この作品は、江蘇自然科学財団 (BK20140919)、清 Lan プロジェクト、中国の国家自然科学基金 (31470375) 優先度学術プログラム開発の江蘇高等教育機関によって支えられました。

1. 植物 (8 週間) の準備
<ol><li>50ベンサミアーナ タバコ種子を 1 mL 5 %naclo と、0.1% トリトン X-100 (V/V) ソリューションおよび種子を殺菌する 5 分を残すを含む 1 つの 1.5 mL 遠心チューブに入れてください。</li>
	<li>リンスの種子滅菌水を 5 回と 200 μ L の滅菌水に種子を中断します。</li>
	<li>慎重に場所個々 の種 MS 寒天培地 (1 l: (KOH) 培地・培塩 10 g スクロース, pH 5.8 × 1 1% 寒天) 罰金のヒントと発芽を同期する 3 日間の 4 ° C で店中板の表面上に。 注: 微生物汚染を避けるためには、クリーン ベンチでこの手順を実行します。滅菌中がチューブを振るする必要はありません。</li>
	<li>10 日間の正常な成長条件 (22 ° C、80-90 µmolm-2の-1白い光強度) の下で中板を置き、土に発芽苗を転送します。 注: は土に苗の根を挿入することを確認し、根に損傷を与えない。透明なプラスチックのカバーで一晩湿度を維持するためにトレイをカバーします。</li>
	<li>16/8 h/明暗サイクルと 70% 湿度制御成長部屋の植物を育てます。7 週齢(名) 形質転換植物Agrobacteriumtumefaciens浸潤 (図 1A) の準備ができています。 注: 水の植物、植物を健康に保つために必要に応じて、害虫を制御します。</li>
</ol>2. (名) ベンサミアーナ葉 (7-10 日) 一過性発現
<ol><li>プラスミドの提供 150 ng (pEGAD HA リュック制御プラスミド、空のベクトル、およびライオンズ クラブ国際協会の構築されたプラスミドを試金、プラスミド構築の pCAMBIA1300 Nluc と pCAMBIA1300 Cluc を使用私たちこの場合) A. 根頭がんしゅ病菌の有能なセルにひずみと GV3101、標準的なエレクトロポレーション法。</li>
	<li>文化A. 根頭がんしゅ病菌ルリア ベルターニカミラ (LB) 寒天培地 (1 l: 10 g 食塩 5 g 酵母エキス 10 g トリプトン寒天培地 1.5%) 含む 50 μ G/ml カナマイシンのと 4 日間の 28 ° c リファンピシンの 50 μ g/mL。 注: 抗生物質の選択は、ベクターと使用A. 根頭がんしゅ病菌系統に依存します。</li>
	<li>1 つを接種してカナマイシンの 50 μ g/mL および 50 μ G/ml のリファンピシンを含む LB 液体培地 3 mL に各板からのA. 根頭がんしゅ病菌のコロニーを単一細胞培養を反映する 24 h 28 ° C で 220 回転で振る。</li>
	<li>15 ミリリットル新鮮な LB 液体培地カナマイシンの 50 μ g/mL および 50 μ G/ml のリファンピシン、200 倍希釈を含むに細菌文化 75 μ L を転送します。外径600 0.5 〜 1.0 の間まで約 8 時間、30 ° C で 220 rpm で細菌の文化.</li>
	<li>15 mL 遠沈管にA. 根頭がんしゅ病菌液体培養を転送、4,000 x g で 4 ° C、15 分破棄上清を遠心し、ペレットを洗浄する変換ソリューションの 15 mL にペレットを中断します。</li>
	<li>4,000 x g で 4 ° C、15 分管を回転し、上澄みを廃棄します。洗浄工程をもう一度繰り返します。</li>
	<li>変換ソリューション 5 mL にペレットを再懸濁します、室温で 2 時間維持します。外径600の最終濃度が 0.5、またはテスト対蛋白質の相互作用のための等しいボリュームとミックスの 2 つのサンプルになるまで変換ソリューションとA. 根頭がんしゅ病菌ペレットの密度を調整します。</li>
	<li>1 mL の無針注射器 (図 1B C) 7回葉に 4番目に浮遊細胞を浸透します。後、黒いプラスチックのカバーで植物をすぐにカバーし、12 時間暗闇の中でトレイを配置します。その後、リュックの活動を検出する前に 2 〜 4 日のいつものように植物を育てます。 注: は、同じようなサイズの健康的な葉を選択します。1 つの葉に 4 つの異なるゾーンの浸透は良いです。</li>
</ol>3. 検出ルシフェラーゼ活性 (1 日)
注意: ルシフェラーゼの活動を監視する 2 つの方法があります。1 つは、イメージングに基づいており、他ルシフェラーゼ活性を定量的に測定することです。
<ol><li>
イメージング法
	<ol>
<li>浸透した葉を外し、MS 寒天培地に全体のチラシを置きます。</li>
		<li>葉の向軸面にルシフェリン作業バッファーを 50 mL スプレー ボトルとスプレーします。クロロフィルの自家蛍光を癒やすための 5 分間暗闇の中で材料を維持します。</li>
		<li>低光の冷却 CCD 画像 (図 2) をキャプチャする装置 (-30 ° C に冷却) をイメージングを使用します。ライト下に露光時間は 50 ms と発光検出時間は 1 分。 注: は、機械のマニュアルによるとパラメーターを調整します。低温はイメージの質を改善する信号対雑音比を向上させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>また、商業ルミノで直接発光を測定します。<ol>
<li>慎重に(名) ベンサミアーナ葉の浸透面積から (約 0.25 cm2) 葉片をカット、白 96 ウェル プレート (図 3) で脱イオン水の 100 μ L にリーフ ディスクを浸します。</li>
		<li>ルシフェリン作業バッファーの 10 μ L を追加し、5 分のまま。タンパク質の相互作用ダイナミクスを研究するための特定の治療法を行います。 メモ: は、特定の治療下でのタンパク質間相互作用の動力学を表すルシフェラーゼ活性ダイナミクスを取得する異なる時点でルミノで発光を検出します。このメソッドには、同時に大量のタンパク質の組み合わせをテストするための利点があります。これらの商業ルミノなし、西部のしみによってルシフェラーゼ タンパク質組成を調べる、したがってリュック活動曲率を参照してください。光が必ずしも必要でない場合は、プレートを留めて、ルミノして異なる時点で発光を測定します。それ以外の場合、検出のギャップの中に成長の部屋にプレートを移動します。統計的に有意な結果を得るためには、少なくとも 3 つの生物学的複製を使用します。異なる浸潤ゾーンからリュック活動が異なりますが、その変化のパターンは正規化後一致しています。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF(COI1)+complex+during+jasmonate+signalling.">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li><li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling.">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li><li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis.">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li><li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map.">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li><li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays.">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li><li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy.">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants.">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li><li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis.">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li><li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+repression+of+photomorphogenesis:+role+switching+of+COP/DET/FUS+in+light+signaling.">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li><li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light.">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li><li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism.">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li><li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis.">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで説明されているプロトコルはシンプルで留学生体内でタンパク質間相互作用、再現性と外因性治療中タンパク質の相互作用ダイナミクスを検出するために特に適して。(名) ベンサミアーナ浸透この試金の重要なステップであります。浸潤の成功を確保するため、植物は非常に健康でなければなりません。もう一つの重要な要因は、浸透後ルシフェラーゼ活性をチェックするタイミングです。この質問に対する正しい答えはありません。研究者は別日時間8変動タンパク質発現レベルを見ましたので、ルシフェラーゼを最高のレベルで表す場合を判断する後でルシフェラーゼ活性を監視することをお勧めします。
いくつかの実験で発光を検出ことがありますはありませんが可能です。適切なコントロールなし、偽陰性を除外されませんでした。フルレングス ルシフェラーゼ コントロールが浸潤およびルシフェラーゼ検出の動作を証明するために必要です。その後、まだ推定される蛋白質の相互作用のペアで発光がない場合、イムノブロットに 1 つまたは 2 つのタンパク質が正常に表現されない場合タンパク質の発現を検出する必要があります。最後の可能性は蛋白質の相互作用が蛋白質立体構造上の理由によりルシフェラーゼ補完を妨げる可能性があります。この場合、蛋白質または N リュックと蛋白質の融合を切り替えに切り捨てを使用してまたは C リュックがこの問題を解決するために参考になります。
プロトプ ラストにも人気が一過性発現、プロトプ ラストとプロトプ ラストの細胞にプラスミド配信の分離特定の専門知識を必要し、大型プラスミド抽出のため有害な CsCl2が必要です。さらに、プロトプ ラストの単離、中に植物が大きく負傷、PPI の試金に影響する可能性があります。
黄金の標準的な分析はありません。私たちの知る限りでは、この簡単に実行されるルシフェラーゼ否定回路試金は有用タンパク質相互作用動態情報を提供できます。もちろん、蛋白質相互作用調査生体内で代替的なアプローチはこれらの結果を確認し、細胞内の生化学的なイベントの理解を深めます。

その環境と成長を調整するために、植物は感覚、変換、およびシグナリングのキューに対応するエレガントなシグナル伝達経路を進化してきました。リレー競技で走者のような蛋白質、植物シグナル伝達に必要な選手です。タンパク質間相互作用 (PPI) が携帯電話通信のための主要な役割を果たしていること広く認識されています。蛋白質のリン酸化、アセチル化、劣化がすべてターゲット蛋白質とその変更の酵素間の物理的な相互作用に依存しています。たとえば、ジャスモン酸 ZIM ドメイン蛋白質 (JAZ) ファミリーのタンパク質は転写因子 MYC2 との対話、その転写活性1,2を抑制します。PPI の重要性を与えられた植物の interactomes がされている大規模なタンパク質検討最近3,4,5です。さらにこれらインタラクトームの結果では、多様な細胞機能を調整する複雑な規制のネットワークを明らかにします。
PPI を監視するためいくつかの確立された方法があります。イースト 2 ハイブリッド (Y2H) 試金は、PPI 検出のため最も広く使用されている方法です。Y2H は、蛋白質の相互作用を調べる簡単なテストに適して行うには、簡単です。Y2H も広く、特定興味の蛋白質のための未知の相互作用パートナーをスクリーニングに使用されます。ただし、Y2H が酵母で実施して完全ので植物の本当のシナリオ細胞し、高い偽陽性率をもたらす反映できません。別の似たような戦略は、プルダウン試金です。一般に、2 つのタンパク質が表明したエシェリヒア属大腸菌のセルから浄化し混合し、蛋白質の相互作用を検出するため固定化します。この方法は時間がかかるが、それを取得できません体内の相互作用の結果か。生体内での相互作用目的のため co-免疫沈降 (co IP) は、最も人気のある試金、高品質 immunoprecipitate 興味の蛋白質に抗体を必要とし、間接 PPIs の可能性を除外することはできません。また、co IP で複雑な実験手順、結果通常の専門性と異なります。
記者による再構成の試金は大きく体内PPI の検出を進めます。蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)6、二分子の蛍光補完 (BiFC)7、イメージング (LCI) 試金8ホタル ルシフェラーゼ補完などの方法。これら 3 つのアプローチが co IP より生体内で直接反映するように PPI、フレット、BiFC 蛍光信号を検出する特定の顕微鏡を必要し、簡単に相互作用強度を定量化することはできません。対照的に、ライオンズ クラブ国際協会はその基質ルシフェリンと反応後光るホタルのルシフェラーゼの活用します。もっと重大に、ルシフェラーゼ活性値から PPI の強さを決定できます。したがって、ライオンズ クラブ国際協会だけではなく 2 つのタンパク質やないとの対話が治療の相互作用ダイナミクスに関する情報も提供するかどうかを示します。10,,の相互作用ダイナミクス (表面プラズモン共鳴または熱安定性変化に基づく)9を監視するためのいくつかの確立された方法がありますがこれらのアプローチは、繊細な楽器や特殊にラベリングを必要があります。対照的に、ライオンズ クラブ国際協会は、検出を行いやすくなっています。
ライオンズ クラブ国際協会のための原則 (N = リュックまたは C = リュックをそれぞれ命名) ルシフェラーゼのアミノ末端とカルボキシル末端の半分は、タンパク質 A と B、およびタンパク質が植物細胞に表現された同時にこれら 2 つの融合と融合しました。タンパク質 A とタンパク質 B やり取り場合、は、アクティブなルシフェラーゼ酵素をルシフェラーゼの 2 つの半分が再構成されるでしょう。ルミノまたは CCD カメラでルシフェラーゼ活性を検出できます。ライオンズ クラブ国際協会; の安定した形質転換体を取得する必要はありません。一過性発現は高品質の相互作用の結果を取得するのに十分です。
リング型 E3 ユビキチン リガーゼ構成 photomorphogenic 1 (COP1) はトランスクリプション要因の無数を操作し、26 s プロテアソーム11を通して彼らの劣化を促進します。これらの COP1 をターゲットとした転写因子のいくつかは、光形態形成過程の正の監督は。暗闇の中、COP1 フィトクロム COP1 E3 活動8を高める A-105 1 (SPA1) の抑制と対話します。光の知覚後、視細胞は COP1 活性を阻害し、安定 COP1 基板12,13,14COP1 SPA1 相互作用を反故します。この例では、PPI を勉強し、PPI ダイナミクスの決定の生物学的意義を示しています。

<table style="border-collapse:collapse;width:686pt" width="915">
	<colgroup>
		<col style="width:293pt" width="390" />
		<col style="width:140pt" width="186" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:114pt" width="152" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Transformation solution</td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td style="width:114pt" width="152"></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">10 mM Morpholineethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900336&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">27.8 mM Glucose</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl18" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">10 mM MgCl2&#215;6H2O</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">150 &#956;M Acetosyringone</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">ALDRICH</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">D134406&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">pH 5.7</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Luciferin working buffer</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56" style="height:42.0pt">
			<td class="xl17" height="56" style="width:293pt;height:42.0pt" width="390">5 mM Luciferin potassium salt</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">0.025% Triton X-100</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl17" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">H2O to 10 ml</td>
			<td class="xl21"></td>
			<td class="xl21"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics

蛋白質蛋白質の相互作用が最も細胞プロセスのシグナル伝達を中継するための基本的なメカニズムしたがって、新規タンパク質間相互作用のペアとタンパク質の相互作用ダイナミクスを監視の同定植物が環境要因および/または発達の信号に応答する方法を明らかにするため特に重要です。アプローチの茄多は、生体外でまたは生体内で蛋白質蛋白質の相互作用を調べるために開発されています。中でも、イメージング (LCI) 最近設立されたルシフェラーゼ補完アッセイは、体内のタンパク質-タンパク質相互作用を示すため最も簡単で最速の方法です。この分析では、蛋白質または蛋白質 B は、ルシフェラーゼのアミノ末端あるいはカルボキシ末端の半分と融合それぞれ。タンパク質 A とタンパク質 B やり取り、ルシフェラーゼの 2 つの半分が機能とアクティブなルシフェラーゼ酵素を形成する再構成されるでしょう。ルシフェラーゼ活性はルミノまたは CCD カメラで記録できます。LCI 分析他のアプローチと比較して、タンパク質-タンパク質相互作用定性的と定量的の両方を示しています。アグロバクテリウムベンサミアーナ タバコ葉の浸潤は、一時的な蛋白質の表現のため広く使われているシステムです。ライオンズ クラブ国際協会と一過性発現の組み合わせ、これらのアプローチは COP1 と SPA1 の間の物理的な相互作用にジャスモン酸治療後徐々 に短縮されたことを示します。

3 つの主要なステップは蛋白質蛋白質の相互作用生体内で植物の成長、タバコ浸潤、およびルシフェラーゼ アッセイを含む留学このルシフェラーゼ補完プロトコルで白羽できます。このプロトコルの最も重要なステップは、 (名) ベンサミアーナ葉 (図 1) に液体A. 根頭がんしゅ病菌を浸透させています。
ジャスモン酸 COP1 SPA1 相互作用を減らすことを確認この方法の有用性の例です。COP1 と融合したルシフェラーゼのアミノ末端とカルボキシル末端の半分 (COP1-NLuc) または SPA1 (CLuc SPA1)、それぞれ。COP1 SPA1 相互作用の機能的なルシフェラーゼの相補性の結果します。(図 2)、CCD カメラによるイメージを作成したルシフェラーゼ活性とルミノ (図 3) の酵素活性を検出できます。自体、ルシフェラーゼの可能性を除外する処理による影響は、フルレングス ルシフェラーゼ (リュック) 遺伝子はまた、一時的コントロールとして機能する(名) ベンサミアーナ葉で表されます。ジャスモン酸治療 (時間 0) 前にルシフェラーゼ アクティビティが 1 として設定され、ジャスモン酸治療下で得られた各ルシフェラーゼ活性値だった正規化時間相対ルシフェラーゼ活性 (図 4) を取得する場合は 0。結果は、COP1 SPA1 相互作用 (ルシフェラーゼ活性によって反映される) 徐々 に減少、暗闇の中でことを示した、JA 治療はさらにその相互作用を低減します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56641/56641fig1.jpg"> 図 1.(名) ベンサミアーナ浸透のプロセス。 (A) Abaxial および浸潤の前に植物の向軸ビュー。(B)浸潤プロトコルを表示する代表的なイメージ。(C) Abaxial と浸潤後の植物の向軸ビュー。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56641/56641fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56641/56641fig2.jpg"> 図 2.CCD カメラでルシフェラーゼ活性をイメージングします。 (A)通常光線の下で(名) ベンサミアーナ一葉の代表的なイメージ。(B)検出発光信号 CCD カメラ ルシフェラーゼの活動を表示します。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56641/56641fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56641/56641fig3.jpg"> 図 3。からの発光を測定する方法を示す代表的なイメージ カット リーフ ディスク。  浸透したリーフ ディスクはカットされ、発光信号測定に白 96 ウェル プレートに入れ。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56641/56641fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56641/56641fig4.jpg"> 図 4.1 過渡 luciferase 否定回路試金から代表を結果します。 (A)治療期間 (時間) と発光値 (LUC 活性) の元の結果が表示されます。各サンプルの 3 つの独立した複製があります。このグラフを準備するため別の治療時点で LUC 活性が相対的なリュック活動として時間 0 正規化。 (B)暗闇の中で徐々 に COP1 SPA1 相互作用を示す相対リュック活動の定量化が減少して、JA、さらに処理を減らすことができます。エラーバーは標準偏差 (sd) を示します。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56641/56641fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

本稿では、ルシフェラーゼ活性の測定に基づく蛋白質蛋白質の相互作用を決定するための簡単かつ迅速な実験手順について説明します。

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

luciferase-complementation-imaging-assay-nicotiana-benthamiana-leaves

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

13.8K ビュー.  Nanjing Normal University. 本稿では、ルシフェラーゼ活性の測定に基づく蛋白質蛋白質の相互作用を決定するための簡単かつ迅速な実験手順について説明します。

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Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

ウイルス誘導ジーンサイレンシング（VIGS）でタバコbenthamianaとトマト

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

生物学

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ヘリオス遺伝子銃を用いたタマネギの細胞における蛋白質 - 蛋白質相互作用のための二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

イメージングタンパク質間相互作用 in vivoで</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

中のタンパク質 - タンパク質相互作用を特定する<em&gt;ショウジョウバエ</emタンデムアフィニティー精製（TAP）による&gt;アダルトヘッド

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

ジャガイモとニコティアナベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーションとPVXアグロパネクチ

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

ベンサミアーナタバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼイメージング