></tr><tr><td>mini-Extruder</td><td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Nuleopore polycarbonate membrane</td><td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td><td>610005</td><td></td></tr><tr><td>dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff</td><td>ROTH (carlroth.com)</td><td>0653.1</td><td>boil in destilled water before use</td></tr><tr><td>Biobeads SM2 Adsorbent</td><td>Biorad (Bio-rad.com)</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td><td>F4375</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4</td><td>Beranek Laborger&amp;auml;te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>252150</td><td></td></tr><tr><td>rotor TFT 80.4</td><td>Millipore (merckmillipore.com)</td><td>54356</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;material listed in order of appearance &lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals.&lt;br /&gt;Standard lab material and substances are not listed.&lt;/em&gt;</td></tr></tbody></table>

isolating and incorporating light-harvesting antennas from diatom cyclotella meneghiniana in liposomes with thylakoid lipids

強く、植物、藻類、珪藻類の光合成能力は、葉緑体のチラコイド膜での転送プロセスを光収穫とエネルギーの高速かつ効率的な規制に依存します。集光珪藻のアンテナと呼ばれるフコキサンチン クロロフィル a/c 結合タンパク質 (FCP) が光の吸収に必要なと光合成反応に効率的に転送センター写真-過剰な光からの保護も同様。これら 2 つの関数の間のスイッチは、研究の長年問題です。これらの研究の多くは FCP で洗剤のミセルで行われています。相互作用の研究、FCP 錯体の非特異的凝集につながった、洗剤を削除されています。このアプローチで成果物と関連する生理学的データを区別するは難しいです。したがって、FCP や他の膜に埋もれた集光複合体についての有益な情報は、ネイティブ脂質環境に埋め込まれている場合、タンパク質間相互作用、エネルギー移動、他の分光学的特徴を研究することによって取得できます。主な利点は、リポソームが定義されているサイズと FCP のクラスタ リングの範囲を制御する定義された脂質・ タンパク質比ことです。さらに、集光性体内を調節する pH とイオン組成の変化は、簡単にシミュレートできます。チラコイド膜と比較してリポソームより均一なより少なく複雑な取得、分光学的データを理解して簡単に。プロトコルでは、FCP 分離精製、リポソーム調製と FCP の天然脂質リポソームへの取り込みの手順について説明します。一般的なアプリケーションからの結果が与えられ、議論。

プロトコルでは、峰 meneghiniana合計 FCP 画分の分離とネイティブ脂質リポソームに定款をについて説明します。チラコイドの分離は、再現性が高いが、チラコイド収量が変更します。結果が全ての顔料の 50% 以上が 1.1.4 のステップでリカバリする場合できます。80% 以上が最適です。
チラコイドの可溶化は、重要なステップです。1.2.2 のステップの後の上清に顔料のほとんどが含まれている場合、よく可溶化された膜が得られます。ダメージを与えるから FCP の分離はクリアブラウン (FCP) と緑 (PS) バンドが区別できる (図 2 a) 場合は良いです。グラデーションの上に顕著な黄色の割合は過可溶化のための色素の損失のための徴候です。すべての準備での色素の損失が発生します。クロロフィルに転送する機能、エネルギーの限りある程度許容範囲だは (図 2、2 D) 影響を受けません。また、FCP の濃縮のステップ (1.2.4) を可能性があります可溶化および色素併用洗剤濃縮損さらに誘発します。正規化された吸光度スペクトルの違いは、カロテノイドが吸収する 500 550 nm 間の分光地域でしばしば発生する色素の損失 (図 2 b) を示しています。色素の損失がまだ機能複合体である場合できます。これは、発光スペクトルと励起スペクトル (図 2、2 D) に大きな違いが発生しないことを意味します。発光スペクトルのクロロフィル c は優先的に 465 nm と転送で興奮しているクロロフィル a が励起エネルギー ~ 675 で発する nm。クロロフィル c 出力 ~ 640 でクロロフィルをクロロフィル c エネルギー伝達が邪魔の場合 nm。励起スペクトルのエネルギーをクロロフィルに転送、370-600 nm の励起波長を変更することによって監視されます。370 440 nm のスペクトル範囲で主にクロロフィル、興奮しています。励起約 465 nm クロロフィル c を支持します。範囲 > 500 nm のカロテノイド、主に fucoxanthins で興奮しています。エネルギー伝送は、クロロフィル c やカロチノイド、クロロフィルに以下に蛍光を貢献する場合に影響を受けます。したがって、蛍光収率が低下クロロフィルに関してこれらの分光地域の 370 440 nm 励起します。
このサンプルの目的の純度は、研究の目的によって異なります。たとえば、FCP から分光計測用ダメージを与えるに別の非色素タンパク質が少なければそれだけ測定中に不可欠です。ここでは、95% の純度は十分に高い (図 2 e)。排他的に、質量分析のアプローチの FCP のサブユニットが銀染色ゲルの表示とされます。
リポソーム製剤の品質管理は難しいを監視し、プロトコル (2.2.5、図 3 a) の最後の最後で見ることができるのみ。自分の色が茶色から判明した場合、FCP 錯体が破壊されるオリーブ グリーンに。良い結果は、茶色のリポソーム分数が収集です。回収対集約されたペレットは最適なリポソームの割合 > 70%。リポソームの FCP の定款は再びマイナーな色素の損失に可能性があります。正規化された吸光度スペクトル設立前後の比較は、顔料 (図 3 b、3 C) を失われた場合に見られています。FCP リポソームのいくつかの吸光ピーク表示より広いと赤色の波長域の吸収 (~ 670 nm - いわゆる Qyバンド) クロロフィルことの少し赤いシフトします。これは、リポソームの FCP のクラスタ リングによって発生します。クラスターの FCP の励起子相互作用によるリポソームの FCP から生じる蛍光の収率を大幅に軽減するクロロフィル (図 3 D、 cf。 ディスカッション)。
リポソームと典型的な実験では、リポソームの 2 つの反応区画pHまたは電気化学的勾配を可能にする脂質二分子膜で区切られました。FCP の蛍光収率にカリウム イオン勾配の影響のテスト例では、(図 4 a)。蛍光の収率は、標準的なバッファーの存在下で測定しました。KCl が追加された場合、蛍光は 30% によって落ちる。K+のグラデーションは、FCP 蛍光を初期レベル (図 4 b) に復元するカリウム特定イオノフォア バリノマイシンによって解放されました。蛍光性のこれらの変更は、FCP 錯体がカリウム イオン濃度勾配24 in vivoに応答する仮説を裏付けます。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig4.jpg"> 図 4: 電気化学的勾配への応答の FCP 蛍光の変化を示す FCP リポソームと典型的な実験による KCl (A) 。実験手法: 1。 透析バッファーで FCP クロロフィル蛍光。2. 20 mM 電気化学的勾配を誘導する KCl の追加。3 K+選択性イオノフォア バリノマイシン (4 μ M) で勾配の緩和。(B) FCP のドロップ蛍光 (675 nm) K+グラデーション (青) と同じ蛍光収率の前に (オレンジ) による修復 (グレー) 勾配の緩和に対応。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58017/58017fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>バッファー/混合</td>
			<td>組成</td>
		</tr>
<tr>
<td>細胞増殖・</td>
			<td>よると人工海水</td>
			<td>86 mM の NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>チラコイドの準備</td>
			<td>Provasoli、1957 (ASP)25
</td>
			<td>21 mM KCl</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>4 mM トリス</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>8.1 mM MgSO4
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>11.8 mM ナノ3
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>0.58 mM K3HPO4
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>0.16 mM H3ボー3
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM シリカ</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>pH 7.7 (H24)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>オートクレーブ</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>滅菌を追加: 2.72 mM CaCl2
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>滅菌を追加: 0.012 mM した FeCl3
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>滅菌を追加: 0.092 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>滅菌を追加: 0.02 mM MnCl2
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>滅菌を追加: 0.002 mM ZnCl2
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>滅菌を追加: 50 pM CoCl2
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>滅菌を追加: 25 pM ナ2MoO4
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>滅菌を追加: 22:05 CuCl2
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>均質化バッファー</td>
			<td>10 mM MES</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM KCl</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M ソルビトール</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>pH 6.5 (KOH)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>洗浄バッファー</td>
			<td>10 mM MES</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM KCl</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>pH 6.5 (KOH)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ガラス ビーズ混合物</td>
			<td>75 %1 mm ビーズ</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>25 %0.4 mm ビーズ</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>アセトン</td>
			<td>90% (v/v) H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>液体窒素</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FCP の浄化</td>
			<td>n-ドデシル-β-D-Maltopyranoside</td>
			<td>10% (w/v) H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>バッファー B1</td>
			<td>25 mM トリス</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM KCl</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>pH 7.4 (HCl)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>B1a をバッファー = B1 + b DDM</td>
			<td>0.03% (w/v) 最終</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ショ糖勾配</td>
			<td>19% のショ糖 (w/v) B1a</td>
		</tr>
<tr>
<td>リポソームの調製</td>
			<td>脂質は、補足表 1 を参照してください。</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>N2ガス</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>n-オクチル β-d-グルコピラノシド (OG)</td>
			<td>B1a の 10% (w/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>トリシン バッファー</td>
			<td>20 mM の pH 7.5</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>透析バッファー (DB) x 4</td>
			<td>80 mM トリシン pH7.5</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM MgCl2
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>0.04% (w/v) ナン3
</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: バッファー、原液及び混合 FCP の準備およびリポソームに組み込むのためのリスト。
補足表 1: 脂質およびクロロフィル比率計算のための例です。脂質/クロロフィル 12 の比率は、図 1と図 3の例で使用されます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58017/Supplemental_Table_1_lipid_mix_calculation.xlsx">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

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Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

フコキサンチン クロロフィル a/c 結合タンパク質 (FCP) 珪藻を分離し、天然の脂質組成のイオン組成変化の励起エネルギー移動を研究するリポソームにそれらを組み込むのためのプロトコルを紹介します。

分離してチラコイド脂質リポソームの珪藻峰 Meneghinianaから光捕集アンテナを組み込む

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

isolating-incorporating-light-harvesting-antennas-from-diatom

Nanyang Technological University

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Cell Biology

Biochemistry

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Unit 1

Chloroplasts and Photosynthesis

SCIENTISTS IN ACTION

7.7K ビュー.  Goethe University. フコキサンチン クロロフィル a/c 結合タンパク質 (FCP) 珪藻を分離し、天然の脂質組成のイオン組成変化の励起エネルギー移動を研究するリポソームにそれらを組み込むのためのプロトコルを紹介します。

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

生化学

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within the chloroplasts, the thylakoid membrane system houses all the photosynthetic pigments, reaction center complexes, and most of the electron carriers, and is responsible for light-dependent ATP synthesis. Over 90% of chloroplast proteins are encoded in the nucleus, translated in the cytosol, and subsequently imported into the chloroplast. Further protein transport into or across the thylakoid membrane utilizes one of four translocation pathways. Here, we describe a high-yield method for isolation of transport-competent thylakoids from peas (Pisum sativum), along with transport assays through the three energy-dependent cpTat, cpSec1, and cpSRP-mediated pathways. These methods enable experiments relating to thylakoid protein localization, transport energetics, and the mechanisms of protein translocation across biological membranes.

We present protocols herein for high-yield isolation of physiologically active thylakoids and protein transport assays for the chloroplast twin arginine translocation (cpTat), secretory (cpSec1), and signal recognition particle (cpSRP) pathways.

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

生物工学

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a large membrane protein complex coordinating hundreds of light harvesting and electron transport factors and is the most efficient light harvesting system found in nature. Photons absorbed by the four LHCA antenna proteins that make up LHCI are transferred through excitonic interaction to the PSI core reaction center and are used to facilitate light-driven charge separation across the thylakoid membrane, providing reducing power and energy for carbon fixation in photoautotrophic organisms. The high quantum efficiency of PSI makes this complex an excellent model to study light-driven energy transfer. In this protocol, plant tissue is mechanically homogenized, and the chloroplasts are separated from the bulk cellular debris by filtration and centrifugation. The isolated chloroplasts are then osmotically lysed, and the thylakoid membranes are recovered via centrifugation and solubilized using the detergent n-dodecyl-beta-maltoside. The solubilized material is loaded onto an anion exchange column to collect most of the chlorophyll-containing complexes. Larger complexes are precipitated from the solution, resuspended in a small volume, and loaded on sucrose gradients to separate the major chlorophyll-containing complexes. The resulting sucrose gradient fractions are characterized to identify the band of interest containing PSI-LHCI. This protocol is highly similar to the protocol used in the crystallization of plant PSI-LHCI with some simplifications and relies on methods developed over the years in the lab of Nathan Nelson.

This protocol describes the isolation of Photosystem I (PSI) - Light Harvesting Complex I (LHCI) from plant tissues. PSI along with PSII is responsible for the conversion of light to chemical energy in oxygenic photoautotrophs and has a quantum efficiency of ~1, making it a target for studying light-driven energy transfer.

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a ...

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient association of pore-forming and auxiliary subunits, lateral diffusion, and clustering with other proteins. However, the relationship between lateral diffusion and function is poorly understood. To approach this problem, we describe how lateral mobility and activity of individual channels in supported lipid membranes can be monitored and correlated using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Membranes are fabricated on an ultrathin hydrogel substrate using the droplet interface bilayer (DIB) technique. Compared to other types of model membranes, these membranes have the advantage of being mechanically robust and suitable for highly sensitive analytical techniques. This protocol measures Ca2+ ion flux through single channels by observing the fluorescence emission of a Ca2+-sensitive dye in close proximity to the membrane. In contrast to classical single-molecule tracking approaches, no fluorescent fusion proteins or labels, which can interfere with lateral movement and function in the membrane, are required. Possible changes in ion flux associated with conformational changes of the protein are only due to protein lateral motion in the membrane. Representative results are shown using the mitochondrial protein translocation channel TOM-CC and the bacterial channel OmpF. In contrast to OmpF, the gating of TOM-CC is very sensitive to molecular confinement and the nature of lateral diffusion. Hence, supported droplet-interface bilayers are a powerful tool to characterize the link between lateral diffusion and the function of ion channels.

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol describes how to use TIRF microscopy to track individual ion channels and determine their activity in supported lipid membranes, thereby defining the interplay between lateral membrane movement and channel function. It describes how to prepare the membranes, record the data, and analyze the results.

全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語)

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのSNARE媒介性の融合

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

神経科学

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

大型単層小胞とBcl-2ファミリーの機能を調べる

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

生物学

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are simplistic cellular mimics composed of an aqueous interior surrounded by a lipid bilayer; they are valuable in designing synthetic cells and understanding the fundamentals of biological cells in an in vitro fashion and are important for applied sciences, such as cargo delivery for therapeutic applications. This article describes a detailed working protocol for an on-chip microfluidic technique, octanol-assisted liposome assembly (OLA), to produce monodispersed, micron-sized, biocompatible liposomes. OLA functions similarly to bubble blowing, where an inner aqueous (IA) phase and a surrounding lipid-carrying 1-octanol phase are pinched off by surfactant-containing outer fluid streams. This readily generates double-emulsion droplets with protruding octanol pockets. As the lipid bilayer assembles at the droplet interface, the pocket spontaneously detaches to give rise to a unilamellar liposome that is ready for further manipulation and experimentation. OLA provides several advantages, such as steady liposome generation (&#62;10 Hz), efficient encapsulation of biomaterials, and monodispersed liposome populations, and requires very small sample volumes (~50 &#181;L), which can be crucial when working with precious biologicals. The study includes details on microfabrication, soft-lithography, and surface passivation, which are needed to establish OLA technology in the lab. A proof-of-principle synthetic biology application is also shown by inducing the formation of biomolecular condensates inside the liposomes via transmembrane proton flux. It is anticipated that this accompanying video protocol will facilitate the readers to establish and troubleshoot OLA in their labs.

The present protocol describes octanol-assisted liposome assembly (OLA), a microfluidic technique to generate biocompatible liposomes. OLA produces monodispersed, micron-sized liposomes with efficient encapsulation, allowing immediate on-chip experimentation. This protocol is anticipated to be particularly suitable for synthetic biology and synthetic cell research.

バイオエンジニアリングのためのオンチップオクタノール支援リポソームアセンブリ

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are ...

脂質膜上の光制御可逆的タンパク質パターニング

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

著者スポットライト:人工細胞システムにおける可逆的パターニングのための写真切り替え可能なタンパク質リクルートメント

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

分離してチラコイド脂質リポソームの珪藻峰 Meneghinianaから光捕集アンテナを組み込む

要約

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足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語)

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層を持つシングルプロテオリポソームのSNARE媒介性の融合

大型単層小胞とBcl-2ファミリーの機能を調べる

バイオエンジニアリングのためのオンチップオクタノール支援リポソームアセンブリ

モデルメンブレンにおける動的光誘起タンパク質パターン

分離してチラコイド脂質リポソームの珪藻峰 Meneghinianaから光捕集アンテナを組み込む

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足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語)

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのSNARE媒介性の融合

大型単層小胞とBcl-2ファミリーの機能を調べる

バイオエンジニアリングのためのオンチップオクタノール支援リポソームアセンブリ

モデルメンブレンにおける動的光誘起タンパク質パターン

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層を持つシングルプロテオリポソームのSNARE媒介性の融合