この作品はイスラエル科学財団 (グラント 748/14) でサポートされている、マリー キュリーの統合 (CIG) を付与 - FP7 人 20013 CIG 618763 とコア計画と予算委員会とイスラエル科学財団のプログラム許可第 41/11。

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ここで記述されている ATAC seq プロトコルは一次電池でアクセス可能なクロマチンの分析のため正常に採用されている (ヒト th1 細胞、Th2 細胞、B 細胞) 培養細胞株 (MCF10A ひと乳癌細胞と U261 神経膠芽腫細胞) だけでなく。ATAC seq を他の細胞型に適用すると、散のステップを中心に、いくつかのプロトコルの最適化が必要です。非イオン性洗剤の濃度が高すぎる、ミトコンドリアの DNA 汚染の割合が高いがあります。これは、核の収量を低下させることがなく換散バッファーの洗剤濃度を減らすことで削減できます。我々 の経験では、洗剤の 0.05% の換散バッファーは、最も満足な結果を与えた。さらに、固定角ロータ 500 は、ペレット内のミトコンドリアを削減する G フォースを減らすことを許可ではなくスイング バケツで核を回転します。研究者は、洗剤、たとえば、ジギトニン17の他の種類をテストも可能性があります。ただし、最適化された溶解条件があっても、ミトコンドリア Dna の汚染は避けられないです。MtDNA を完全に削除するには、CRISPR/Cas9 システムは使用される15をすることができます。この場合、ATAC seq ライブラリはターゲットと Cas9 ヌクレアーゼ mtDNA15を消化するために sgRNAs と孵化させます。
この ATAC seq プロトコル (100,000) に必要な核の数は、臨床検体からの携帯番号が不足している7の場合に制限があります。ATAC seq 大きさが正常に変更された 5,000 と 500 セル1,13,17まで反応ボリューム1,13を減らすことによって列の代わりに磁気ビーズを使用してクリーンアップを実行します。13、またはクリーンアップ手順1を回避します。さらに、個々 の核16を分離するマイクロ流体デバイスを用いた単一細胞 ATAC seq (scATAC-seq) を実行可能性があります。特に、DNase seq と seq、放任などのクロマチン アクセシビリティを測定する他の方法より多くの原料と、実験を行うために数日を必要とします。
今、NGS 各種で先入観が共通現象25感謝広く。異質染色質アクセシビリティ対策の変化の原因の一つは酵素ステップ25です。DNase 私は胸の谷間バイアス26を示しています、胸の谷間の好みだけでなく、27を Tn5 トランスポザーゼに表示される今、それを示されています。幸いなことに、潜在的なバイアスは、吉林省28など品質管理のパイプラインを使用して計算識別できます。バイアスの別の一般的な原因は、PCR 増幅ステップ20,25です。これよく GC リッチの増幅用バイアス フラグメント25として、明示します。バイアスは、PCR 増幅のステップごとに増加、以来、9 追加サイクル (N) を ATAC seq ライブラリの最終的な PCR 増幅我々 超えていません。
Tn5 トランスポザーゼと核の間の適切な比率は、成功の ATAC seq2にとって重要です。酵素の過剰アクセスできない軌跡と高いバック グラウンドの「転調」の上、に 。これは qPCR 品質管理手順でネガティブ コントロール領域の高増幅に反映されます。核の過剰は、「下転調」に 。この場合、遠く胸の谷間のサイトは少ない断片の PCR 増幅とロウ ・ ライブラリーの複雑さになります。核の数を正確に決定するには、セル換散後、転位反応の前にカウントの追加の手順を導入しました。
転写制御因子遺伝子の特定の場所での活動が可能と、クロマチン接近性、重要なエピジェネティックな規制層です。したがって、アクセス可能なクロマチン プロファイル内で DNA シーケンス可能な転写因子の数十の id とターゲット遺伝子座についての情報の富を提供します。RNA 発現 (ATAC seq によって得られる) この情報を組み合わせるチップ seq13,22によってさらに分析することができます関連する転写因子の焦点をできます。さらに、疾患に関連する遺伝子多型の 10% だけは、コーディングのゲノム30。したがって臨床サンプルに ATAC seq を適用する (例えばで全身性エリテマトーデス8) 病気の状態の遺伝子の規則に影響を与える規制の要素にさらされている非コーディングの亜種を発見できます。この ATAC seq プロトコルを支援し、この強力なメソッドを使用して、研究を進めるために興味がある研究者を奨励すると思います。

ATAC seq1,2は、ヌクレオソームの配置規制3クロマチン領域の同定を可能にする堅牢な方法です。この情報は、場所、id、および転写因子の活性を推定のために適用されます。クロマチン構造の定量的変化の測定法の感度では、クロマチンの remodelers 修飾子と RNA ポリメラーゼ II1の転写活性を含むクロマチン因子の活性の検討をことができます。したがって ATAC seq は興味の任意のセル型の転写制御を支配するメカニズムを解読するため強力かつ公平なアプローチを提供します。ATAC seq の主なヒト th1 細胞や Th2 細胞への適応について述べる。
ATAC-seq に非常に活発の Tn5 トランスポザーゼはアダプター (すなわち、「tagmentation」プロセス)1DNA のタグ付けされた次世代シーケンサー (NGS) カップル DNA 断片化アダプターを搭載。得られた DNA ライブラリー PCR 増幅、次次世代シーケンス (図 1) の準備ができました。アクセス可能なクロマチンの優遇の tagmentation は、ATAC seq 配列読み取りのローカル富の分析によって検出されます。
短い実験手順とクロマチン アクセシビリティと DNase seq4、放任 seq5、および MNase seq6などヌクレオソームの位置を測定するための他の方法を基準にして以下の原料のための要件は、します。人間の一次電池1,7臨床サンプル8と同様と単細胞生物9植物10、ショウジョウバエ11 を含む複数の生物学的システムでは ATAC seq の使用を促進と様々 な哺乳類12。
アクセスの軌跡にバインドされている要素は、バインド シーケンス モチーフの濃縮を分析または高スループット DNA シーケンス (続いてクロマチン免疫沈降 (チップ) と ATAC seq を組み合わせることで発見ことができます転写の idChIP-seq)。このアプローチは、マウス13での造血機構の重要な系統特異的転写因子の同定を有効にします。ATAC seq の公平かつグローバルな性質をチップ解析のための抗体などの試薬が利用できない有機体の遺伝子の規則を勉強することができます。Cis 諸国における進化バリエーションなど-初期マウス規制要素の発達的変動からヒトとチンパンジー14、頭部神経堤細胞の研究によって識別された規制地域胚15日は単細胞C. owzarzakiのライフ サイクル中に規制動向の変化9、およびプロモーターやエンハンサー1220 の哺乳類の種の間での進化。
ATAC seq はまた単一細胞におけるクロマチン アクセシビリティ通常ゲノム研究7,16を忌避する細胞集団内でこのように明らか変動を測定するため尽力されています。さらに、サンプルはまれな病態での遺伝子制御領域で発生した変更を勉強する ATAC seq を使用できます。急性骨髄性白血病 (AML)17またはRasの発症時規制の風景の変化を研究する ATAC seq を使用できますたとえば、-発癌11を駆動します。

mapping genome-wide accessible chromatin in primary human t lymphocytes by atac-seq

高スループット シーケンス (seq ATAC) とトランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイは、クロマチンのオープン (アクセス) 領域の識別に使われる方法です。これらの地域は、転写因子をバインド規制の DNA 要素 (例えばプロモーター、エンハンサー、軌跡のコントロール領域、絶縁体) を表します。アクセス可能なクロマチン風景をマッピングは、ゲノム全体で暴くアクティブ規制要素の強力なアプローチです。この情報は、関連する転写因子ネットワーク、遺伝子発現プログラムを制御するクロマチン構造のメカニズムを発見するための公平なアプローチとして機能します。ATAC seq は DNase の堅牢な代替私過敏性解析は次世代シーケンス (seq DNase) とクロマチンのゲノム解析のため規制要素 (放任 seq) のホルムアルデヒドによる分離と相まってアクセシビリティと micrococcal のヌクレアーゼ感受性サイト ヌクレオソームの配置を決定する (MNase seq) の塩基配列の決定。人間の主な免疫細胞すなわちcd4 リンパ球に最適化した詳細な ATAC seq プロトコルを提案 (T ヘルパー 1 (Th1) と Th2 細胞)。この包括的なプロトコル細胞収穫始まるクロマチン tagmentation、次世代シーケンシングの前処理の分子プロシージャを記述し、方法および計算の分析するために使用に関する考慮事項も含まれます結果を解釈します。さらに、時間とお金を節約するシーケンスの前に ATAC seq ライブラリを評価する品質への取り組みを紹介します。重要なは、このプロトコルで説明した原則は、他のひと免疫系と非免疫細胞と細胞への適応を許可します。これらのガイドラインは次世代シーケンシング方法と熟練ではない研究所の役に立ちます。

このプロトコルの最終的な結果は、通常 3-20 ng/μ L の ATAC seq ライブラリです。DNA ・ インテグリティ解析のシステムで実行すると (材料/機器のテーブル参照)、はしごのような外観2 (図 3 a) を見せます。DNA のフラグメントの平均サイズは通常 〜 450 530 bp です。
次世代シーケンスを実行する前に ATAC seq ライブラリの適切な品質管理は、時間とお金を節約することが重要です。ライブラリを次世代シーケンサー (NGS) に適した我々 検討ポジティブ コントロールの濃縮が以上 25 〜、75 倍 (プライマーのペアが 3、4、それぞれ) を見せるとネガティブ コントロール (図 3 b) を基準にして、前述のヌクレオソーム、はしごのような外観。正と負のコントロール プライマーの Cq 値はテンプレートとしてゲノム DNA と反応に似ており、Cq の (ATAC seq DNA との反応による負の制御領域の値をまた確認しています qPCR データを分析する場合フラグメント) が実験.間で一定たとえば、Cq 値が突然低い場合我々 は核以上転置された、ヘテロクロマチン領域からの DNA のフラグメントあり過大代表される容疑者します。また、ATAC seq ライブラリのゲル画像 (高感度テープ ベースの電気泳動によって得られた) はアダプターの存在を示す場合 (~ 120 bp)、過度の DNA 分解 (フラグメントの大半が 〜 200 bp)、または大規模なフラグメント (1 kb 以上) 我々NGS の手順に続行できませんでしょう。
さらに、我々 は常にライブラリあたり 1000 万読み取り目指して初期 NGS を実行します。ライブラリがより深くシーケンス処理される場合はこのシーケンスの結果は満足 (FastQC レポート ファイル内のすべてのパラメーターを渡し、ピークの呼び出しを実行した後 1000-2000 ピークを取得できます)、(以上 3000 万読み取り/ATAC seq ライブラリ)。
ATAC seq に実験哺乳類セルの任意の場所から 〜 シーケンスされた読み取りの 30-70% が mtDNA10から来ることができます。対照的に、我々 のライブラリには、ミトコンドリアのゲノムにマップ 6-20% の読み取りが含まれています。これはヒト cd4 陽性 T リンパ球1ATAC seq ライブラリで報告された 46% より低いです。読み取りを汚染を排除した後 700 万のユニークな読み取りを参照の人間のゲノム (58-91% すべての読み取り) へのマッピングも残っていた。0.1 - 200 万ヒット (6.8%-12% のすべての読み取り) は、ATAC seq ピーク (図 4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56313/56313fig1.jpg"> 
図 1.実験手順のワークフロー。主要な表現の手順この ATAC seq プロトコル。停止ポイントは黄色の六角形で示されます。省略可能な手順は、オレンジ色の六角形で表されます。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56313/56313fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56313/56313fig2.jpg"> 
図 2.PCR サイクル ATAC seq ライブラリの最終強化に必要な数の追加の計算します。赤、青、ピンクの 3 つの異なる ATAC seq ライブラリの PCR 増幅曲線が表示されます。増幅反応 2,350 RFU (上部の緑の水平線) のプラトーに達した。追加の PCR のサイクルの数は 783 RFU (2,350/3) 増幅曲線と交差します。(赤と青) の 2 つのライブラリは、3 番目のライブラリ (ピンク) 9 サイクルが必要です、8 追加の増幅サイクルを要求します。非テンプレート コントロール (NTC) は、下の緑の線として表示されます。X 軸、サイクル数。Y 軸、RFU ユニット。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56313/56313fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56313/56313fig3.jpg"> 
図 3.ATAC seq ライブラリの品質管理分析します。(A) 増幅 ATAC seq ライブラリのテープ ・ ベース自動電気泳動の結果。L、はしご。A ~ D、生物のライブラリは、th1 細胞や Th2 細胞から繰り返されます。(B) ATAC seq ライブラリの qPCR 品質管理を分析。ゲノム DNA および 4 つの ATAC seq ライブラリは、陰性対照のプライマー (1 および 2) および肯定的な制御のプライマー (3 と 4) により増幅しました。ATAC seq ライブラリ (青) の得られた値は、ゲノム DNA の増幅レベルが正規化された最初 (1; の値を任意に設定赤)。その後、肯定的な制御領域の値は、陰性対照の地域 (下表) に正規化されました。#1 と 2 のライブラリは、NGS シーケンスに送られました。値を表す平均 ± SEM.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56313/56313fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56313/56313fig4.jpg"> 
図 4.ゲノム ブラウザー snapsh th1 細胞や Th2 細胞にアクセス可能なクロマチン領域の ots 。NFKB1、 6 月、 CD28、 IFNG (th1 細胞でのみ表現) とIL4 th1 細胞や Th2 細胞 (2 生物ごとに繰り返し) IL13 (Th2 でのみ表される) 座の ATAC seq トラックが表示されます。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56313/56313fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
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	<tbody>
		<tr>
			<td>TD バッファー</td>
			<td>50</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDE1 トランスポザーゼ</td>
			<td>5</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ヌクレアーゼ フリー水</td>
			<td>45</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>総容積</td>
			<td>100</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1:転位反応混合物の調製します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATAC seq ライブラリ</td>
			<td>15</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>プライマー 1 (Ad1_noMx) *</td>
			<td>2.5</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>		<tr>
			<td>プライマー 2 *</td>
			<td>2.5</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext 高フィデリティ 2 PCR マスター ミックス * x</td>
			<td>25</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ヌクレアーゼ フリー水</td>
			<td>5</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>総容積</td>
			<td>50</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">* 各プライマーの最終濃度は 1.25 μ M です。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">* * PCR 試薬キットの提供はお勧めしません</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">(Buenrostro et al., 2015。ATAC-seq: クロマチン接近性ゲノムを試金法)。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">さらとの成功の拡大も行った。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">NEBNext Q5 ホット スタート HiFi PCR マスター ミックス (拡張温度は 65 ° C)。</td>
		</tr>
	

表 2: 最初の PCR の反作用の組合せ (ステップ 5.1.1。) のコンポーネントです。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>サイクルのステップ</td>
			<td>温度</td>
			<td>時間</td>
			<td>サイクル</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>拡張子 *</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>5 分</td>
			<td rowspan="2">1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>初期変性</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>変性</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>アニール</td>
			<td>63 ° C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>拡張機能</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>3 分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ホールド</td>
			<td>4 ° C</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* この手順は両方を拡張する必要</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">転位反応後プライマーの端。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
テーブル 3:PCR の最初のライブラリ増幅 (ステップ 5.1.2。) サイクリング条件
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCR の反作用 (ステップ 4.1.1) の分注 *</td>
			<td>5</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>プライマー 1 (Ad1_noMx) * *</td>
			<td>1</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>入門 2</td>
			<td>1</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x SYBR マスター ミックス * * *</td>
			<td>7.5</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ヌクレアーゼ フリー水</td>
			<td>0.5</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>総容積</td>
			<td>15</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">* DNA テンプレートの代わりに、非テンプレート コントロール超純粋な水を追加します。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">* * 各プライマーの最終濃度は 417 nM。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">QPCR の最寄りのマスターの組合せを使用します。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">それは、蛍光染料、MgCl2、dNTPs ポリメラーゼを含める必要があります。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 4: qPCR 反応混合物 (ステップ 5.2.2) の準備。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>サイクルのステップ</td>
			<td>温度</td>
			<td>時間</td>
			<td>サイクル</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>初期変性</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>変性</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>アニール</td>
			<td>63 ° C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>拡張機能</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>3 分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ホールド</td>
			<td>4 ° C</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 5: 循環の増幅サイクル (N) (ステップ 5.2.3。) の付加的な数の qPCR による評価のための条件
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>サイクルのステップ</td>
			<td>温度</td>
			<td>時間</td>
			<td>サイクル</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>初期変性</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>変性</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>アニール</td>
			<td>63 ° C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>拡張機能</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>3 分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ホールド</td>
			<td>4 ° C</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 6: サイクリング最終 PCR 濃縮のステップ (ステップ 5.3) のための条件です。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">シングル PCR 反応。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ゲノム DNA の図書館の希釈</td>
			<td>2.5</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 μ M プライマー F (F1 または f2 キーまたは f3 キー F4) *</td>
			<td>0.3</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 μ M プライマー R (R1 または R2 や R3 や R4) * *</td>
			<td>0.3</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x SYBR マスター ミックス * * *</td>
			<td>5</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ヌクレアーゼ フリー水</td>
			<td>1.9</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>総容積</td>
			<td>10</td>
			<td>Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">* 反応混合物に各プライマーの最終濃度が 300 nM。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">* * 場合、R プライマー R1 などあるべきよりも F1 のプライマーを使用して。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">研究室では、qPCR 楽器に適したのマスター ミックス × 2 を優先使用します。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 7: 反応条件 QC 解析 (ステップ 7.1.3。)。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">ターゲット</td>
			<td>サンプル</td>
			<td>Cq を意味します。</td>
			<td>Cq SEM</td>
			<td>相対的な量</td>
			<td>正規化</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="4">ネガティブ コントロール</td>
			<td>ATAC seq</td>
			<td>30.39</td>
			<td>0.11</td>
			<td>1</td>
			<td>1.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gDNA</td>
			<td>30.4</td>
			<td>0.16</td>
			<td>0.99</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td>ATAC seq</td>
			<td>30.3</td>
			<td>0.18</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gDNA</td>
			<td>30.34</td>
			<td>0.09</td>
			<td>0.99</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">3</td>
			<td rowspan="4">肯定的な制御</td>
			<td>ATAC seq</td>
			<td>23.27</td>
			<td>0.03</td>
			<td>1</td>
			<td>173.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gDNA</td>
			<td>30.7</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.01</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">4</td>
			<td>ATAC seq</td>
			<td>21.55</td>
			<td>0.24</td>
			<td>1</td>
			<td>750.31</td></tr></tbody></table>強い >
		
		<tr>
			<td>gDNA</td>
			<td>31.1</td>
			<td>0.03</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	

表 8: ネガティブ コントロール (ステップ 7.1.5。) 肯定的な統制の濃縮の計算。

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Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

高スループット シーケンス (seq ATAC) と相まってトランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイは、アクセス可能なクロマチンを明らかにするゲノム広い方法です。これは最終的な計算の分析は、人間のリンパ球 (Th1 ・ Th2) 用に最適化する分子からのステップバイ ステップ ATAC seq プロトコル。このプロトコルは、次世代シーケンシング法の経験なしの研究者採用できます。

ATAC Seq による主なヒト T リンパ球のゲノム広いアクセス可能なクロマチンをマッピング

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

17.9K ビュー.  Bar-Ilan University. 高スループット シーケンス (seq ATAC) と相まってトランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイは、アクセス可能なクロマチンを明らかにするゲノム広い方法です。これは最終的な計算の分析は、人間のリンパ球 (Th1 ・ Th2) 用に最適化する分子からのステップバイ ステップ ATAC seq プロトコル。このプロトコルは、次世代シーケンシング法の経験なしの...

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Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

DNA含有量測定法による哺乳類の複製タイミングのゲノムワイドな決意

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

遺伝学

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV integration sites can be used as functional markers of active regulatory elements. Here, we present a retroviral scanning tool, which allows the genome-wide identification of cell-specific enhancers and promoters. Briefly, the target cell population is transduced with an mLV-derived vector and genomic DNA is digested with a frequently cutting restriction enzyme. After ligation of genomic fragments with a compatible DNA linker, linker-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) allows the amplification of the virus-host genome junctions. Massive sequencing of the amplicons is used to define the mLV integration profile genome-wide. Finally, clusters of recurrent integrations are defined to identify cell-specific regulatory regions, responsible for the activation of cell-type specific transcriptional programs.
The retroviral scanning tool allows the genome-wide identification of cell-specific promoters and enhancers in prospectively isolated target cell populations. Notably, retroviral scanning represents an instrumental technique for the retrospective identification of rare populations (e.g. somatic stem cells) that lack robust markers for prospective isolation.

Here, we describe a protocol for genome-wide mapping of the integration sites of Moloney murine leukemia virus-based retroviral vectors in human cells.

レトロウイルススキャン：細胞特異的調節領域を定義するためのMLV統合サイトのマッピング

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ours, have demonstrated that quiescence is associated with widespread changes in gene expression. Some of these changes occur through changes in the level or activity of proliferation-associated transcription factors, such as E2F and MYC. We have demonstrated that mRNA decay can also contribute to changes in gene expression between proliferating and quiescent cells. In this protocol, we describe the procedure for establishing proliferating and quiescent cultures of human dermal foreskin fibroblasts. We then describe the procedures for inhibiting new transcription in proliferating and quiescent cells with Actinomycin D (ActD). ActD treatment represents a straightforward and reproducible approach to dissociating new transcription from transcript decay. A disadvantage of ActD treatment is that the time course must be limited to a short time frame because ActD affects cell viability. Transcript levels are monitored over time to determine transcript decay rates. This procedure allows for the identification of genes and isoforms that exhibit differential decay in proliferating versus quiescent fibroblasts.

We describe a protocol for generating proliferating and quiescent primary human dermal fibroblasts, monitoring transcript decay rates, and identifying differentially decaying genes.

ひと線維芽細胞の増殖静止ゲノムワイドな転写減衰率を決定します。

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

しっかりと段階的な初期のショウジョウバエの胚からゲノムワイドなクロマチン構造キャプチャ ライブラリの生成

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

プロモーター キャプチャこんにちは-c: 高解像度, ゲノム プロモーターの相互作用のプロファイリング

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

クロマチンのループ構造の再編を CRISPR 媒介

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible chromatin. In this paper we present an improved ATAC-seq protocol that reduces contaminating mitochondrial DNA reads. While previous ATAC-seq protocols have struggled with an average of 50% contaminating mitochondrial DNA reads, the optimized&#160;lysis buffer introduced in this protocol reduces mitochondrial DNA contamination to an average of 3%. This improved ATAC-seq protocol allows for a near 50% reduction in the sequencing cost. We demonstrate how these high-quality ATAC-seq libraries can be prepared from activated CD4+ lymphocytes, providing step-by-step instructions from CD4+ lymphocyte isolation from whole blood through data analysis. This improved ATAC-seq protocol has been validated in a wide range of cell types and will be of immediate use to researchers studying chromatin accessibility.

Here, we present a protocol to perform an assay for transposase-accessible chromatin sequencing (ATAC-seq) on activated CD4+ human lymphocytes. The protocol has been modified to minimize contaminating mitochondrial DNA reads from 50% to 3% through the introduction of a new lysis buffer.