著者は、貴重なコメントや原稿の徹底的な読み込みのため S Y チェ (大学校) をありがとうございます。この作品は、忠南大学校の研究基金によって支えられました。

1. 遺伝子 Subcloning
<ol><li>PEUI(+) の MCS の認識、適切な制限の酵素のサイト (またはサイト) を選択し、目的の方向 (図 1) の興味の遺伝子を subclone します。 注: EGFPまたはフラグ エピトープ タグ アンキリンリピート ドメイン 13A (ANKRD13A) 遺伝子のシーケンスや結紮-独立したクローニング法19T4 DNA ポリメラーゼを用いた pEUI(+) ベクターの EcoRI サイトだった subcloned。</li>
	<li>EcoRI で 37 ° C で 1 時間の pEUI(+) をリニア化します。ミックス 50 ng/μ L の 40 ng/μ L の PCR 増幅EGFPまたはANKRD13Aと pEUI(+) を線形し、T4 DNA ポリメラーゼ (1 U) (RT) 前に室温で 10 分間氷の上潜伏 1 分と追加 10 μ L の 100 μ L に直接反応混合物の反応次の変換の DH10B 有能なセルを実験します。 注: pEUI(+) (図 1 b) の MCS に追加されましたいくつかの制限酵素認識部位が、お勧めします EcoRI サイトにターゲット遺伝子を subcloning 結紮独立クローン技術19,20を使用しています。</li>
	<li>シーケンスによる挿入を確認し、トランスフェクションに適した DNA 精製キットを使用して DNA を浄化します。</li>
</ol>2. トランスフェクションと Teb の治療
<ol><li>5-10% ウシ胎児血清 (FBS) と抗生物質 (100 U/mL ペニシリン, 100 μ g/mL ストレプトマイシン) 補われるダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) の 5 mL の新鮮な継代の HEK293 細胞を含む 4 細胞培養皿 (直径 60 mm) を準備します。以下、「培」または単に「培」は、FBS と抗生物質 DMEM を表します。37 ° C で HEK293 細胞を維持します。</li>
	<li>1 μ g の精製 DNA をトランスフェクション試薬の 3 μ L を使用して 50-60% の密度を HEK293 細胞に transfect します。トランスフェクション試薬を加える (FBS、抗生物質なし DMEM) の希釈液 200 μ L の DNA を含んでいます。室温で 30 分間反応混合物の培養後 HEK 293 細胞培養皿上に混合物を追加します。、Transfection のため 2 つの料理を使用し、他の 2 つのコントロールとして放置のまま。</li>
	<li>トランスフェクションの 12-24 時間後に、トランスフェクションのサンプルの 1 つと非 transfected コントロールの 1 つに Teb (最終濃度 0.2 - 10 µmol) を追加します。未処理の実験的コントロールとその他の 2 つのサンプルをまま。 注: Teb 原液 (ジメチルスルホキシドに溶解し 50 mM) は、細胞培養液、DMEM、またはリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 培養細胞実験的パラメーターに応じて追加する前に適切な濃度で希釈できます。しかし、水溶液中における溶解 Teb の低度のため媒体の Teb の高濃度マスター ミックスの準備を避ける代わりに、完全な細胞培養液を必要な濃度で新鮮な培 Teb に置き換えます。</li>
	<li>37 ° C で 12 48 h の Teb 処理と未処理細胞を養う</li>
	<li>挿入EGFPを使用して蛍光顕微鏡 (図 2) の EGFP 発現を分析します。そうでなければ、免疫ブロット分析法のための細胞を収穫します。<ol>
<li>免疫ブロット分析法の氷冷 PBS で 2 回細胞を洗い、それから細胞スクレーパーを使用してそれらをこすり。</li>
		<li>セルを重ね、18-25 ° C (RT) で 2 分間 21,000 × g で 15 mL の円錐管に収穫を回転させます。</li>
		<li>PBS を完全に破棄した後の冷えた哺乳類タンパク質抽出試薬 0.5 mL を追加 (M-ごと)、プロテアーゼ阻害剤 (プロテアーゼ阻害剤のカクテル 100 の 5 μ L) 場合は、60 mm ディッシュに培養される細胞ペレットと一緒に。</li>
		<li>再ピペッティングのいくつかのラウンドでセルを中断し、18-25 ° C (RT) で 15 分の浮遊細胞をインキュベーションしています。</li>
		<li>細胞の 4 ° C で 10 分間 21,000 x g でライセートをスピンします。</li>
		<li>新鮮な 1.5 mL 遠心チューブに水溶液上澄みを転送します。</li>
		<li>イムノブロット、次の標準的なプロトコルに適切な抗体培養上清を分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. pEUI(+) 遺伝子スイッチのゲノムの統合と安定した HEK293 細胞ラインの生成
<ol><li>トランスフェクション試薬の 15-30 μ L を使用して 90 mm 直径細胞培養皿の 50-60% の合流は、HEK293 細胞に遺伝子の精製 pEUI(+) の 5-10 μ g を transfect します。トランスフェクション試薬を加える (FBS、抗生物質なし DMEM) の希釈液 500 μ L の DNA を含んでいます。室温で 30 分間反応混合物の培養後 HEK 293 細胞培養皿上に混合物を追加します。</li>
	<li>後、成長し、37 ° C で 24-48 時間 (ピューロマイシン) なし非選択性培下ピューロマイシン耐性遺伝子産物を表現する形質転換細胞を許可します。</li>
	<li>新鮮で培養皿からセルを切り離して考えます。培養液を破棄した後に予め温めておいた PBS (37 ° C) の形質転換細胞をすすぎ、0.25% トリプシン/エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 1 つの mL を追加、37 ° C で 1 分間インキュベート予め温めておいた培 (10 mL、37 ° C) を追加することによってトリプシン/EDTA を焼入れ後 18-25 ° C で 2 分間 21,000 × g で 15 mL の円錐管に遠心分離によって続いて細胞スクレーパーを使用してセルを収穫します。</li>
	<li>予め温めておいた培 (37 ° C) および 90 mm 新鮮な細胞培養皿に転送セルの 10 mL の 50 mL で、形質転換細胞は再中止します。ピューロマイシン治療前に、の 50-60% の confluency まで 37 ° C で細胞の培養 (一般に、これは約 24-48 時間かかる)。</li>
	<li>37 ° c、3-4 週間 3 μ G/ml ピューロマイシンを添加した細胞培養液で形質転換細胞を養います。選考期間中、選択圧を維持するために 2 〜 3 日ごとピューロマイシン (3 μ g/mL) を含む培養液を変更します。セルになると完全に合流、ピューロマイシンを含む培養液中で、3.3 3.4 の手順を次に、それらを分割します。必要でない場合は、培養液の残りのセルを破棄します。 注: ピューロマイシン選択条件は、特定の細胞型の実験確立する必要があります。細胞培養; ピューロマイシンの 3 μ g/mL を使いました。これは非 transfected HEK293 細胞死を誘発するのに十分だった。</li>
	<li>クローニング シリンダーを使用して個々 のコロニーから細胞を収穫し、製造元の指示に従ってください。<ol>
<li>細胞培養液を破棄します。予め温めておいた (37 ° C) 浮遊細胞を削除する PBS で 2 回プレートをすすいでください。</li>
		<li>滅菌鉗子を使用すると、個々 のコロニーにクローニング シリンダーを設定します。</li>
		<li>各シリンダーに 0.35% トリプシン/EDTA の 0.2 mL を追加します。</li>
		<li>セルがデタッチされると、シリンダーに予め温めておいた (37 ° C) 培養液を数滴を追加するまでは、1 分の 37 ° C で皿を孵化させなさい。</li>
		<li>それぞれのシリンダーから培養液 2 mL と 1 μ G/ml の各ウェルにピューロマイシン 6 ウェル プレートの個々 の井戸にセルを転送します。 注: 細胞がコンフルエントになると、文化をスケール アップ。クローンが設けることができるようになりました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ピューロマイシンの 1 μ G/ml を添加した細胞培養液中の個々 のクローンを維持します。</li>
	<li>イムノブロットと遺伝子の発現レベルを分析することによって 24 時間テストの Teb 治療 (最終濃度、10 μ M) への感度、Teb にクローンの応答をテストすることによって、個々 のコロニーを検証します。目的のクローン (またはその複製) を選択します。遺伝子の誘導レベルを分析する前に Teb 扱われ、37 ° C で 12-48 時間培養培地で未処理のサンプルを栽培してください。2.5.1 - 2.5.7 の手順」の手順に従って、免疫ブロットを遺伝子の発現レベルを測定できます。</li>
</ol>4. Teb の枯渇
<ol><li>Teb 自由な媒体 Teb 含む細胞培養液に置き換えて Teb 刺激を癒します。 注: 最初新しい培養皿上に細胞を再シードすることがなく成長媒体を交換することをお勧めします。残留 Teb はプラスチックの皿に固執する表示され、遺伝子の強力な背景表現を引き出すでしょう。新しい培養プレート上のセルを再シード、前に数回培地または PBS で収穫された細胞をすすいでください。<ol>
<li>新鮮で培養皿からセルを切り離して考えます。培地を含む Teb を破棄した後リンスの Teb 刺激細胞に予め温めておいた PBS (37 ° C) で 2 回、0.25% トリプシン/EDTA の 1 つの mL を追加、37 ° C で 1 分間インキュベート予め温めておいた Teb 無料培養液 (10 mL、37 ° C) を追加することによってトリプシン/EDTA を焼入れ後 18-25 ° C で 2 分間 21,000 × g で 15 mL の円錐管に遠心分離によって続いて細胞スクレーパーを使用してセルを収穫します。</li>
		<li>予め温めておいた Teb 無料培 (37 ° C) と 3 つの 60 mm 新鮮な細胞培養皿に転送セルの 5 mL の 50 mL のセルを再停止します。それぞれ 24、48、および 72 h の 37 ° C での細胞を培養します。</li>
		<li>異なる時点で細胞を収穫し、免疫ブロットを使用して遺伝子の発現レベルを測定します。 注意: これらの実験条件下での遺伝子発現の検出不可能な Teb 自由な文化媒体 (図 3) のセルの約 3 日後文化なりました。イムノブロット 2.5.7 2.5.1 - の手順に従って導入遺伝子の発現レベルを測定できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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我々 は本レポートに関する利害の対立があります。

バイナリの遺伝子発現のスイッチを使用しての主な欠点は同時に目的セルに 2 つの独立したプラスミド (ドライバーとエフェクター) を提供する必要があります。これはプラスミドと誘導1,2,3スイッチの矛盾した応答の結果の不平等な配分につながることができます。2 ベクター システムの別の欠点は、抗生物質の選択の 2 つのラウンドの最小が有望な細胞を識別するために必要なことです。したがって、生物学の研究で使用する 1 つのユニットを構成する遺伝子誘導カセットが求められてきました。PEUI(+) 特異遺伝子発現のスイッチは、transgene 刺激に必要なすべての規制ユニット装備 1 つのベクトルに含まれます。したがって、遺伝子、pEUI(+) で subcloned 誘導レベルはトランスフェクション実験と化学インデューサの投与量でトランスフェクションする DNA 量に依存しています。さらに、我々 はさらにANKRD13A遺伝子15の単一コピーを含む安定したセルラインを生成することによって pEUI(+) ベクトルの使用をテスト.確立されたセルラインの Teb 治療 (図 3) に高感受性を示した。まとめて高感度、可逆性、および低水漏れしたため15、発現レベルのばらつきと pEUI(+) にもターゲット遺伝子発現を操作するための貴重な分子ツールを作る。
誘引可能な遺伝子の様々 なシステム間で我々 は GvEcR 依存性遺伝子誘導カセットを選択します。GvEcR は他のシステムに比べていくつかの利点: まず、化学誘導 (Teb を含む) として使用されるいくつかの脱皮ホルモン類縁体の脂溶性の性質が細胞膜21; の効率的な浸透のために有利な第二に、脊椎動物における EcR 嗅覚がないの関数が核内受容体21,22; を内生表現エクジステロイド アゴニストには影響しませんので第三に、エクジステロイドは脊椎動物に無害と循環システム体内21,23; から急速にクリアそして第四に、多数ホルモンアゴニスト小さい分子の最適なサイズを選択することによって、これまでに開発されているので研究者は望ましくない合併症13,22,24を避けることができます。Teb に高い感度を示していますが、pEUI(+)、その他エクジステロイド アゴニストに pEUI(+) の応答のテスト貴重な証明するかもしれない。Methoxyfenozide などの非ステロイド系の EcR アゴニストの存在 Teb24 pEUI(+) の適用範囲を広げる可能性がありますよりも水に溶けやすいことをであります。PEUI(+) の発現はテトにシステム15よりも比較的弱いが、遺伝子の誘導のレベルは VP16 の転写活性化ドメイン (データは示されていない) の複数のコピーの付加によって増強される可能性が。最近の遺伝子治療の応用が細胞や遺伝病25,26,27によりそれぞれの機能遺伝子産物を持たない組織にターゲット遺伝子の安全な配達に焦点を当てた。ただし、構成組織固有またはウイルスのプロモーターの制御下で規制のない遺伝子はローカル組織損傷28,29の可能性を高めるターゲット遺伝子のハイパー表現を引き出すことができます。したがって、遺伝子療法のための信頼性の高い遺伝子スイッチのアプリケーションでは、不要な合併症を避けることができます。PEUI(+) ベクターは、生物学的および臨床的研究で遺伝子発現を制御するための便利で強力なツールを提供します。現在、我々 のシステムの適用範囲を高めるため GvEcR に基づく特異レンチウイルスベクターを進めています。

いくつかの異なる遺伝子のスイッチは、正確に遺伝子発現細胞培養および動物モデル、成功1,2,3の度合いを調節する能力について検討しています。潜在的な遺伝子のスイッチ システムを含む、いくつかの厳格な条件を満たす必要があります: 遺伝子、誘導、プロモーターのごくわずかな水漏れしたため、transgene の可逆性の用量と時間依存応答性の正確な方向式インデューサの除去や細胞および研究室動物1,2,3に許容インデューサ毒性レベルを介して活性化。テトラサイクリン4、5ラパマイシン6,7、8ミフェプリストン9,10を含むいくつかの小分子誘導を悪用されています。エクダイソン11,12,13,14。一般に、これらのシステムは、2 つまたは 3 つの離散式ユニットを含む、少なくとも 2 つのプラスミドを必要とする、1 つまたは 2 つの構成; 転写活性を得るために小分子インデューサをバインド規制要素 (インデューサ プラスミッド)別プラスミド (エフェクター プラスミッド) インデューサ バインド規制要素へのアクセスを可能にする規制 DNA 領域の制御の下で遺伝子を含みます。バイナリ システムの主な欠点は、ターゲット セル (インデューサとエフェクター) 2 つのベクトルの併用導入を必要とすることです。一時的な遺伝子発現実験の 2 種のプラスミドの同時トランスフェクション必然的を生成する単独でインデューサか、エフェクターをトランスフェクトしたまたは co transfected ない均等にするセルの人口。さらに、バイナリ システムでは、時間がかかり、骨の折れるである安定したセルラインを確立する抗生物質選択の少なくとも 2 つのラウンドが必要です。したがって、遺伝子発現に必要なすべてのコンポーネントを組み合わせることと 1 つのベクトルに規制が単一のセルにすべての必要な要素の随伴表現を保証し、遺伝子発現の調節を可能にする理想的だろう小分子誘導と治療を通じて
バイナリの遺伝子スイッチの欠点を克服するためには、キイロショウジョウバエEcR 遺伝子誘導システム15を使用して特異遺伝子スイッチ我々 最近開発。エクジソンは、順番 DNA 規制要素3,11EcR のバインディングを誘導する EcR/ウルトラスピラクル (USP) ヘテロダイマーにバインドするときに遺伝子発現を仲介します。脊椎動物のレチノイド X 受容体 (RXR)、昆虫、USP のオーソログがアクティブな転写活性化因子16を形成する EcR を募集します。したがって、脊椎動物の細胞または組織の遺伝子発現のターゲット、EcR と RXR 必要があります共発現同時に脱皮ホルモンまたはそのアゴニストによって刺激されて前に。以来、EcR 遺伝子スイッチのヘテロ二量体の機能は、内因性の RXR レベル、Padidamらによって影響があります。異種 GAL4 DNA 結合、単純ヘルペス ウイルス蛋白質 vmw65 置き換え EcR DNA 結合と活性化ドメイン (VP16) 活性化ドメイン融合内因性 RXR に応答しなくなったし、ホモを形成した EcR リガンド結合ドメイン転写活性17を得よう。EcR ベース遺伝子のスイッチは、ホモを形成し、エクジソン アゴニスト、Teb16のない状態で細胞質に局在 GvEcR と組み合わせて最小限 VP16 活性化ドメインから成るキメラ蛋白質を構築することでさらに改善されました。 18。Teb にバインディングによって、GvEcR、内局細胞質からに変更ゼブラフィッシュ E1b 10 タンデム併用最小プロモーターから成るハイブリッド プロモーターの反復上流活性化配列 (UASs) を開始するを認識する核、16ターゲット遺伝子のトランスクリプション。
以前に報告した EcR 遺伝子を簡素化するスイッチ16,18、刺激的な発現のためすべての必要な要素を装備し、指定の単一ベクトルにシステムのバイナリの機能を結合我々新しく生成されたベクトル pEUI(+) (GenBank 受入番号: KP123436、図 1 a)15。EcoRI、PmlI、NheI、BmtI、AfeI、および AflII の認識シーケンスが (図 1 b) UAS を繰り返す多重クローニング サイト (MCS) 続いて E1b 最小プロモーターの横にある 10 のタンデムのエフェクター GvEcR ドライバー (ドライバー以下) への応答で構成されます。選択を容易にするためにさらに、トランスフェクション細胞の SV40 プロモーターに駆動されるピューロマイシンN-アセチルのトランスフェラーゼ (PAC) 遺伝子は安定したセルライン (図 1) を維持するためにドライバーとエフェクターの間置かれました。
PEUI(+) を用いた遺伝子発現の非定常かつ安定的な変調のための詳しいプロトコルについて述べる。また、脱皮ホルモンのアゴニストとして Teb の正しく使用するための詳細な手順を提供します。

<table><tbody><tr><td>pEUI(+)</td><td>TransLab</td><td></td><td>The patent license was transferred to TransLab Inc.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gene-Fect Transfection Reagent</td><td>TransLab</td><td>TLC-001</td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Tebufenozide</td><td>Fluka</td><td>31652</td><td></td></tr><tr><td>Cloning cylinder</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Corning</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Welgene</td><td>S001-01</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>SPL life science</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>mouse FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>anti-alpha tubulin antibody</td><td>Calbiochem</td><td>CP06</td><td></td></tr><tr><td>Cloning cylinder</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.1</td><td></td></tr><tr><td>M-PER Mammalian Protein&lt;br/&gt; Extraction Reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>78505</td><td></td></tr><tr><td>100X Protease inhibitor Cock. III</td><td>T&amp;amp;I</td><td>BPI-9200</td><td></td></tr></tbody></table>

an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness

遺伝子発現の精密制御が望ましい生物学的および臨床的研究です。ただし、現在失業遺伝子スイッチのバイナリの機能は、単一のセルに同時に 2 つの治療式単位の転送を必要とするため、遺伝子治療のためのシステムの実用的なアプリケーションが制限されます。遺伝子組み換え式システムを簡素化し、1 つのベクトルで遺伝子発現モジュールの完全なセットを包括的な pEUI(+) として示される遺伝子スイッチを生成されます。新開発の特異遺伝子のスイッチは非常に GAL4 DNA 結合ドメインの構成と変更された EcR (GvEcR)、変更されたショウジョウバエ脱皮ホルモン受容体 (EcR) と同様、GAL4 DNA 結合ドメインと融合した最小限 VP16 活性化ドメイン時間と用量依存的に化学インデューサの管理に対応。PEUI(+) ベクターは、生物学的研究と前臨床研究遺伝子発現の制御を改善するための強力なツールです。ここでは、変調テブフェノジド (Teb) 処理による pEUI(+) ベクトルを用いた非定常かつ安定的な発現のための詳しいプロトコルを提案する.また、Teb の化学誘導としての使用に関する重要なガイドラインを紹介します。

GvEcR ベースの特異遺伝子のスイッチは、図 1 aに描かれています。PEUI(+) ベクトルは、Teb で処理による遺伝子発現の調節用に最適化されました。PEUI(+) のエフェクター地域、10xUAS と最小プロモーターに続いて EcoRI、PmlI、NheI、BmtI、AfeI、および AflII の制限酵素認識部位を含む MCS、E1b で構成します。SV40 多信号は、MCS (図 1 b) 後ろに追加されました。PAC遺伝子は、ピューロマイシン耐性を付与する pEUI(+) のドライバーとエフェクターの間に挿入されました。
PEUI(+) の水漏れしたため、活動を評価する私たち subcloned EGFP MCS の EcoRI サイトに (pEUI(+)-EGFP)、一過性プラスミド構築を HEK293 細胞にトランスフェクション、Teb で管理 24 h (の濃度の異なる図 2)。一方、形質転換細胞を蛍光示さなかったモックのベクトル信号 Teb 治療 (図 2 a、 B) に関係なく pEUI (+)-EGFP 形質転換細胞徐々 に Teb (図 2-F の量の増大に敏感だった).もっと重要なは、pEUI (+)-Teb の治療せず EGFP を形質転換細胞が蛍光顕微鏡 (図 2) 任意の検出可能な EGFP 信号を引き出さなかった。
Teb に pEUI(+) の応答性をさらに検証するため、我々 は pEUI(+) の EcoRI サイトにフラグ エピトープ タグANKRD13A遺伝子を subcloned、コンストラクトを HEK293 細胞に移るし、ピューロマイシンを選択を確立する 3 週間のためにそれらを受ける遺伝子のANKRD13A目的のセルの行。Teb 投与 24 時間後ANKRD13A遺伝子の発現解析を行ったし、確立されたセルラインがよく反応 (図 3)。さらに、文化的なメディアから Teb を枯渇させることによって pEUI(+) の遺伝子スイッチの可逆性を示しました。図 3に示すとおり、ANKRD13A 式検出しなくなった Teb 自由な媒体の細胞培養を行ったとき。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57494/57494fig1.jpg"> 図 1.PEUI(+) の模式図.PEUI(+) のベクトル地図 (A) が建設されました。CMV プロモーターは、GvEcR の発現をドライブします。Teb バインド GvEcR を核に若し、10xUAS cisをバインド-MCS に挿入された遺伝子の表現を刺激するために規制シーケンスを演技します。シーケンス (B) についてには、(A) の角かっこの間には、pEUI(+) の全体のエフェクターのシーケンスが含まれています。矢印は、MCS に含まれている個々 の制限酵素認識部位を表しています。<a href="/files/ftp_upload/57494/57494fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57494/57494fig2.jpg"> 図 2.GvEcR ベースの特異遺伝子スイッチの Teb の治療に応答します。指定された DNA を導入させた HEK293 細胞を構築します。トランスフェクションの 24 時間後のセルが指定された濃度で Teb で 24 時間刺激された.EGFP遺伝子活動は、蛍光顕微鏡下で観察しました。PEUI(+) のモック形質転換細胞は (A) と任意の検出可能な蛍光を示さなかったまたは (B) Teb 治療なし。(C-E)PEUI (+) の蛍光強度-EGFP-transfected セルが Teb 用量依存的に増加します。スケール バー、10 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57494/57494fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57494/57494fig3.jpg"> 図 3.HEK293 細胞安定的遺伝子 pEUI (+)/フラグ ANKRD13A が Teb の管理に可逆応答します。フラグ エピトープ タグ ANKRD13A 式は、Teb (1.5 μ M) 処理によって引き起こされました。Teb と治療の 24 時間後セルは時間の指定された量の Teb ドロップ アウト メディアに切り替えていた。ANKRD13A の相対的な量は、反フラグ抗体を用いたウエスタンブロット法により測定しました。Α-チューブリンの内因性の発現レベルは、コントロールとして抗 α-チューブリン抗体で測定しました。白の印は、正体不明の交差反応性種です。<a href="/files/ftp_upload/57494/57494fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

脱皮ホルモン受容体を介した特異遺伝子スイッチ意図的な堅牢性、可逆性、ごくわずかな水漏れしたためと遺伝子発現の

ここでは、テブフェノジド処理による pEUI(+) 特異遺伝子スイッチを用いた遺伝子発現の調節のためのプロトコルを提案する.

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

an-ecdysone-receptor-based-singular-gene-switch-for-deliberate

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

6.4K ビュー.  Chungnam National University. ここでは、テブフェノジド処理による pEUI(+) 特異遺伝子スイッチを用いた遺伝子発現の調節のためのプロトコルを提案する.

ビデオ: An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

遺伝学

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based approaches. For example, although chimeric and Cre-LoxP targeting strategies have been widely used, the intrinsic limitations of these strategies (i.e., leaky promoter activity, mosaic Cre expression, etc.) have significantly restricted their application. Moreover, a complete deletion of many endogenous genes is embryonically lethal, making it impossible to study gene function in postnatal life. To address these challenges, we have made significant changes to an early genetic engineering protocol and combined a short (transgenic) version of the Rb1 gene with a lysosomal protease procathepsin B (CB), to generate a DN mouse model of Rb1 (CBRb). Due to the presence of a lysosomal protease, the entire CB-RB1 fusion protein and its interacting complex are routed for proteasome-mediated degradation. Moreover, the presence of a tetracycline inducer (rtTA) element in the transgenic construct enables an inducible and reversible regulation of the RB1 protein. The presence of a ubiquitous ROSA-CAG promoter in the CBRb mouse model makes it a useful tool to carry out transient and reversible Rb1 gene ablation and provide researchers a resource for understanding its activity in virtually any cell type where RB1 is expressed.

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Here we present a protocol to develop a dominant-negative inducible system, in which any protein can be conditionally inactivated by reversibly overexpressing a dominant-negative mutant version of it.

誘導およびリバーシブルのドミナント ネガティブ (DN) 蛋白質の阻害

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

ショウジョウバエのゲノム編集による組織固有のバイナリ転写システムを生成するための効率的な戦略

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

発生生物学

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

免疫・感染学

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

哺乳類細胞における安定した光遺伝学的遺伝子回路を確実にエンジニアリングおよび制御

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

生物工学

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

イン・ビトロ 標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

迅速な合成およびGFPベースの記者との化学的に活性化する転写因子のスクリーニング

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

生物学

Inducible Tet-Off Regulatable System: An In Vitro Method to Modulate Gene Expression in Cultured Cells Using Tetracycline-Off System

Source: Migneault, F. et al, <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/60654">Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the method of regulating gene expression in cultured cells by transfection with a plasmid containing a gene of interest and a regulatory plasmid. The expression of this plasmid can be controlled by tetracycline or its synthetic analogs, making this system a useful model to study regulatable gene expression.

誘導性Tet-Off制御システム:テトラサイクリンオフシステムを使用して培養細胞における遺伝子発現を調節するIn vitro法

Source: Migneault, F. et al, Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in ...

脱皮ホルモン受容体を介した特異遺伝子スイッチ意図的な堅牢性、可逆性、ごくわずかな水漏れしたためと遺伝子発現の

要約

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誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

誘導およびリバーシブルのドミナントネガティブ (DN) 蛋白質の阻害

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

ショウジョウバエのゲノム編集による組織固有のバイナリ転写システムを生成するための効率的な戦略

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

哺乳類細胞における安定した光遺伝学的遺伝子回路を確実にエンジニアリングおよび制御

イン・ビトロ標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択

迅速な合成およびGFPベースの記者との化学的に活性化する転写因子のスクリーニング

誘導性Tet-Off制御システム:テトラサイクリンオフシステムを使用して培養細胞における遺伝子発現を調節するIn vitro法

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誘導およびリバーシブルのドミナント ネガティブ (DN) 蛋白質の阻害

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

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イン・ビトロ 標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択

迅速な合成およびGFPベースの記者との化学的に活性化する転写因子のスクリーニング

誘導性Tet-Off制御システム:テトラサイクリンオフシステムを使用して培養細胞における遺伝子発現を調節するIn vitro法

誘導およびリバーシブルのドミナントネガティブ (DN) 蛋白質の阻害

イン・ビトロ標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択