この研究は、国立癌研究所 (R01CA166376 ・ D.X. ・ グエンに R01CA191489) と国防総省 (W81XWH-16-1-0227 D.X. グエンに) からの助成金によって賄われていた。

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著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

印象的な臨床の平行線は、肺癌と肺36の他の慢性疾患と記載されています。特に、特発性肺線維症 (IPF) 患者は、肺癌の増加好みを有しこの協会の歴史37,38を喫煙とは無関係です。IPF は、肺のアーキテクチャと ECM39の析出による呼吸機能の低下の進歩的な破壊によって特徴付けられます。また、外科的切除に続いて同時 IPF で初期期非小細胞肺癌患者予後40があります。ほとんどの非小細胞肺癌腫瘍には診断時に線維化コンポーネントが含まれて、この間質反応の程度は予後不良18と相関します。線維症から急性または持続的な組織の損傷は、複数の方法で腫瘍の頻度を増加可能性があります。例えば、損傷後、上皮再生のプロセス変換を受けやすい前駆細胞のプールの拡張可能性があります。また、流入と多様な免疫細胞の機能を助けるかもしれない芽の活性化、成長因子を分泌する可能性がありますまたは腫瘍促進 ECM を入金、免疫抑制の微小環境を確立します。したがって、エージェントを誘導する線維症肺を調節済みの手法が肺の癌の併存 (例えば線維症) の効果を勉強し、非小細胞肺癌のサブタイプは、豊富な細胞外マトリックスをモデリングに特に傾向がある証明するかもしれないし、炎症性実質41。
全体的に、本手法は大幅気管を介して気道に注入された腫瘍細胞の生着を強化しました。この観察は免疫の度合いとマウス系統に当てはまります。肺に腫瘍細胞の注入の他のメソッドには、尾静脈注射または胸壁を介して肺実質に直接注入が含まれます。前者後者副産物 (プロセス肺に転移に似ている)、前に extravasate し、循環で生き残るために腫瘍細胞を必要と肺のがん細胞の腫瘍を勉強の特定の目的のためこれらのメソッド、サブ最適です、します。注射 (データは示されていない) 後すぐに胸膜腔に流出する細胞があります。肺がん細胞伸長のロコ地域定量化を混同するかもしれない両方の方法。また、私たちのプロトコルは、シード腫瘍細胞は最初肺間質に囲まれた航空で保持されることを保証します。このプロトコルの成功に重要な、マウスの適切な挿管、ブレオマイシンの許容線量と腫瘍細胞の注入を基準にして気道前処理のタイミングです。またこのプロトコルがその後脳を含む他の組織に広めるに細胞をできることを示します。肺腫瘍の負担に関連する罹患率遠く macrometastasis の包括的な評価を制限可能性があります、このアプローチを定量化および肺循環腫瘍細胞を研究に役立ちますあります。
記載方法の利点、にもかかわらずいくつかの技術的な変数は、生着の究極の効率性と腫瘍の進行の監視の影響を及ぼすかもしれない。まず、マウスにおけるブレオマイシン線維応答が歪に依存されています。例えば、c57bl/6 マウスは Balb/c マウス42と比較して線維化しやすいです。第二に、ブレオマイシン感受性に対するは性別と年齢依存です。我々 の経験で女性と若いマウスは、プロトコル全体に悪影響を受けやすい。これは、男性と女性の間の直接比較を必要とする癌研究や老いも若きも動物に制限があります。また、7 週より若いマウスの気管内投与は技術的に挑戦的なカテーテルのサイズの調整が必要になる場合があります。第三に、ブレオマイシンは有毒であると、DNA の切断を誘導するその能力により変異原性があります。実験を実行する前に各マウス緊張にブレオマイシンの許容投与量をテストすることが重要です。原理研究の証拠はこの、様々 な系統の雄マウスの推奨用量を提供します。さらに、暗い毛皮を持つマウスは発光穿低組織イメージングと毛皮で発光信号のマスキングには適しています。画像測定、向上させることが、マウスのそりが、代替方法は磁気共鳴イメージングと TdTomato または Katushka43など長い波長のプローブを用いた蛍光イメージングなども採用することができます。最後に、与えられたモデルマウスの腫瘍検出モダリティを選択するときは、指定されたレポーター蛋白質の潜在的な免疫原性を考えるべき。
ブレオマイシン改造する最初の有害な肺胞が遠位部の肺は肺胞44を修復する試みで再生成 2 (AT2) セルを入力します。AT2 細胞は非小細胞肺癌を引き起こす主要な細胞のタイプの 1 つなので事前ブレオマイシンの肺を調節変更することも開始し、GEMMs からその場に発生した腫瘍の進行。を含むインフルエンザ感染ナフタリンや13注入14損傷の他の種類は、人間とネズミの肺幹/前駆細胞の生着を増加する示されています。とりわけ、ナフタレン損害幹/前駆 bronchio 歯槽接合における細胞、潜在的 GEMMs45腫瘍発生が増加します。損傷の明らかな移植細胞の種類を対象とした気道ニッチ型の微調整はさらに肺がんの移植や異なる起源の異種移植片を研究する手法を最適化可能性があります。最後に、肺腺癌 PDXs の標準的な生成のためこのメソッドを実装する可能性があることを提案します。NSG マウス皮下移植による肺癌 PDXs 人間の biospecimens を確立するの成功率は比較的低い (30-40%)46,47です。PDXs の直交異方性成長可能性がありますだけでなく (人間の肺) からの標本の量を制限することにこの成功率を高める、また肺がん治療薬の体内動態とをテストするもっと生理学的に関連する条件を生成します。

肺癌は主要ながんの原因関連死亡世界中1。肺癌患者は転移から最終的に屈する遠い器官、特に中枢神経系、肝臓、副腎、骨2,3,4。胸部の悪性腫瘍は、伝統的に小細胞肺癌 (SCLC) または非小細胞肺癌 (NSCLC) がん5として分類されています。非小細胞肺癌は、最も頻繁に悪性腫瘍の診断、肺腺癌 (LUAD) 肺扁平上皮癌 (LUSC)6など、さまざまな組織学的サブタイプに分割することができます。切除人間原発性肺癌のゲノム解析は、指定された histotype 内腫瘍では多様な分子の摂動、さらに彼らの発散の臨床進行に貢献し、患者の予後を交絡を表すことも明らかにしました。肺癌の顕著な不均一性は、合理的な設計、前臨床テスト、および効果的な治療戦略の実装に重要な挑戦を表します。その結果、多様な携帯電話の起源、分子サブタイプ、およびこの病気の段階を検討する難治性肺癌モデルのレパートリーを拡大する必要性があります。
モデル動物を用いた様々 なアプローチは肺癌生体内で、それぞれ独自の長所と短所の興味の生物的質問によって研究に採用されています。遺伝子組み換えマウス モデル (GEMMs) は腫瘍免疫ホスト7その中その結果特定の前駆細胞の種類に特定の遺伝子変異をターゲットできます。臨床的に関連する、非常に強力な GEMMs に関連付けられている待機時間、変動、および/または肺の腫瘍罹患率が特定の定量的計測と遠隔臓器8後期段階転移の検出に法外なことができます。補完的なアプローチという肺癌細胞、マウス腫瘍から直接を取得もしくは派生文化では、確立されたセルラインとして最初は同系のホストに再導入された同種移植モデルの使用であります。同様に肺癌異種移植片は、ひと細胞または患者の派生腫瘍サンプルから確立されます。ひと細胞ライン異種移植片または患者派生異種移植片 (PDXs) 免疫不全マウスにおける一般的に維持され、したがって完全な免疫監視9を排除します。この欠点にもかかわらず、人間 biospecimens 研究基礎的体内プロパティ GEMM 腫瘍よりもより複雑なゲノム異常のためエンコードひと癌細胞の量を制限することを伝達する道を提供します。
同種および異種移植片の 1 つの便利なプロパティは、がん幹細胞 (TICs) 悪性細胞人口10以内の頻度を定量化する採用、制限する従来の細胞希釈アッセイに従うことです。これらの実験で定義されたセル数は動物の側腹部に皮下し、チックの頻度は腫瘍を取る率に基づいて推定できます。皮下腫瘍しかしより低酸素11でき肺腫瘍微小環境のキーの生理学的な制約はモデル化されないことがあります。マウスの肺に上皮幹・前駆細胞気管内配信は、肺と気道幹細胞生物学12を勉強する方法です。ただし、肺が損傷、ウイルス感染13,14などの生理学的なフォームを受ける最初でない限りこの手法から生着率は比較的低いできます。炎症性間質細胞からのサポートおよび/または肺基底膜の中断は、遠位気道15に関連する幹細胞ニッチに移植細胞の保持を向上させる可能性があります。誘導剤の線維化がすることができます誘導多能性細胞16および17間葉系幹細胞の生着を強化する肺を事前条件も。気道損傷のようなフォームが生着率を適用できるかどうか、腫瘍開始容量と肺癌細胞の伸長がまだ体系的に評価します。
本研究では事前の負傷でマウスの肺をコンディショニングすることで同所性同種肺がん細胞生着の効率を上げる方法をについて説明します。LUAD にこれらの癌は、しばしば予後不良19と相関線維性間質18の開発の重要なサブセットと遠位気道で発生します。自然リボソーム ハイブリッド ペプチド-ポリケチド、ブレオマイシンはマウス20肺線維化を誘導するために広く利用されています。ブレオマイシンの気道注入は最初上皮消耗戦肺胞の炎症細胞、マクロファージ、好中球と単球21の募集を推進しています。遠位気道基底膜再編成22,23細胞外マトリックス (ECM) 蒸着24組織の改造現象が続きます。ほとんどの研究25で 30 日後に解決する線維症単一ブレオマイシン投与の効果は一時的なもの。同種および異種移植腫瘍モデルを用いた場合 LUAD 肺細胞の取る速度が大きく向上できるプレコンディショニング ブレオマイシンとマウスの気道をテストしました。

<table><tbody><tr><td>Bleomycin</td><td>Sigma</td><td>B5507-15UN</td><td>CAUTION Health hazard GHS08</td></tr><tr><td>Exel Catheter 24G</td><td>Fisher</td><td>1484121</td><td>Remove needle. For intratracheal injection</td></tr><tr><td>Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL)</td><td>Butler Schein</td><td>56344</td><td>To anesthetize mice</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Butler Schein</td><td>33198</td><td>To anesthetize mice</td></tr><tr><td>Ketoprofen, 5,000 mg</td><td>Cayman Chemical</td><td>10006661</td><td>Analgesic</td></tr><tr><td>Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment</td><td>BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC</td><td>8897</td><td>To prevent eye dryness while under anesthesia</td></tr><tr><td>D-Luciferin powder</td><td>Perkin Elmer Health Sciences Inc</td><td>122799</td><td>For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light</td></tr><tr><td>Rodent Intubation stand</td><td>Braintree Scientific</td><td>RIS-100</td><td>Recommended stand for intratracheal injection</td></tr><tr><td>MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150</td><td>DOLAN-JENNER INDUSTRIES</td><td>MI-150 / EEG2823M</td><td>To illuminate and visualize trachea</td></tr><tr><td>Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat</td><td>Roboz</td><td>RS-5111</td><td>For intratracheal injection</td></tr><tr><td>Syringe Luer-Lok Sterile 5ml</td><td>BD / Fisher</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver</td><td>Conair</td><td>-</td><td>To shave mice</td></tr><tr><td>Bonn Scissors, 3.5&quot; straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades</td><td>Roboz</td><td>RS-5840SC</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>BD / Fisher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tubes</td><td>USA SCIENTIFIC INC</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI</td><td>Fisher</td><td>701350</td><td></td></tr><tr><td>Filter pipette tips (200 &amp;mu;L)</td><td>USA SCIENTIFIC INC</td><td>1120-8710</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum USDA</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma</td><td>A2942-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap</td><td>Fisher / Corning</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence</td><td>Perkin Elmer Health Sciences Inc</td><td>124262</td><td>For &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; bioluminescence imaging</td></tr><tr><td>Living image software</td><td>Perkin Elmer Health Sciences Inc</td><td>128113</td><td>For &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; bioluminescence analysis</td></tr><tr><td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td><td>Perkin Elmer Health Sciences Inc</td><td>118918</td><td>For Isoflurane anesthesia</td></tr><tr><td>BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in)</td><td>BD / Fisher</td><td>BD328418</td><td>For retro-orbital luciferin injection</td></tr><tr><td>Syringe 1ml</td><td>BD / Fisher</td><td>14-823-434</td><td>For intraperitoneal injections</td></tr><tr><td>26 G x 1/2 in. needle</td><td>BD / Fisher</td><td>305111</td><td>For intraperitoneal injections</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>VWR</td><td>43368-9M</td><td>CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue</td></tr><tr><td>Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+</td><td>METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL</td><td>17014411</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&#039;s Hematoxylin</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>517-28-2</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57%</td><td>Fisher</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Masson Trichrome Stain Kit</td><td>IMEB Inc</td><td>K7228</td><td>For masson trichrome stain to visualize collagen</td></tr><tr><td>Superfrost plus glass slides</td><td>Fisher</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate</td><td>Corning</td><td>C3516</td><td></td></tr><tr><td>Universal Mycoplasma Detection Kit</td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td><td></td></tr><tr><td>OCT Embedding compound</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>62550-12</td><td>For embedding tissue for frozen sections</td></tr><tr><td>Leica CM3050 S Research Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td>To section tissue for staining analysis</td></tr><tr><td>Keyence All-in One Fluorescence Microscope</td><td>Keyence</td><td>BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>US National Institutes of Health</td><td>IJ1.46</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html</td></tr><tr><td>Prism 7.0 for Mac OS X</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice</td><td>Charles River</td><td>NIH-553</td><td></td></tr><tr><td>NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>B6129SF1/J mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>101043</td><td></td></tr><tr><td>NIH-H2030 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-5914</td><td></td></tr><tr><td>368T1</td><td>generously provided by Monte Winslow (Standford University)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>PC9 cells</td><td>Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51&amp;ndash;62</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>H2030 BrM3 cells</td><td>Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51&amp;ndash;62</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

pre-conditioning the airways of mice with bleomycin increases the efficiency of orthotopic lung cancer cell engraftment

肺がんは、異種生物である致命的な治療難治性の疾患です。理解し胸部悪性腫瘍の完全な臨床スペクトルを効果的に治療するには、多様な人間の肺の癌のサブタイプとステージを要約することができます追加の動物モデルが必要です。同種または異種移植モデルは多目的、発癌性容量の生体内で、マウスやひと由来の悪性細胞を用いた定量化を有効にします。ただし、マウス細胞の肺への同所性同種移植の非効率性のためのフランクなどの非生理的サイトで肺のがん細胞の生着の上記の方法を行った。本研究ではあらかじめ線維症誘導エージェント ブレオマイシンとマウスの気道をコンディショニングすることで同所性同種肺がん細胞生着を強化する方法をについて説明します。概念実証実験としてマウスの系統にマウスまたは人的情報源から得られた肺腺癌のサブタイプの腫瘍細胞を接がへのこのアプローチを適用されます。我々 は腫瘍細胞の注入前にブレオマイシンと気道が負傷 0-17 から腫瘍細胞の生着が増加を示す 71 100%。大幅にこのメソッドが強化されたは、肺腫瘍の発生率と異なるモデルとマウス系統を使用して後続の副産物。さらに、明らかな移植肺癌細胞を関連する遠隔臓器に肺から発信します。したがって、我々 はの確立し、肺癌の細胞またはラットの量を制限することの新しい直交異方性モデルを維持し、肺癌細胞生理学的に関連する設定での発癌性の能力を定量的に評価するために使用できるプロトコルを提供します。.

LUAD マウスの肺に癌細胞移植の効率を高めるには、まず事前条件を同所性同種腫瘍細胞の注入 (図 1) に続いてブレオマイシンを使用して航空プロトコルを開発しました。無胸腺を免疫不全マウスに投与した際にもブレオマイシンによる一時的な線維症気道アーキテクチャと増加のコラーゲン沈着 (図 2) の損失によって証明されるように 14 日目を確認しました。これらのマウスの総線維症は、50 日後にブレオマイシン注入 (図 2; 右パネル)24先行研究と一致して解決。
いた事前に調節された車両やブレオマイシンの単回投与で 14 日前系統マウスの肺に異なる起源の LUAD セルにしみ込んでこれらの観察に基づいて、我々。たとえば、確立された人間 LUAD 細胞ライン H2030、LUAD 細胞の懸濁液は無胸腺マウスの肺に気管を配信されました。35 日後は、ブレオマイシンで前処理したマウスは、高肺腫瘍負担発光 (図 3 a) によって検出されたを持っていた。逆に、車両処理動物、同じ時間枠 (図 3 a) で腫瘍は検出されませんでした。肺腫瘍の負担は、次の死体解剖組織学によって確認されました。ブレオマイシン前処理肺腫瘍結節 (図 3 b) をしていたに対し、車両で前処理した肺は腫瘍結節の証拠を有しなかった。このプロトコルを使用して、我々 は無胸腺マウス (PC9; に別の人間 LUAD セルラインの生着を増やしました図 3)同系の免疫 B6129SF1/J マウス (図 3 D) に注入されたマウス LUAD セルライン。ブレオマイシン前処理同系マウスにみられる初期の病変は主にグレード 1 および 2 され十分に分化した上皮内から発生した腫瘍に似たKraG12D/+;p53-/- GEMMs33。すべての明らかな移植 LUADs 近位および遠位部の肺の成長をした (図 3 b、図 3E図 3; アスタリスク (遠位)、星 (近位))。ひと細胞は皮下うなずくscidガンマ (NSG) など深刻な免疫不全動物へ移植した場合でも、(から生検または外科的切除) 肺がんの biospecimens からの PDXs の確立は比較的効率的ですマウス系統34。PDXs への本手法の適用性を評価する私たちはまた H2030 BrM3 細胞35, 中古エアコン車両とされていた NSG マウスの気管内投与と呼ばれる H2030 セルラインの転移性の高い細胞のサブ人口を注入またはブレオマイシン。我々 は、NSG マウス ブレオマイシン (データは示されていない) の毒性に影響を受けやすいこと、このひずみを操作するときは、勧めの 0.02 マウス単位より低い線量を注意してください。それにもかかわらず、我々 のプロトコルも大幅に改善生着と (図 3図3f) NSG マウスの肺腫瘍の負担。
次、このプロトコルを使用無胸腺マウスにおける H2030 細胞株を用いた細胞の量を制限することの生着率をテストします。ブレオマイシンを事前に投与したマウスは、5 x 10 の55 × 10 の4、または 5 x 103 H2030 細胞を注入しました。85.7 マウスの 100% は、すべて希釈テスト (表 2) で 7 と 10 週の間に肺腫瘍を開発しました。その後比較的低いと考えられた肺における腫瘍細胞の数はマウス、ブレオマイシンと中古エアコンであれば。マウスのいくつかの系統や 0 16.7 から肺に癌細胞の生着率を高めるため様々 な LUAD 細胞ラインのモデルに私達のプロトコルを合わせたことが全体的にみて、71.4 100% (表 2)。
最後に、推定 LUAD 細胞伸長とブレオマイシン中古エアコン肺からの転移性普及論を評価する転移性の高い H2030 BrM3 細胞のプロトコルを使用しての動作を特徴とします。以下の車両処理マウスで同所性同種移植、腫瘍細胞消耗戦で認め発光 3 日目で投与後とその後、エンドポイント (35 日)、肺腫瘍の成長を検出できませんでした (図 4 a図 4 b)。逆に、事前 (図 4 a) の投与 7 日後に早くもブレオマイシンを投与したマウスの肺腫瘍の伸展を検出しました。腫瘍拡大の 39 57 日後罹患率と発光強度に関連付けられている高い肺腫瘍負担限界播種性疾患 (データは示されていない) の分析。したがって、我々 は遠隔臓器で前のヴィヴォ剖検時に転移をイメージしました。57 日間の肺腫瘍の負担をした動物、脳、肝臓、腎臓、副腎、および可変周波数 (図 4) で骨後肢など組織の小さな病変も検出できます。したがって、我々 は臨床的に関連性の高いサイトで自発的な播種性疾患は、この同所性同種のメソッドから生成されることを締結します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56650/56650fig1.jpg"> 図 1: メソッドの事前条件の腫瘍細胞の生着のため肺にします。使用されるプロトコルの概略図。肺障害、ブレオマイシン気管内に注入することにより実行されます。LUAD 細胞はそれから後 14 日のマウスの気管に注入されます。その後、発光モニター腫瘍生着、成長および転移のため毎週マウスが作成されます。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56650/56650fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56650/56650fig2.jpg"> 図 2: ブレオマイシンにより一時的な肺線維症と ECM 改造します。ヘマトキシリン-エオシン (H & E) の代表的な画像と車両とブレオマイシンの肺のマッソン ヒアリン染色処理マウス投与 14 日後 (線維症のピーク)、51 日後注入 (線維症解像度) がない場合は腫瘍細胞のインジェクション。スケール バー = 500 μ m.<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56650/56650fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56650/56650fig3.jpg"> 図 3: ブレオマイシンを事前に投与したマウスの複数マウス モデル LUAD 細胞の肺移植が増加します。A) 無胸腺車両やブレオマイシンと前処理をマウスが 5 x 105 H2030 細胞を注入しました。端 (日 35 0 日目投与後に正規化) 相対的な肺腫瘍の負担発光によって測定されるようにプロットされます。各グループの平均腫瘍負荷のマウスが表示されます。n = グループあたり 6-7 マウス。肺のB) 代表 H & E の画像処理をした車両やブレオマイシン A から 35 日で。アスタリスク = 遠位;つ星 = 近位。C) 無胸腺 A のように扱われるマウスは、1 × 105 PC9 細胞を注入しました。腫瘍の負担と代表画像の測定および A. n = グループあたり 7 マウスとして示されています。D~E) B6129SF1/J マウス処理車両またはブレオマイシンが 1 x 10 の5 368T1 を注入したKraG12D/+ p53-/- (KP T 非 Met) 細胞。腫瘍の負担、代表的な画像と H ・ Es の測定およびように描かれている A と B の n = グループあたり 7 マウス。F・G) 車両と前処理を NSG マウスまたはブレオマイシンは 1 × 105 H2030 BrM3 細胞を注入しました。腫瘍の負担、代表的な画像と H ・ Es (9 日目と 10 日目投与後) の測定およびように示されている A と B の n = グループあたり 3-6 マウス。スケール バー = 500 μ m. Inset = 腫瘍細胞にしみ込んで領域の高倍率。インセットのスケールバー = 100 μ m pによって計算された値マンホイットニー検定。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56650/56650fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56650/56650fig4.jpg"> 図 4: ブレオマイシン投与マウスの中にしみ込んで LUAD 細胞が複数の遠隔臓器に転移します。A) 無胸腺車両やブレオマイシンと前処理をマウスが 5 x 105 H2030 BrM3 細胞を注入しました。肺腫瘍の負担は、毎週生物発光を用いて測定しました。0 日に正規化された背総光束が表示されます。B) 腫瘍の端 (投与後 35 日) A から肺の発光で負担します。各グループの平均腫瘍負荷のマウスが表示されます。n = グループあたり 6-7 マウス。C) 検出可能な転移 (左) 剖検時に同じのマウスが付いている器官の代表的なイメージ。エンドポイント (生着後 39 に 57 日間) (右) で遠隔臓器転移を伴うマウスの指定された周波数を持つテーブル。1.5 倍の 10 の4光子上 visual 発光信号とEx vivo臓器/(秒 cm2ステラジアン) 肯定的な転移.に数えられていた<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56650/56650fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>マウス緊張</td>
			<td>ユニット/マウス</td>
		</tr>
<tr>
<td>無胸腺</td>
			<td>0.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>日本板硝子</td>
			<td>0.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>B6129SF1/J</td>
			<td>0.005</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1:リストは、テスト マウス系統のブレオマイシンの用量を推奨します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">マウス緊張</td>
			<td rowspan="2">セルライン</td>
			<td rowspan="2">注入された細胞の数</td>
			<td colspan="2">% 生着</td>
			<td rowspan="2">p値</td>
		</tr>
<tr>
<td>車両</td>
			<td>ブレオマイシン</td>
		</tr>
<tr>
<td>無胸腺</td>
			<td>H2030</td>
			<td>5 x 10 の5
</td>
			<td>0% (0/7)</td>
			<td>100% (6/6)</td>
			<td>0.0006</td>
		</tr>
<tr>
<td>無胸腺</td>
			<td>H2030</td>
			<td>5 x 10 の4
</td>
			<td>n.d.</td>
			<td>85.7% (6/7)</td>
			<td>エヌ ・ エイ</td>
		</tr>
<tr>
<td>無胸腺</td>
			<td>H2030</td>
			<td>5 x 10 の3
</td>
			<td>n.d.</td>
			<td>85.7% (6/7)</td>
			<td>エヌ ・ エイ</td>
		</tr>
<tr>
<td>無胸腺</td>
			<td>PC-9</td>
			<td>1 x 10 の5
</td>
			<td>0% (0/7)</td>
			<td>85.7% (6/7)</td>
			<td>0.0023</td>
		</tr>
<tr>
<td>日本板硝子</td>
			<td>H2030 BrM3</td>
			<td>1 x 10 の5
</td>
			<td>16.7% (1/6)</td>
			<td>100% (3/3) *</td>
			<td>0.0476</td>
		</tr>
<tr>
<td>B6129SF1/J</td>
			<td>368T1</td>
			<td>1 x 10 の5
</td>
			<td>0% (0/7)</td>
			<td>71.4% (5/7) *</td>
			<td>0.0105</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2:指定されたマウス系統、細胞と細胞の数を使用して生着頻度 (%) の概要テーブル。生着は体内の発光イメージングによって決定され、37、50 日後注入間組織の組織学とex vivoイメージングによる確認します。* 正生着は 10 投与後.p値は片側のフィッシャーの正確なテストによって計算される日で体内の発光を確認した.エヌ ・ エイ。n.d. = 断固としたではないです。

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Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment

事前の負傷で気道をコンディショニングすることでマウスの肺に肺癌細胞の同所性同種移植を大幅に強化する手法について述べる。このアプローチは肺微小環境、転移播種、肺癌併存、間質相互作用の研究にも適用可能性があり、派生した異種移植片をより効率的に患者を生成します。

同所性同種肺がん細胞生着の効率を高めるブレオマイシンとマウスの気道をプレコンディショニング

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of ...

pre-conditioning-airways-mice-with-bleomycin-increases-efficiency

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

13.5K ビュー.  Yale University School of Medicine. 事前の負傷で気道をコンディショニングすることでマウスの肺に肺癌細胞の同所性同種移植を大幅に強化する手法について述べる。このアプローチは肺微小環境、転移播種、肺癌併存、間質相互作用の研究にも適用可能性があり、派生した異種移植片をより効率的に患者を生成します。

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Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and standardized not only for the study of allo-rejection but also between syngeneic strains for examining mechanisms of ischemia-reperfusion injury after lung transplantation. Although the application of the rat and other large animal model 2 contributed significantly to the elucidation of these studies, the scope of those investigations is limited by the scarcity of knockout and transgenic rats. Due to no effective therapies for obliterative bronchiolitis, the leading cause of death in lung transplant patients, there has been an intensive search for pre-clinical models that replicate obliterative bronchiolitis. The tracheal allograft model is the most widely used and may reproduce some of the histopathologic features of obliterative bronchiolitis 3. However, the lack of an intact vasculature with no connection to the recipient's conducting airways, and incomplete pathologic features of obliterative bronchiolitis limit the utility of this model 4. Unlike transplantation of other solid organs, vascularized mouse lung transplants have only recently been reported by Okazaki and colleagues for the first time in 2007 5. Applying the basic principles of the rat lung transplant, our lab initiated the obliterative bronchiolitis model using minor histoincompatible antigen murine orthotopic single-left lung transplants which allows the further study of obliterative bronchiolitis immunopathogenesis6.

Obliterative bronchiolitis is the key impediment to the long-term survival of lung transplant recipients and the lack of a robust preclinical model precludes examining obliterative bronchiolitis immunopathogenesis. Unlike other solid organ transplants, vascularized mouse lung transplantation has only recently been developed. Here we show our independently developed obliterative bronchiolitis model after murine orthotopic single-lung transplantation.

同所性肺移植のマウスモデルにおける閉塞性細気管支炎の開発

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

医学

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

マウス肺の病理生理学を研究するための非侵襲的気管内挿管

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which causes significant deterioration in lung function and subsequent death from respiratory failure.
The pathogenesis of IPF in experimental animal models has been induced by bleomycin administration. In this study, we investigate an IPF-like mouse model induced by a double intratracheal bleomycin instillation. Standard histological assessments used for studying lung fibrosis are invasive terminal procedures. The goal of this work is to monitor lung fibrosis through noninvasive imaging techniques such as Fluorescent Molecular Tomography (FMT) and Micro-CT. These two technologies validated with histology findings could represent a revolutionary functional approach for real time non-invasive monitoring of IPF disease severity and progression. The fusion of different approaches represents a step further for understanding the IPF disease, where the molecular events occurring in a pathological condition can be observed with FMT and the subsequent anatomical changes can be monitored by Micro-CT.

We describe a non-invasive multimodal imaging approach based on Micro-CT and fluorescence molecular tomography for longitudinal assessment of the mouse lung fibrosis model induced by double intratracheal instillation of bleomycin.

マウスにおけるブレオマイシン誘発肺線維症の縦断的評価マイクロ CT と蛍光分子トモグラフィーに基づくマルチ モーダル イメージング手法

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

免疫・感染学

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

マウスの気管の迅速な挿管のための改善された方法

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

ブレオマイシンの気管内注射によるマウス肺損傷の誘導

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Mutations in driver genes, that confer cellular fitness, can lead to the development of expanding HSPC clones that increasingly give rise to progeny leukocytes harboring the somatic mutation. Because clonal hematopoiesis has been associated with heart disease, stroke, and mortality, the development of experimental systems that model these processes is key to understanding the mechanisms that underly this new risk factor. Bone marrow transplantation procedures involving myeloablative conditioning in mice, such as total-body irradiation (TBI), are commonly employed to study the role of immune cells in cardiovascular diseases. However, simultaneous damage to the bone marrow niche and other sites of interest, such as the heart and brain, is unavoidable with these procedures. Thus, our lab has developed two alternative methods to minimize or avoid possible side effects caused by TBI: 1) bone marrow transplantation with irradiation shielding and 2) adoptive BMT to non-conditioned mice. In shielded organs, the local environment is preserved allowing for the analysis of clonal hematopoiesis while the function of resident immune cells is unperturbed. In contrast, the adoptive BMT to non-conditioned mice has the additional advantage that both the local environments of the organs and the hematopoietic niche are preserved. Here, we compare three different hematopoietic cell reconstitution approaches and discuss their strengths and limitations for studies of clonal hematopoiesis in cardiovascular disease.

We describe three methods of bone marrow transplantation (BMT): BMT with total-body irradiation, BMT with shielded irradiation, and BMT method with no pre-conditioning (adoptive BMT) for the study of clonal hematopoiesis in mouse models.

クローン造造を研究するマウスにおける骨髄移植手順

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced pulmonary fibrosis.&#160; However, distribution of intratracheally-administered agents to the distal mouse lung is often asymmetric, with lung parenchymal concentrations increased in the smaller (but equally accessible) left lung of the mouse.&#160; Described in this report is a novel intrabronchial (IB) approach to cannulate the left and/or right lungs of living mice non-operatively.&#160; It is also demonstrated how this approach can be used to selectively administer agents to one lung or adapted (via dose-adjusted IB delivery) to improve the left-right symmetry of lung delivery of experimental agents, thereby improving models of diffuse lung disease such as bleomycin-induced pulmonary fibrosis.

Intratracheal (IT) administration of experimental agents in mice often results in asymmetric delivery to the distal lungs.&#160; In this report, we describe a direct intrabronchial (IB) approach to cannulate each lung in living mice non-operatively.&#160; This approach can be used to selectively administer agents to one lung or may be adapted to improve the symmetric agent delivery to both lungs.

マウス肺内の選択的剤沈着を改善するための直接気管支内投与

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced ...

Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

The inflammatory response caused by early lung injury is one of the important causes of the development of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), which is accompanied by the activation of inflammatory cells such as macrophages and neutrophils, as well as the release of inflammatory factors including TNF-&#945;, IL-1&#946;, and IL-6. Early inflammation caused by activated pulmonary interstitial macrophages (IMs) in response to IL-33 stimulation is known to play a vital role in the pathological process of IPF. This protocol describes the adoptive transfer of IMs stimulated by IL-33 into the lungs of mice to study IPF development. It involves the isolation and culture of primary IMs from host mouse lungs, followed by the adoptive transfer of stimulated IMs into the alveoli of bleomycin (BLM)-induced IPF recipient mice (which have been previously depleted of alveolar macrophages by treatment with clodronate liposomes), and the pathological evaluation of those mice. The representative results show that the adoptive transfer of IL-33-stimulated macrophages aggravates pulmonary fibrosis in mice, suggesting that the establishment of the macrophage adoptive transfer experiment is a good technical means to study IPF pathology.

Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

This protocol describes the isolation of pulmonary interstitial macrophages (IMs) and their adoptive transfer after IL-33 stimulation of the lung alveoli in a mouse model, which can facilitate the in vivo study of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF).

IL-33刺激マクロファージのブレオマイシン誘導マウスモデルへの養子導入によるin vivo特発性肺線維症への影響の研究(英語)

The inflammatory response caused by early lung injury is one of the important causes of the development of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), which is ...

A Mouse Model of Pulmonary Fibrosis Induced by Nasal Bleomycin Nebulization

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse models continue to be an important tool for developing new anti-fibrotic strategies. In this study, intrapulmonary administration of bleomycin (BLM) is carried out by nasal nebulization to create a mouse model of pulmonary fibrosis that closely mimics clinical disease characteristics. C57BL/6 mice received BLM (7 U/mL, 30 min/day) by nasal nebulization for 3 consecutive days and were sacrificed on day 9, 16, or 23 to observe inflammatory and fibrotic changes in lung tissue. Nasal aerosolized BLM directly targeted the lungs, resulting in widespread and uniform lung inflammation and fibrosis. Thus, we successfully generated an experimental mouse model of typical human pulmonary fibrosis. This method could easily be used to study the effects of the administration of various nasal aerosols on lung pathophysiology and validate new anti-inflammatory and anti-fibrotic treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>鼻ブレオマイシン噴霧により誘発される肺線維症のマウスモデル

Various animal models of pulmonary fibrosis have been established using bleomycin to clarify the pathogenesis of pulmonary fibrosis and find new drug targets. However, most pulmonary fibrosis models targeting lung tissue have uneven drug administration. Here, we propose a model of uniform pulmonary fibrosis induced by nasal bleomycin nebulization.

鼻ブレオマイシン噴霧により誘発される肺線維症のマウスモデル

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse ...

同所性同種肺がん細胞生着の効率を高めるブレオマイシンとマウスの気道をプレコンディショニング

要約

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同所性肺移植のマウスモデルにおける閉塞性細気管支炎の開発

マウス肺の病理生理学を研究するための非侵襲的気管内挿管

マウスにおけるブレオマイシン誘発肺線維症の縦断的評価マイクロ CT と蛍光分子トモグラフィーに基づくマルチモーダルイメージング手法

マウスの気管の迅速な挿管のための改善された方法

ブレオマイシンの気管内注射によるマウス肺損傷の誘導

クローン造造を研究するマウスにおける骨髄移植手順

マウス肺内の選択的剤沈着を改善するための直接気管支内投与

IL-33刺激マクロファージのブレオマイシン誘導マウスモデルへの養子導入によるin vivo特発性肺線維症への影響の研究(英語)

鼻ブレオマイシン噴霧により誘発される肺線維症のマウスモデル

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同所性同種肺がん細胞生着の効率を高めるブレオマイシンとマウスの気道をプレコンディショニング

要約

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同所性肺移植のマウスモデルにおける閉塞性細気管支炎の開発

マウス肺の病理生理学を研究するための非侵襲的気管内挿管

マウスにおけるブレオマイシン誘発肺線維症の縦断的評価マイクロ CT と蛍光分子トモグラフィーに基づくマルチ モーダル イメージング手法

マウスの気管の迅速な挿管のための改善された方法

ブレオマイシンの気管内注射によるマウス肺損傷の誘導

クローン造造を研究するマウスにおける骨髄移植手順

マウス肺内の選択的剤沈着を改善するための直接気管支内投与

IL-33刺激マクロファージのブレオマイシン誘導マウスモデルへの養子導入によるin vivo特発性肺線維症への影響の研究(英語)

鼻ブレオマイシン噴霧により誘発される肺線維症のマウスモデル

鼻ブレオマイシン噴霧により誘発される肺線維症のマウスモデル

マウスにおけるブレオマイシン誘発肺線維症の縦断的評価マイクロ CT と蛍光分子トモグラフィーに基づくマルチモーダルイメージング手法