角膜移植片の間質特徴の組織学的様解析のための全視野光コヒーレンス顕微鏡

この方法は、アイバンクにおける角膜ドナー組織のスクリーニングおよび選択を改善し、角膜移植の結果を高めることができる。この技術の主な利点は、その高解像度評価機能と、画像取得中ずっと角膜が記憶媒体で満たされた密閉チャンバーに浸されたままであり、汚染の潜在的なリスクを低減します。手順を実演するのは、私たちの研究室を卒業した博士号のマエル・ビルバートです。

まず、上皮を上に向けて、サンプルホルダー内の保存媒体に浸した角膜を配置します。サンプルホルダーに付属の清潔なシリカカバースリップを角膜の上に置きます。次に、サンプルがわずかに平らになり、カバースリップの下に固定されるまでベースをゆっくりと回してホルダーを閉じ、比較的均一なイメージング面を提供します。

気泡を避けるために予防策を講じてください。液浸媒体としてカバースリップに眼科用または光学用ゲルの厚い層を適用します。デバイスの背面にある電源スイッチをオンにして、デバイスを初期化します。

デバイスの前面にある緑色のLEDの点灯は、電源がオンになっていることを示します。可動トレイを除いて、イメージングステージが透明であることを確認してください。次に、アクイジションソフトウェアで[OK]をクリックして、プロンプトでモーターを初期化します。

デバイスを設定するには、指定された必須フィールドにサンプル識別子を入力します。また、必要に応じて、サンプルの説明と試験の説明を入力します。次に、[マクロ イメージの取得] をクリックして、後で横方向の配置やナビゲーションに使用できるサンプルのスナップショットを作成します。

問題がなければ、[はい] をクリックしてプロンプトでイメージを検証します。その後、デバイスはサンプルトレイを対物レンズの下に移動し、自動調整を実行します。先に進む前に、顕微鏡の対物レンズが光学ゲルに十分に浸されていることを確認してください。

[探索] タブに移動して取得を準備します。画像のスタックを取得する前に、ジョイスティックまたは画面上の手動選択を介して角膜の中心に移動します。ジョイスティックの回転、スライダーの調整、またはグラフィカルユーザーインターフェイスの手動キーボード入力により、イメージング深度を変化させます。

次に、最適な角膜イメージングのために平均値を40に調整します。角膜表面値または最初の画像位置を深度フィールドに入力します。次に、[取得]タブを選択して画像を取得します。

デバイスの軸方向の解像度に一致するスライス間隔を選択して設定します。[スライス数] に角膜の厚さの値を入力します。パラメータと取得時間を確認します。

そして、満足したら、[OK]を押して取得を開始します。取得中は、顕微鏡が配置されているテーブルとの接触を避けてください。間質層とボーマン層の厚さを評価するには、角膜断面の距離を測定します。

たとえば、テキスト原稿で説明されているように、断面全体に5つの等間隔のポイントを追加します。既知の距離の 2 つのポイント間に、デフォルトの視野に従って線を引きます。次に、[分析]タブに移動し、[スケールの設定]を選択します。

既知の距離と長さの単位を適切なフィールドに入力します。1024 ピクセルまたは 780 マイクロメートルに設定し、[OK] をクリックします。距離が不明な2点の間に線を引き、ステータスバーから直接測定された長さまたは距離を読み取ります。平均と変動係数を記録します。

[画像]タブをクリックし、[スタック]の下の[再スライスZ]を選択して、ケラチノサイト密度を決定します。これにより、間質と顔の画像を7つのグループに合計して、同等の厚さのスライスが生成されます。さらなる分析のために、前部間質の利用可能なすべての顔スライス、前間質の15枚の画像、中間質の5枚の画像、および後部間質の5枚の画像を含めます。

各エンフェイス画像で、300 x 300マイクロメートルの関心領域を選択します。核の視覚化を強化するには、[編集]タブの[反転]を使用して画像を反転します。コントラストと明るさを調整するには、[画像]タブをクリックし、[明るさ-コントラスト]に移動します。

細胞核を手動でカウントするには、[プラグイン]に移動し、[分析]タブの[セルカウンター]に移動します。 [初期化]を押して、カウンターの種類を選択します。次に、反転画像内の暗い楕円形の特徴をクリックして細胞核を数え、画像の4つの側面のうち2つだけの画像の境界に着地するものを考慮します。

選択されたヒトドナー角膜は、臓器培養培地に保存した後に腫脹し、浮腫性角膜の病態生理学的モデルを与え、浸透深さが限られているため角膜の厚さ全体を通して画像取得を妨げました。デキストリン補充臓器培養培地への移送は、腫脹を減少させ、正常な厚さのドナー角膜をもたらした。罹患角膜は、形態学的変化および可変間質厚さまたはボーマン層の減少を含む典型的な間質的特徴によって認識された。

ケラチノサイト密度と間質反射率の評価は、臨床光干渉断層撮影システムの能力を超えたフルフィールド光干渉顕微鏡による正常角膜組織と病理学的角膜組織の組織学的分析と鑑別をさらに支援しました。このビデオを見た後、正常なヒト角膜組織からの疾患の区別を可能にする角膜間質の定性的および定量的組織学的分析を実行する方法をよく理解する必要があります。