本研究は、経済産業省と SAF2016 78898 C2 2 R. スペイン政府の競争力 (MINECO) からの助成金によって支えられました。

両方のスペインの規制 (ロイヤル令 53 2013 - 法 32/2007) に従い、本研究を行ったとケアと生物医学研究における動物の使用に関する欧州連合の指針 (ディレクティブ 2010年/63/EU).
 1。ラットの準備 注: 任意のホルモンの変化を避けるためにラットで実験を行った.
<ol><li>塩酸ケタミン (30 mg/kg) およびキシラジン塩酸塩 5 mg/kg を筋肉内注入の; この用量でミックスを使用して動物ラットがある深く麻酔約 1 h. の麻酔</li>
	<li>ピンチ ラット &#39; s つま先; 不在撤退の反射は完全に意識されていないことを示します。ラットは、ピンチに応答する場合は、初期投与量の 3 分の 1 で補助麻酔を与える</li>。
	<li>頭皮を剃るし、消毒ポビドン ヨード剤外科領域</li>。
	<li>は 38 ° C の温度を維持し、動物を安定させるために加熱パッドに動物を配置 &#39; s 頭脳定位固定フレーム 2 つ耳バーと一口バーを使用します。耳バーで鼓膜の穿孔を避けるために注意を使用します</li>。
	<li>ゲル状目薬または血清生理食塩水のドロップをそれぞれの目に適用することにより、目を保護します</li>。
</ol> 2。ラットの頭骨で AC の位置 <ol><li>、メスを使用すると、頭蓋骨を公開し、頭蓋骨の表面を覆う骨膜を撤回する正中線に沿って切開します</li>。
	<li>前、ラムダ、およびラット脳 22 の Paxinos とワトソンのアトラスによると両耳間 0 を視覚化する頭蓋骨の表面を覆っている血を取り除きます滅菌綿棒を使用します</li>。
	<li>は、メスと頭蓋骨における背側挿入の近く一時的な筋に切開を行います。針と縫合材料を使用して筋を引き、定位脳手術フレーム; 縫合材料を修正これは、側頭骨が公開されます。出血が発生した場合は冷滅菌生理食塩水ですすいでください</li>。
	<li>が完全に確保されているかどうかを確かめて、定位マイクロマニピュレーターで滅菌のストレート針を配置します</li>。
	<li>は、針の先端が耳 0 に設定されるよう、頭蓋骨の表面の真上まで針をゆっくりと下ろします。ゼロとしてこの点を設定し、この点から座標を決定します</li>。
	<li>興味の脳領域、によって定位座標が異なります。ラット脳 22 の Paxinos とワトソンのアトラスを利用して、これらの座標を決定します。座標が決まったら、それらの座標に合わせて針の移動します</li>。
	<li>は、次の 4 つのポイントの座標を使用して AC をターゲット: a: A/P =-5.80 mm M/L = ± 6.4 mm;B: A/P =-2.7 mm, M/L = ± 6.4 mm;C: A/P =-2.7 mm, M/L = 8.67 mm +/-D: A/P =-5.8 mm, M/L = ± 8.67 mm。 低い各これら 4 つのポイントを視覚化する頭骨の上右に針。マーカー ペンを使用して、側頭骨上の点をマークし、; 四角形を描画するためにそれらを接続四角形の骨 ( 図 1) のウィンドウに開くにはガイドとなる</li>。
</ol> 3。AC の外科的露出 <ol><li>オープン電気ドリルと小型のドリルを使用してウィンドウのビット (0.6 mm Ø)。骨を与えるまでは、8,000 rpm で四角形の境界をドリルします。皮質下構造物への損傷を防ぐため冷滅菌生理食塩水で洗浄して掘削面を冷やします。骨がくずれるとき、抵抗を検出できます。脳ドリルしないように注意してください</li>。
	<li>ボーダーがゆるんでいる微細鉗子で覆って骨をプルアップし、冷滅菌生理食塩水で保管しています</li>。
</ol> 4。AC のアブレーション <ol><li>手術顕微鏡 (10 倍) を使用して優しく顕微鏡ナイフで髄膜をカットし、2 つの細かい指摘鉗子を使用してそれらを削除します。出血が発生した場合は冷滅菌生理食塩水ですすいでください</li>。
	<li>には、AC 滅菌 20 G 鈍い先端針に結合手術吸引装置 (圧力-0.24 バー) を使用して優しく吸い出しなさい。この点は重要であり非常に慎重に実行する必要があります: 吸引のみ六つの皮質層と基になる白質ありません</li>。
	<li>穿通動脈が出血を止めるまで吸引します</li>。
	<li>吸引が終了したら、抽出された骨で傷つけられた区域をカバーし、吸収性止血ガーゼを適用します</li>。
	<li>は、側頭筋、元の位置を回復し、傷クリップ (9 mm) を使用して皮膚を縫合しましょう。抗生物質軟膏を適用 (材料の表 を参照してください)。3 日間 1 日 2 回の傷口に軟膏を適用し続ける 。
	メモ: 各アプリケーション、薄い層を傷に適用されます</li>。
	<li>ラット (0.05 mg/kg)、手術後鎮痛 1 h と 72 h の中に、すべての 8 h の後ろに皮下注入ブプレノルフィン</li>
	<li>、目覚めるまで加熱パッドの動物を維持し、回復するその住宅ケージに戻ります</li>。
	<li>は、ケージ仲間が縫合の領域に触れるを防ぐために個別に動物の家、いくつか強化アイテムを提供します。、感染を防ぐため、慎重に、動物が正常に回復して、不快感の任意の兆しを見せていないをチェックして毎日のおがくずを変更します。</li>
</ol> 5。組織コレクション 注意: 個人保護用具 (PPE) を着用し、安全キャビネットを使用してパラホルムアルデヒド (PFA)、固体と水の両方を処理する場合。
 注: 4% (w/v) PFA x リン酸緩衝液 (PBS) 熱 (55 ° C) を使用して 1 を溶解することにより 750 mL ホルムアルデヒド溶液を準備します。ろ紙をホルムアルデヒド溶液をフィルター処理します。リンガーを準備 &#39; 8.5 g nacl、KCl、1,000 mL の水に 0.2 g NaHCO 3 0.25 g を溶解することにより s ソリューション (pH = 6.9).
<ol><li>は、調査のため必要な限り生き残る動物をしましょう。AC 蒸散ラットで研究が完了したら、ペントバルビ タール ナトリウム (60 mg/kg) の 0.1 mL の腹腔注入による anaesthetize それ末期。つま先のピンチと逃避反射の不在によって麻酔の深さを評価します</li>。
	<li>動物は麻酔が深く、リンガーの 125 mL の心腔内灌流 23 を実行 &#39; s ソリューションは 1.8 mm の針ゲージを使用してホルムアルデヒド溶液の 750 mL に続いて内径</li>。
	<li>シンチグラムが終了したら、最初の頚椎でラットの首をはねる</li>。
	<li>は、皮膚を削除し、頭から筋にはさみを使用し、頭蓋骨を公開します。はさみを使って切り取り、後頭を開くし、頭蓋の後部を削除します</li>。
	<li>は、スペンサーのはさみを使用して軌道の骨切り、脳を公開する頭蓋骨の上端に沿ってカットする rongeurs を使用して横断を確認します。脳に損傷を与えないように注意してください</li>。
	一度脳を公開すると、<li>は、細かい指摘の鉗子を用いた硬膜を慎重に取り外します。そっと下をスクープし、脳に指を使用します。脳の発生し、神経 unt をカットイルは無料です。ホルムアルデヒド溶液で脳を浸すし、24 時間の 4 ° C で保存</li>
</ol> 6。AC 病変の局在 <ol><li>ポスト固定後慎重に脳の外側面を公開する矢状ラット脳行列に脳を配置します</li>。
	<li>21 cm 上記カメラを配置して皮質表面のカメラ ホルダーを使用して、選択、&#34; スーパー マクロ撮影 &#34; モード、および脳の表面の写真撮影</li>。
	<li>脳の背側表面を公開するコロナ ラット脳マトリックスに脳を配置し、別の写真を撮ます</li>。
	<li>イメージ エディター プログラムを使用すると、画像を開くし、彼らと仕事を容易にする 50% に縮小します。前、ラムダ、および Paxinos とワトソン座標 19, によると画像の両耳間 0 参照を識別し、写真 ( 図 2) の位置をマークします。脳の外側の画像上、アブレーションの輪郭を描画します。境界を計算します</li>。
	<li>インポート座標は、プライマリ (A1) と AC のセカンダリ領域 (背・腹側皮質) がある 18 写真使用して、エディター プログラムのファイルにマップします。地図上をクリックし、蒸散脳の外側の写真を重ね合わせてドラッグします。
	<ol><li>前を行いラムダ参照座標マップの外側の脳の画像で識別される前とラムダの参照と一致します</li>。
		<li>マップに脳の画像を調整する参照として嗅裂を使用し、( 図 2 b) を一致させます</li>。
	</ol></li> <li>計算交流によって占有される領域を基準にして病変の割合</li></ol>

<ol>
	<li>Talwar, S. K., Gerstein, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+frequency+discrimination+in+the+white+rat.">Auditory frequency discrimination in the white rat.</a> Hear Res. 126 (1-2), 135-150 (1999).</li><li>Heffner, H. E., Heffner, R. S., Contos, C., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Audiogram+of+the+hooded+Norway+rat.">Audiogram of the hooded Norway rat.</a> Hear Res. 73 (2), 244-247 (1994).</li><li>Malmierca, M. S., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+System.">Auditory System.</a> The Rat Nervous System. , 995-1080 (2004).</li><li>Delano, P. H., Elgoyhen, A. 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著者らは、調査した潜在的な利益相反として解釈される可能性が商業や金融関係の不在を宣言します。

成功脳外科の蝶番 2 つの要因: 中と手順の後に生きている動物を維持、関心のある領域を正確に検索します。非耳毒性抗生物質は生存を助けるべきであること、ラット (逃避反射をテスト)、手術中に麻酔が深く、十分な鎮痛薬を受け取るを確認します。さらに、ラットは、それは低体温症を避けるために麻酔から目覚めるまで加熱パッドに保持されるべき。感染症への感受性は減る縫合と適切な技術が重要です: 動物はタイトな十分な傷にあまりテンションをかけることがなく除去を防ぐために注入したする必要がありますので、彼らの傷のクリップで迎え。
AC (または他の皮質領域) を正確に特定する前、ラムダ、および対象地域の制限を計算するための参照として使用する両耳間 0 の位置を決定することが重要です。座標の計算に間違いは、AC の部分切除やその他の周辺地域の不要な吸引になります。したがって、針の先端がだけ両耳間 0 で骨に触れるしがこのプロトコルの説明によると前後とメディオ水平座標に変換します。
本稿では、公開し、AC のアブレーション手術方法も説明しました。3 つの重要なステップがあります: 穴あけ加工、開口部および髄膜, と吸引によりアブレーションの除去。掘削する必要があります実行最小圧力と低速で高切削速度近くの皮質下構造に影響を与えることができる熱を生成します。ただし、低速を維持し、冷却冷滅菌生理食塩水で掘削エリアは、損害を防ぐ必要があります。さらに、最低気圧は頭蓋骨と基になる皮質への後の負傷の突然の中断を避けるために不可欠です。開閉カバー AC 髄膜の除去は、血管を破壊を避けるために慎重に行う必要があります。出血が発生した場合、初期と後期の予後はおおむね良好とそのような動物が信頼性の高い研究の包含の規準を満たしているかどうかは疑問であります。我々 はこの場合は安楽死をお勧めします。最後に、(おそらく効果的な病変の最も困難な面)、誤嚥は灰白質に制限する必要があります。白質の存在を検出するを助けることができる 2 つの指標がある: (1) 白質として、色のコントラストの変更、灰色の物質よりも明るいそして (2) 穿通動脈からの出血の停止。
脳のいずれかの操作が実行された後、ローカリゼーション、サイズ、およびその後の分析および動物から得られたデータの検証のための皮質で行われたプロシージャの拡張機能を評価するために必要です。本稿では、グループ18に記載された座標マップを用いた皮質でアブレーションをローカライズする方法を詳しく説明します。このマップは、組織学的セクション、ラット脳22の Paxinos とワトソンのアトラスとの相関のシリアル セクション再建から得られる解剖学的参照を使用して構築しました。したがって、マップはプライマリ (A1) と AC の二次野 (背と腹) によって区別します。この座標のマップの主な利点は、病変の迅速な同定が矢状脳マトリックスは、脳の外側面から撮影した画像を重ね合わせによりです。別の利点は解剖学の経験の少ない所が彼らの動物モデルに適合させることによってマップを使用できます。脳内灌流制御前、ラムダ、および両耳間 0 参照の間の距離を設定し、マップを拡大縮小する必要があるだけ切り上げまたは切り捨て。マップに脳の画像を調整するのにには、参照として嗅裂を使用します。脳組織切片に決定する必要がありますので、この座標のマップでは、アブレーションの深度を決定できません。
定位法 AC の手術手技との組み合わせは、ラットでは、AC をターゲットしたい任意の捜査によって簡単に合わせることができる基本的な方法です。これは急性実験または永続的なデバイスの注入が必要なのかもしれません。さらに、AC の外科的アブレーション使用されています以前モデルとして公聴会における慢性皮質剥奪の効果を研究します。AC 試練は、一方的な AC 試練他の皮質領域で発揮したり、ストロークのモデルとしての効果を研究にも使用できます。したがって、ここで説明した実験的デザインは、個別に、または実験的デザインの広い範囲に組み合わせに適用できる便利なメソッドです。

ラットは、聴覚神経で最も一般的に使用される動物のモデルの一つです。その動作の堅牢性はそれに 1 日試験の何百ものために働くことができます。その感度と聴覚1,2、および他の哺乳類の3に匹敵する、中央のシステムの解剖学的および機能的な組織のスペクトル視力するラットの広い範囲を分析するための適切な動物モデル聴覚神経科学における最近の研究テーマします。ラット聴覚野 (AC)、特に、構造、組織、および音声処理3の役割を理解しようとしているいくつかの解剖学的および生理学的な研究の対象とされています。今日では、AC は経験依存性可塑性、聴覚、シナプス受容野組織的、聴覚、皮質下で音の処理の皮質コントロールに興味がある神経科学者の間で人気となっています。核4,5,6,7,8,9。これらの新しいアプローチをもたらす課題に対応するには、研究活動を迅速に行う手順を正確に特定でき、外科的 AC を公開します。定位技術は生理学検査せず脳内の特定の領域にローカライズするやすくなります。動物の脳の大きさはわずかに変化するが、ラット脳頭蓋のランドマークから設定定位座標を使用して脳領域の任意の位置を決定できます。
制限された AC のアブレーションは、最も直接聴覚関連皮質の感覚領域の外科的切除です。対照的に他の方法は、冷却またはローカル リドカイン注射10、11,12, 慢性の損失関数の結果を AC の外科的切除など、AC の活動をブロックするために使用します。したがって、AC 試練は皮質の剥奪の長期的な影響だけでなく、病変の可塑性の後続の現象を勉強に適しています。AC の外科的試練定位法の組み合わせは、皮質コントロール剥奪13,14,15 の生理学的な行動、および分子の効果を研究する正常に使用されています ,16,17,18,19。たとえば、聴覚驚愕反射と聴性脳幹反応 (ABR)16の皮質切除の効果を研究する二国間 AC 試練とラットのモデルが使用されています。最近では、我々 は負傷18後 ABR 閾値、振幅、異なる時点での待ち時間でラット AC 農産物の二国間の試練対その片側の効果を比較しています。さらに、制限の AC のアブレーションのラットのモデルはまた劣った collicus13,14,15と内耳17 の鈴木経路変性の影響を研究する使用されています、19。脳のような操作の実行後、ローカリゼーション、サイズ、および大脳皮質の病変の拡張機能を評価するために必要なです。非常に有用な細胞応答20,21に基づく, 純音に反応マップの主な制限がラットの脳における聴覚のフィールドを検索するために必要な電気生理学的手法。以来、すべてではない所があるそのような録音をするための専門知識の必要な機器や、脳の表面の18のイメージに AC のウズラ限界の転送に基づく座標マップを構築しました。このマップは、生理学のテストを行わず、AC を検索する非常に便利なできます。
この議定書では、改良導かれた場所、手術手技、ラットでは、AC のアブレーションの方法について説明します。また、私たちの座標マップ18を使用して蒸散の頭脳の表面の画像上病変の拡張機能を簡単にローカライズする方法について説明します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf Ins.</td>
			<td>900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>WILD M650 Heerbrugg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>DAGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental micromotor</td>
			<td>W&#38;H elco</td>
			<td>5118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond burr</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>GD021R</td>
			<td>0.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suction device</td>
			<td>Atmos</td>
			<td>Atmoforte E2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Merial</td>
			<td></td>
			<td>30 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SM-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Lawton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td>Meda</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile saline serum</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G sterile needle</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture material</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Ointment</td>
			<td>Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>10.331.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Indivior UK</td>
			<td>Buprex</td>
			<td>0.01-0.05 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>08.120.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spencer scissor</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>08.804.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Lawton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical knife</td>
			<td>MSP</td>
			<td>7503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable hemostatic gauze</td>
			<td>Surgicel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saggital rat Brain Matrix</td>
			<td>Activational systems Inc.</td>
			<td>RBM-1000DV / RBM 4000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td></td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Olympus 5.1 MP</td>
			<td>C-5060 wide zoom</td>
			<td>lens F2.8-4.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips</td>
			<td>Reflex 9</td>
			<td></td>
			<td>9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canvas 12</td>
			<td>ACD Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle gauge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>diameter 1.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separatory funnel</td>
			<td>labbox</td>
			<td>11409</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA2 primer Forward</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_017261</td>
			<td>CGGCAGCTCAGCTAAAAACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA2 primer Reverse</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_017261</td>
			<td>TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA3 primer Forward</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_032990</td>
			<td>ATTGCTGATGGTGCAATGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA3 primer Reverse</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_032990</td>
			<td>TTTGCATTGTCGCAAGTCTC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactically-guided ablation of the rat auditory cortex, and localization of the lesion in the brain

ラット聴覚野 (AC) は経験依存性可塑性、聴覚の知覚・認識過程と音聴覚皮質下核処理の制御に興味を持っている聴覚神経科学研究者の間で人気になっています。新しい対処する課題を正確に特定するための手順と手術公開聴覚皮質研究のこの努力を促進すると。定位脳神経は針や聴覚皮質内のあらかじめ定義された位置に電極を接がに動物モデルにおける前臨床研究で使用します。次のプロトコルでは、斬新な方法で定位メソッドを使用します。我々 は、両方プライマリ (A1) を正確に公開を開いたら、ウィンドウを定義するラットの temporal bone、この方法を使用する交流のセカンダリ (背と腹) 野の表面に 4 つの座標点を識別、行いますし、手術AC のアブレーション。このような操作を実行すると、ローカリゼーション、サイズ、および大脳皮質の病変の拡張機能を評価するために必要です。したがって、AC のウズラ限界を脳の表面に転送することによって構築された座標のマップを使用して AC のアブレーションの死後を簡単に見つける方法についても述べる.改良導かれる場所と座標マップの死後、患部のローカライズの AC のアブレーションの組み合わせ、動物から得られる情報の検証を容易にしよりよい分析につながるとデータの理解。

3 ラット改良導かれた場所、手術手技、AC の一方的なアブレーションを行った。病変の局在を確認 3 つの試練が実行されるラット、AC (プライマリ、背側と腹側皮質) の主要な下位区分を侵入し、AC 面積 (図 2 b) の 80 から 100% の範囲で構成されています。
AC の厳しい試練を実行するここで説明されたプロトコルは、皮質聴覚核における大脳皮質コントロール剥奪の長期的な影響だけでなく、可塑性の後続の現象を研究する研究室で以前使用されています。生理 (ABR) を適用することによって検証された AC 試練のプロトコルこれらの研究行動 (応答を驚愕、prepulse 阻止;PPI), 分子 (DNA マイクロ アレイ、qPCR と西部のしみ) 方法13,14,15,16,17,18,19。ここでは、プロトコルの有効性を示すためには、1 週間を乗り切る 3 つの AC のアブレーション ラットをさせてし、収集組織コレクション中に蝸牛ステップ大人の蝸牛に存在の最も関連性の高い AMPA サブユニットの発現の変化の検討、GluA2、GluA3、qPCR による。AC から成績比較アブレーション ラットおよびすべての手術のプロセスがない皮質切除を行ったシャム対照動物は、GluA2、およびアップ規制ダウン規制を示した GluA3 の両方の蝸牛 (図 3) で、これは私たちの前に一致して研究19。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig1.jpg"> 
図 1: 3 つの異なる手術の手順でラット頭骨のイメージ。(A) の転送は、AC の定位座標の頭骨。4 つのポイントの座標は、: a: A/P =-5.8 mm, M/L = ± 6.4 mm;B: A/P =-2.7 mm, M/L = ± 6.4 mm;C: A/P =-2.7 mm, M/L = 8.67 mm +/-D: A/P =-5.8 mm, M/L = ± 8.67 mm. (B)、座標はウィンドウの開口部をガイドする、側頭骨の表面に四角形を描画する参照として使用されます。(C) 掘削後骨の開かれたウィンドウを示しています。血管と髄膜は脳の表面に観察できます。R: 吻側、d: 背側。<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56429/56429fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig2.jpg"> 
図 2: ラット脳の病変を検索するための手順です。(A) (Paxinos とワトソン座標19) によるとラムダと前改良注入針と AC のアブレーション脳の背側表面の写真。点線は、脳の背側表面のように前と Interaural 0 9 cm × 9 cm グリッド内の位置をマークします。AC の座標の地図を重ね合わせた蒸散脳の外側面の (B) の写真。病変の境界は、図の赤で表示されます。AC 領域の境界は、地図で黒で表示されます。この例では、AC での占有面積に対する AC のアブレーションの割合は、84.79% です。AC: 聴覚野、IA: 聴覚間 FR: 嗅裂。<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56429/56429fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig3.jpg"> 
図 3: 片側 AC 試練 7 日後病変の後の AMPA 受容体サブユニット GluA2 と GluA3 の mRNA のレベルで変更します。結果は、フォールドの変更の平均 ± 標準偏差として掲載されています。GluA2 成績の変更は青色で表されます。GluA3 成績の変更は赤で表示されます。GluA2 の大幅な減少と GluA3 の増加は両方の蝸牛で観察される (歯髄およびアブレーションに対側)、手術後 7 日目ないの皮質の試練と偽のコントロールを基準にしてこれは私たちの以前の結果19と一致しています。<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56429/56429fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

改良導かれるアブレーションのラット聴覚野と脳の病変の局在

改良導かれる場所、露出、およびラットの大脳皮質聴覚野のアブレーション法について述べる。アブレーションのローカリゼーションは、座標マップ死後を使用して評価されます。

The rat auditory cortex (AC) is becoming popular among auditory neuroscience investigators who are interested in experience-dependence plasticity, ...

stereotactically-guided-ablation-rat-auditory-cortex-localization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Behavior

11.5K ビュー.  University of Salamanca. 改良導かれる場所、露出、およびラットの大脳皮質聴覚野のアブレーション法について述べる。アブレーションのローカリゼーションは、座標マップ死後を使用して評価されます。

ビデオ: Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

の定位注入マイクロRNA発現マウス海馬CA1領域にレンチウイルスと行動アウトカムの評価

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

行動学

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific genes in encoding experience is one of the main objectives of molecular neuroscience. Furthermore, the functional association of defined genes with specific behaviors has implications for understanding the basis of neuropsychiatric disorders. Induction of robust transcription programs has been observed in the brains of mice following various behavioral manipulations. While some genetic elements are utilized recurrently following different behavioral manipulations and in different brain nuclei, transcriptional programs are overall unique to the inducing stimuli and the structure in which they are studied1,2.
In this publication, a protocol is described for robust and comprehensive transcriptional profiling from brain nuclei of mice in response to behavioral manipulation. The protocol is demonstrated in the context of analysis of gene expression dynamics in the nucleus accumbens following acute cocaine experience. Subsequent to a defined in vivo experience, the target neural tissue is dissected; followed by RNA purification, reverse transcription and utilization of microfluidic arrays for comprehensive qPCR analysis of multiple target genes. This protocol is geared towards comprehensive analysis (addressing 50-500 genes) of limiting quantities of starting material, such as small brain samples or even single cells.
The protocol is most advantageous for parallel analysis of multiple samples (e.g. single cells, dynamic analysis following pharmaceutical, viral or behavioral perturbations). However, the protocol could also serve for the characterization and quality assurance of samples prior to whole-genome studies by microarrays or RNAseq, as well as validation of data obtained from whole-genome studies.

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

行動経験に続いて脳試料からの転写動態の網羅的解析

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Infant Auditory Processing and Event-related Brain Oscillations

Rapid auditory processing and acoustic change detection abilities play a critical role in allowing human infants to efficiently process the fine spectral and temporal changes that are characteristic of human language. These abilities lay the foundation for effective language acquisition; allowing infants to hone in on the sounds of their native language. Invasive procedures in animals and scalp-recorded potentials from human adults suggest that simultaneous, rhythmic activity (oscillations) between and within brain regions are fundamental to sensory development; determining the resolution with which incoming stimuli are parsed. At this time, little is known about oscillatory dynamics in human infant development. However, animal neurophysiology and adult EEG data provide the basis for a strong hypothesis that rapid auditory processing in infants is mediated by oscillatory synchrony in discrete frequency bands. In order to investigate this, 128-channel, high-density EEG responses of 4-month old infants to frequency change in tone pairs, presented in two rate conditions (Rapid: 70 msec ISI and Control: 300 msec ISI) were examined. To determine the frequency band and magnitude of activity, auditory evoked response averages were first co-registered with age-appropriate brain templates. Next, the principal components of the response were identified and localized using a two-dipole model of brain activity. Single-trial analysis of oscillatory power showed a robust index of frequency change processing in bursts of Theta band (3 - 8 Hz) activity in both right and left auditory cortices, with left activation more prominent in the Rapid condition. These methods have produced data that are not only some of the first reported evoked oscillations analyses in infants, but are also, importantly, the product of a well-established method of recording and analyzing clean, meticulously collected, infant EEG and ERPs. In this article, we describe our method for infant EEG net application, recording, dynamic brain response analysis, and representative results.

High-density electroencephalography (dEEG) is being used increasingly to study brain development and plasticity in the early years of life. Here we present an application of sophisticated analysis techniques that builds on traditional EEG recording to understand the oscillatory dynamics of rapid auditory processing in the infant brain.

幼児聴覚処理とイベント関連の脳の振動

Rapid auditory processing and acoustic change detection abilities play a critical role in allowing human infants to efficiently process the fine spectral ...

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure multiple dimensions of unconditioned behavior in small laboratory mammals (e.g., mice, rats, tree shrews and small primates). This paradigm is a valuable alternative for the use of a behavioral test battery, since a broad behavioral spectrum of an animal&#8217;s behavioral profile can be investigated in one single test.
The apparatus consists of a box, representing the &#8216;protected&#8217; area, separated from a group compartment. A board, on which small cylinders are staggered in three lines, is placed in the center of the box, representing the &#8216;unprotected&#8217; area of the set-up. The cognitive abilities of the animals can be measured by baiting some cylinders on the board and measuring the working and reference memory. Other unconditioned behavior, such as activity-related-, anxiety-related- and social behavior, can be observed using this paradigm. Behavioral flexibility and the ability to habituate to a novel environment can additionally be observed by subjecting the animals to multiple trials in the mHB, revealing insight into the animals&#8217; adaptive capacities.
Due to testing order effects in a behavioral test battery, na&#239;ve animals should be used for each individual experiment. By testing multiple behavioral dimensions in a single paradigm and thereby circumventing this issue, the number of experimental animals used is reduced. Furthermore, by avoiding social isolation during testing and without the need to food deprive the animals, the mHB represents a behavioral test system, inducing if any, very low amount of stress.

This protocol describes the modified hole board, which is a behavioral test set-up that comprises the characteristics of an open field and a traditional hole board. This set-up enables the differential analysis of unconditioned behavior of small laboratory mammals as well as the analysis of cognitive abilities.

変更された穴会は - マウスとラットにおける行動、認知と社会的相互作用を測定する

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

ツールとしての迷走神経刺激は、絶滅の学習のための関連経路の可塑性を誘導するために

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation to the Unilateral Hemisphere of Rat Brain

Previous rodent models of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) adopted whole-brain stimulation instead of unilateral hemispheric rTMS, which is unlike the protocols used for human subjects. We report a successful application of rTMS to the unilateral hemisphere of rat brain. The rTMS was delivered with a low-frequency (1 Hz), high-frequency (20 Hz), or sham stimulation protocol to one side of the brain by using a small 25-mm figure-8 coil. We placed the center of the coil 1 cm lateral to the vertex on the biauricular line and angulated the coil 45&#176; to the ground to minimize a potential direct effect of rTMS on the contralateral cortex. We also used an in-house water cooling system to enable repetitive magnetic stimulation for more than 20 min, even at a 20-Hz stimulation frequency. Increases in the transcriptions of immediate early genes (Arc, Junb, and Egr2) were greater after rTMS than after sham stimulation. After 5 consecutive days of 20-min 1-Hz rTMS, bdnf mRNA expression was significantly higher in stimulated cortex than in contralateral side. The model presented herein will elucidate the molecular mechanisms of rTMS by allowing analysis of the inter-hemispheric difference in its effect.

We applied repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) to the unilateral hemisphere of rat brain, by placing a 25-mm figure-8 coil 1 cm lateral to the vertex on the biauricular line and angulating the coil by 45&#176;. An in-house water cooling system was used for rTMS for more than 20 min.

ラットの脳の片側半球に反復経頭蓋磁気刺激

Previous rodent models of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) adopted whole-brain stimulation instead of unilateral hemispheric rTMS, ...

Using Eye Movements Recorded in the Visual World Paradigm to Explore the Online Processing of Spoken Language

In a typical eye tracking study using the visual world paradigm, participants' eye movements to objects or pictures in the visual workspace are recorded via an eye tracker as the participant produces or comprehends a spoken language describing the concurrent visual world. This paradigm has high versatility, as it can be used in a wide range of populations, including those who cannot read and/or who cannot overtly give their behavioral responses, such as preliterate children, elderly adults, and patients. More importantly, the paradigm is extremely sensitive to fine grained manipulations of the speech signal, and it can be used to study the online processing of most topics in language comprehension at multiple levels, such as the fine grained acoustic phonetic features, the properties of words, and the linguistic structures. The protocol described in this article illustrates how a typical visual world eye tracking study is conducted, with an example showing how the online processing of some semantically complex statements can be explored with the visual world paradigm.

The visual world paradigm monitors participants' eye movements in the visual workspace as they are listening to or speaking a spoken language. This paradigm can be used to investigate the online processing of a wide range of psycholinguistic questions, including semantically complex statements, such as disjunctive statements.

眼球運動の視覚世界のパラダイムに記録を使用して話されていた言語のオンライン処理を探索するには

In a typical eye tracking study using the visual world paradigm, participants' eye movements to objects or pictures in the visual workspace are recorded ...

An Instrumented Pull Test to Characterize Postural Responses

Impairment of postural reflexes, termed postural instability, is a common and disabling deficit in Parkinson's disease. To assess postural reflexes, clinicians typically employ the pull test to grade corrective responses to a backward perturbation at the shoulders. However, the pull test is prone to issues with reliability and scaling (score/4). Here, we present an instrumented version of the pull test to more precisely quantify postural responses. Akin to the clinical test, pulls are manually administered except pull force is also recorded. Displacements of the trunk and feet are captured by a semi-portable motion tracking system. Raw data represent distance traveled (in millimeter units), making subsequent interpretation and analysis intuitive. The instrumented pull test also detects variabilities influencing pull test administration, such as pull force, thereby identifying and quantifying potential confounds that can be accounted for by statistical techniques. The instrumented pull test could have application in studies seeking to capture early abnormalities in postural responses, track postural instability over time, and detect responses to therapy.

Impairment of postural reflexes, termed postural instability, is difficult to quantify. Clinical assessments such as the pull test suffer issues with reliability and scaling. Here, we present an instrumented version of the pull test to objectively characterize postural responses.

姿勢反応を特徴付けるインストルメント化されたプル テスト

Impairment of postural reflexes, termed postural instability, is a common and disabling deficit in Parkinson's disease. To assess postural reflexes, ...

Transcranial Direct Current Stimulation for Online Gamers

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive brain stimulation technique that applies a weak electric current to the scalp to modulate neuronal membrane potentials. Compared to other brain stimulation methods, tDCS is relatively safe, simple, and inexpensive to administer.
Since excessive online gaming can negatively affect mental health and daily functioning, developing treatment options for gamers is necessary. Although tDCS over the dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) has demonstrated promising results for various addictions, it has not been tested in gamers. This paper describes a protocol and a feasibility study for applying repeated tDCS over the DLPFC and neuroimaging to examine the underlying neural correlates in gamers.
At baseline, individuals who play online games report average weekly hours spent on games, complete questionnaires on addiction symptoms and self-control, and undergo brain 18F-&#64258;uoro-2-deoxyglucose positron emission tomography (FDG-PET). The tDCS protocol consists of 12 sessions over the DLPFC for 4 weeks (anode F3/cathode F4, 2 mA for 30 min per session). Then, a follow-up is conducted using the same protocol as the baseline. Individuals who do not play online games receive only baseline FDG-PET scans without tDCS. Changes of clinical characteristics and asymmetry of regional cerebral metabolic rate of glucose (rCMRglu) in the DLPFC are examined in gamers. In addition, asymmetry of rCMRglu is compared between gamers and non-gamers at baseline.
In our experiment, 15 gamers received tDCS sessions and completed baseline and follow-up scans. Ten non-gamers underwent FDG-PET scans at the baseline. The tDCS reduced addiction symptoms, time spent on games, and increased self-control. Moreover, abnormal asymmetry of rCMRglu in the DLPFC at baseline was alleviated after tDCS.
The current protocol may be useful for assessing treatment efficacy of tDCS and its underlying brain changes in gamers. Further randomized sham-controlled studies are warranted. Moreover, the protocol can be applied to other neurological and psychiatric disorders.

We present a protocol and a feasibility study for applying transcranial direct current stimulation (tDCS) and neuroimaging assessment in online gamers.

オンラインゲーマーのための経頭蓋直流刺激

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive brain stimulation technique that applies a weak electric current to the scalp to modulate ...

Assessing the Coherence of Parents' Short Narratives Regarding their Child Using the Five-Minute Speech Sample Procedure

Valid and efficient measures for assessing the quality of parent-child relationships are needed to facilitate research and evidence-based practice with parents. This paper focuses on such a method, namely Five-Minute Speech Sample-Coherence (FMSS-Coherence). In this method, a parent is asked to speak for five uninterrupted minutes about her/his child and their relationship. The resulted narrative is coded for coherence, namely the extent to which the parent provides&#160;in the narrative&#160;a clear, consistent, multidimensional and well-supported portrayal of the child. FMSS-Coherence is based on attachment research that shows that the coherence of parents&#8217; narratives is indicative of the quality of the parent-child relationship and child adjustment. It overcomes the limitations of attachment narrative measures which are typically labor intensive. FMSS-Coherence is less nuanced than extant attachment narrative measures. Yet, studies of families from different cultural backgrounds, across different child ages and in the context of typically developing children as well as children with special needs suggest that coherence can be reliably evaluated using the FMSS procedure. Furthermore, parents&#8217; FMSS-Coherence is associated with parenting quality and children&#8217;s socio-emotional adjustment. Thus, it holds promise for researchers and practitioners who seek a relatively time- and cost-effective method for assessing the coherence of parents&#8217; narratives regarding their child.

This paper introduces a method for assessing the coherence of parents' short narratives regarding their child and their relationship using the five-minute speech sample procedure.

5分間の音声サンプル手順を用いた子どもに関する親の短い物語の一貫性の評価

Valid and efficient measures for assessing the quality of parent-child relationships are needed to facilitate research and evidence-based practice with ...