本研究は、スイスの全米科学財団 (SNSF、グラント号 320030_156193) によって支えられました。著者は、Biosilon マイクロ ・ キャリア ビーズを提供を博士 Benoît Werlen をありがちましょう。私たちはまたマイクロ ・ キャリア ビーズ モデルの設定のヘルプについて教授ハンス ・ ピーター ・ コーラーと教授アンドレ ・ Haeberli をありがちましょう。

ドイツ ランドレース (野生型トランスジェニック ・地元農家で飼育繁殖動物育種の研究所でバイオ テクノロジー、ルートヴィヒ ・ マクシミリアン大学ミュンヘン、ドイツ)、重さ 30 kg ~ 40 kg の間で使用されていた本研究では。すべての動物は、水や食料 アドリブ で標準的な条件の下で収容されました。ケア、実験動物の使用、スイスの動物保護法の英国動物法 (科学的なプロシージャ) および NIH ガイドに従ってすべての動物実験を行った。すべての動物の研究は到着ガイドラインに遵守します。州の獣医サービス (カントンのベルン、スイス) の動物実験委員会はないすべての動物の手続き、許可を承認しました。BE70/14。実験プロトコルは 3 r の原則によると洗練された、最新の麻酔・疼痛管理は、動物の数を最小限に抑え、実験動物のストレスや痛みへの暴露を減らす使用された。
 ベルン大学病院のスイスの司法権および倫理ガイドラインに従ってクローズド システム静脈穿刺による健全な個人から血が描かれました。フレーズ &#34; 非高血圧症血 &#34; 血液の抗凝固剤と扱われていないことを意味します。
 無菌条件下で次の手順を実行します。基本の細胞培養生殖不能の技術と知識が必要です。
 1 PAEC 分離 注: 6 を 10 cm の大動脈セグメントは 3 〜 6 ヶ月歳 (他の 生体内で 実験に使用)、すぐに安楽死させたドイツ在来種豚から得られた。輸送培地 (DMEM + 1% ペニシリン/ストレプトマイシン) を含む 500 mL ガラス瓶の中に転送します。
<ol><li>プレコート フィブロネクチン 12.5 μ g/ml の PBS 1 で 6 ウェル プレート x 1 h. の 37 ° C でインキュベーターで配置と</li>
	<li>滅菌 PBS をあらかじめ温める 1 x および細胞培養培地 (DMEM).</li>
	<li>輸送培地からのブタの大動脈を取り出す</li>。
	<li>ポリスチレンの版の大動脈を配置します</li>。
	<li>事前優しく温かみのある PBS でフラッシュします</li>。
	<li>大動脈を縦にカットし、針で固定します</li>。
	<li>内槽表面の暖かい細胞培養液を追加します</li>。
	<li>フィブロネクチン細胞培養培地を吸引し、新鮮な細胞培養培地 (DMEM 10 %fbs、1% ペニシリン/ストレプトマイシン内皮細胞成長培地補足ミックスの 0.4% と) を追加します</li>。
	<li>は、細胞培養培地で 1 つの綿棒を浸します。綿棒内側容器表面の一番上綿の芽は優しく、ゆっくりと同じ方向にします</li>。
	<li>ラウンドでラウンド 6 ウェル プレートのウェル 1 個の細胞をこする</li>。
	<li>井戸の残りの部分で同じ操作を行います</li>。
	<li>顕微鏡下で細胞を確認し、37 ° c、5% CO 2 インキュベーターで 6 ウェル プレートを配置します</li>。
	<li>2 日目媒体を変更し、また 2-3 日おきに変更します</li>。
	<li>細胞は合流する予定です、セルを trypsinize、T75 フラスコ (PAEC P1) にそれらを播く</li>。
</ol> 2。PAEC 特性 <ol><li>プレコート フィブロネクチン 12.5 μ g/ml の PBS 1 で 8 ウェル chamberslide x 1 h. の 37 ° C でインキュベーターで配置と</li>
	<li>5 × 10 4 細胞/ウェルをシードし、37 でインキュベーターで一晩インキュベート ° C</li>
	<li>+ + (CaCl 2 MgCl 2 と補われる PBS)、PBS で 2 回細胞を洗って 300 μ L/ウェル</li>。
	<li>200 μ L/ウェル、室温で 10 分の 3.7% パラホルムアルデヒドとセルを修正します</li>。
	<li>洗浄 3 回 PBS + + 300 μ L/ウェルのセル</li>。
	<li>PBS 1 x-3_% BSA (ブロック バッファー) の 300 μ L を追加し、室温で 30 分を残しています</li>。
	<li>160 μ L/ウェル 1x-1%BSA-0.05% 洗剤 PBS で希釈した一次抗体 (抗 VE カドヘリン、アンチ CD31、抗 vWF) を適用し、室温で 1 時間インキュベートします</li>。
	<li>PBS + + (200 μ L/ウェル) での 3 回の洗浄です</li>。
	<li>二次抗体と 160 μ L/ウェル、洗剤 1x-1%BSA-0.05% PBS で希釈した DAPI を適用し、室温で 1 時間インキュベートします</li>。
	<li>PBS + + (200 μ L/ウェル) での 3 回の洗浄です</li>。
	<li>グリセリン ベースの取り付け中のスライドをマウントし、蛍光顕微鏡下で血管内皮細胞マーカー発現を確認します 。
	注: 文化ブタ大動脈内皮細胞 90% 合流まで T175 フラスコ (DMEM 低グルコース培地 + 10% FBS 1% ペニシリン/ストレプトマイシン、内皮細胞成長培地補足ミックスの 0.4%) に達する。(密度 1 x 10 6 細胞を播種、90% の合流に対応して約 5 x 10 の 6 セル).</li>
</ol> 3。マイクロ ・ キャリア ビーズ コーティング <ol><li>42 ml コラーゲン溶液 50 mL チューブ (100 μ g/mL、0.2% 酢酸溶液で希釈) でのマイクロ ・ キャリア ビーズ 7 mL を混合し、室温で 1 時間インキュベートします</li>。
	<li>ビード PBS pH 7.4 の 25 mL で 2 回洗浄しなさい (25 mL の PBS を追加、ピペットをよく混ぜて、ビーズは、破棄落ち着いて、上澄みと繰り返しまで待つ)、DMEM 培地を 25 mL と 1 時間</li>。
	<li>カバー 199 10% を添加した培地 10 mL を 50 mL チューブにビーズ 1% 1% ペニシリン/ストレプトマイシン、FBS、L-グルタミン、内皮細胞成長培地補足ミックスの 0.4% とヘパリン (5000 IU/mL) の 25 μ L でき、10 分間の平衡さらに使用する前にします</li>。
</ol> 4。細胞を収集 <ol><li>PAEC を含む T175 フラスコから細胞培養培地を削除し、5 mL の PBS pH 7.4 を追加します</li>。
	<li>T175 フラスコから PBS を削除します</li>。
	<li>Trypsin-0.05% EDTA の 5 mL を追加し、37 で 3-4 分間インキュベート ° C</li>
	<li>細胞培養培地 15 mL でフラスコを洗浄によって細胞を収集し、50 mL のチューブでサスペンションを転送します</li>。
	<li>室温で 8 分間 1,200 x g で細胞を遠心分離機、余分な培地を取り除き、細胞培養液 5 mL にペレットを再懸濁します</li>。
</ol> 5。撹拌フラスコに細胞を播種 <ol><li>細胞懸濁液に細胞培養培地 20 mL を追加し、再懸濁します</li>。
	<li>500 mL マグネチックスターラー フラスコ (細胞) を除く 20 mL 細胞培養培地を追加します</li>。
	<li>ステップ 3.3 から洗浄マイクロ ・ キャリア ビーズにセルを追加し、25 mL の血清ピペット、慎重に混在します</li>。
	<li>磁気スピナー フラスコにビーズ/細胞の混合物を転送します</li>。
	<li>リンスの残りの細胞を収集するために細胞培養培地 10 mL を 50 mL チューブ</li>。
	<li>スピナー フラスコ細胞培養液の追加 85 mL を追加し、インキュベーター シェーカーで 37 ° C で一晩に配置 (100 × g、混合間隔: 3 分 45 分毎).</li>
	<li>細胞培養液 50 mL を追加 (合計量 200 mL) とシェーカーで 37 ° C でさらに 24 時間の攪拌を続行 (100 × g、間隔を混合: 3 分 45 分毎).</li>
	<li>追加無色 RPMI 培地 (10% を添加した政府短期証券の 1%、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、L-グルタミン、内皮細胞成長培地補足ミックスの 0.4% とヘパリンの 25 μ L) 容量 320 mL に達するまでです</li>。
	<li>媒体を交換して古い媒体のすべての 48 h: 削除 100 mL と 100 mL の新鮮な補われた無色 RPMI を追加します</li>。
	<li>5 に 7 日間培養します。時間細胞をコートしたビーズの合流点の状態に依存します</li>。
</ol> 6。合流検証 <ol><li>200 μ L のピペットを使用してセルをコートしたビーズを収集し、ポリプロピレン チューブにそれらを転送します</li>。
	<li>600 μ L の PBS 1 にビードを 3 回洗浄しなさい x (PBS を追加傾斜管とミックス ビーズを待つ、細胞の剥離を避けるために優しく落ち着く、PBS を破棄し、繰り返し).</li>
	<li>Parapicric 酸の 200 μ L の追加によって 10 分のビーズを修正します</li>。
	<li>X. 1 PBS の 600 μ L で 3 回洗浄</li>
	<li>1 PBS で希釈した追加 DAPI x 10 分間インキュベートし、</li>
	<li>スライド ガラスのビーズを転送し、グリセリン ベース マウント媒体を用いた coverslip を適用します</li>。
	<li>共焦点顕微鏡下でビーズを視覚化します</li>。
</ol> 7。実験手順 <ol><li>10 mL の血清ピペットと (手順は、無菌条件下で行われる持っていない) マグネチックスターラー フラスコからセルをコートしたビーズを外し、12 mL 丸底ポリプロピレン チューブにそれらを転送します</li>。
	<li>ビーズ (約 1-2 分) 落ち着くと余分なメディアを削除します</li>。
	<li>すべてのチューブ ビーズの丁度 2 mL になるまでチューブにもっとビーズを追加します</li>。
	<li>各管に 5 mL クリア RPMI を追加し、10 mL の血清ピペットを使用して慎重に混ぜる</li>。
	<li>ビーズ落ち着くと余分なメディアを削除します</li>。
	<li>洗浄手順に RPMI 1 つより多くの時間を繰り返し、すべての余分なメディアを削除します</li>。
</ol> 8。非高血圧症血液培養 <ol><li>慎重に、ゆっくりと健康なボランティアからの血を引くし、9 mL 中立的なポリプロピレン チューブ (ない抗凝固剤) の収集 (ジェットも vacutainers を使用).</li>
	<li>はゆっくりと (総容積は 10 mL になります) セルをコートしたビーズの 2 mL を含むポリプロピレン チューブのそれぞれに 8 mL の血液 10 mL の血清ピペットを転送します。常に血液や EC の早期活性化を避けるためにビーズの乱暴な取り扱いをしないでください。1-2 分を要する</li>
	<li>等しい混合を確保しパラフィン フィルムとキャップを封血/ビーズ混合物を慎重に傾けます</li>。
	<li>は、37 ° C の定温器および凝固時間レコード内 (穏やかな傾斜設定のみ) と水平傾斜テーブルにチューブを置きます。
	<ol><li>セットの時間間隔で 例えば 10、20、30、50、70、90 分後血ビーズ混合血清または血漿分析のための少なくとも 1.5-2 mL を削除します 。
		注: 6 時間ポイント、セルの 1 つのグループ内で 3 以上の複製を持つため、勧め別管内血液サンプリングが行われる</li>。
		<li>血清のコレクション、凝固する血のまま。プラズマを収集する EDTA またはクエン酸 2 mL チューブに血液サンプルを追加する前にします</li>。
		<li>氷のチューブを格納、4 ° C で 10 分間 2,500 × g で遠心分離、血清/血漿 80 ° c を使用するまで格納します 。
		メモ: テーブルの材料 の材料の詳細については、提供されて</li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+endothelium+and+human+diseases.">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).</li><li>Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+recalcified+citrated+whole+blood+-+a+pragmatic+approach+for+thromboelastography+in+children.">The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children.</a> Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).</li><li>Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Suppression+of+the+Coagulation+of+Nonanticoagulated+Whole-Blood+in-Vitro+by+Human+Umbilical+Endothelial-Cells+Cultivated+on+Microcarriers+Is+Not+Dependent+on+Protein-C+Activation.">The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation.</a> Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).</li><li>Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells+suppress+prothrombin+activation+in+nonanticoagulated+whole+blood+in+vitro.">Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro.</a> J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).</li><li>Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+protection+and+complement+inhibition+in+xenotransplantation:+a+novel+in+vitro+model+using+whole+blood.">Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood.</a> Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).</li><li>Cowan, P. J., d'Apice, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+activation+and+coagulation+in+xenotransplantation.">Complement activation and coagulation in xenotransplantation.</a> Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).</li><li>Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx:+composition,+functions,+and+visualization.">The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization.</a> Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).</li><li>Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement-coagulation+crosstalk+on+cellular+and+artificial+surfaces.">Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces.</a> Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).</li><li>Bongoni, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Expression+of+Human+CD46+on+Porcine+Endothelium:+Effect+on+Coagulation+and+Fibrinolytic+Cascades+During+Ex+Vivo+Human-to-Pig+Limb+Xenoperfusions.">Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions.</a> Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).</li><li>Miyazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+shear+stress+can+initiate+both+platelet+aggregation+and+shedding+of+procoagulant+containing+microparticles.">High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles.</a> Blood. 88, 3456-3464 (1996).</li><li>Wuensch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+Sequences+of+the+Porcine+THBD+Gene+Facilitate+Endothelial-Specific+Expression+of+Bioactive+Human+Thrombomodulin+in+Single-and+Multitransgenic+Pigs.">Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs.</a> Transplantation. 97, 138-147 (2014).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで紹介するモデルは凝固に適して関連の研究凝固と理事会との相互作用のさまざまな側面の分析が可能8異種移植研究でヒトの血液9の孵化後異なる遺伝子組み換え豚 ECs の抗凝固特性をテストするための便利なシステムです。
プロトコルの最も重要な手順、実験を開始する前に、マイクロ ビーズの完全なセル範囲 (密度) を確保、それらおよび早産を避けるために非高血圧症全血の取り扱いに関する注意のコレクション血液を収集する vacutainers を使用する場合に発生する可能性があります高のせん断応力による血小板活性化。10は、それにもかかわらず、このシステムは循環クローズド システムの有無を含む、いくつかの制限とほうが生理学的な剪断応力がない場合は、生体内で条件を表します。
これらの制限にもかかわらず現在に比べて説明モデルの提供の重要な利点は既存モデルです。マイクロ ・ キャリア ビーズを使用、するため抗凝固・抗炎症の環境の構築と非高血圧症全血の使用を許可する血の容積の比率に EC 表面が増加します。現在のフラット ベッド細胞培養モデルでこれは不可能で、動物実験の使用が多くの場合必要したがって EC 活性化血液凝固に関連するメカニズム。一部では、記述されているマイクロ ・ キャリア ビーズ モデルを使用してこれを回避できます。
さらに、このシステムは、幅広いアプリケーションにできます。その多様性は、さまざまな薬物または関連 (xeno-) 移植のみならず、また、人間の病気である化合物のテストの可能性に存在します。蛍光抗体法、ELISA、マルチプレックス サスペンション アレイ解析による内皮および凝固系の薬の影響を簡単に評価できます。これは以前の異種環境で人間のトロンボモジュリン遺伝子組換え発現の効果に関する研究で行われました。11
説明方法の可能な変更は、ピペットを使用して空気接触と血液の活性化を減らすために携帯をコートしたビーズで以前満ちている管に直接非高血圧症全血のコレクション可能性があります。ひと大動脈内皮細胞 (HAEC) を使用可能性があります面白い制御と将来の計画に既に組み込まれています。アルゴン管のトッピングは、連絡血液凝固カスケードの活性化につながることがわかっている空気と非高血圧症血液との接触を減らすためにされる可能性があります。血を余りにすぐに描画する場合たとえばゴム製活栓の真空チューブを使用し、高級ジェットでチューブに血液を導入、その後血小板有効になって、凝固が早く発生します。血小板の活性化を避けるためには、大径注射針 (21ɢ - 16ɢ) を使用します。

血管内皮細胞は、血管の内腔を並べる内皮細胞 (EC) の単分子層で構成されます。生理学的な状態で静止 EC が抗凝固薬および抗炎症環境のメンテナンスを担当です。1これは抗凝固剤および EC 表面抗炎症タンパク質発現によって媒介されます。虚血・再灌流による EC 活性化たとえば、傷害または血管性拒絶反応 (xeno-) の移植臓器プロ凝固と炎症性抗凝固薬および抗炎症状態から内皮細胞表面の変化の結果状態です。1
内皮細胞と血液凝固の要因として模倣の in vitroモデルの魅惑的で複雑な相互作用を研究するには、可能な限り密接に体内の状況が非常に望ましい。凝固検査従来体外を特徴づける共通制限は高血圧症血液凝固性効果の解析を困難になるとの使用と全血のも領域を再現できません。高血圧症以外の新鮮な血液を用いて得られる結果。2以外にも、伝統的なフラット ベッド細胞培養システムで不可能血液量あたり十分な血管内皮細胞表面に到達できないと血管内皮細胞の抗凝固特性を悪用します。ここに提示されたモデル球状マイクロ ・ キャリア ビーズの表面に EC を養殖によるこれらの制限を克服しての EC 表面の血比 &#62; 16 cm2/mL に到達でき、小細動脈や静脈の状況に似ているとこれは血液の「自然な」抗凝固療法を許可する十分な EC 表面によって記述されていた。3,4全血はこの設定で追加された抗凝固剤なし使用ことができます。凝固因子、サイトカイン、実験中に血液サンプルを集めることができると可溶性の補体の活性化マーカーを検出および定量化できます。さらに、EC コーティング マイクロ ・ キャリア ビーズは、共焦点顕微鏡による補体および免疫グロブリン沈着として EC 活性化マーカーの発現を分析することがあります。別の興味深いアプリケーションは、血管内皮細胞の活性化や、したがって、凝固を防ぐためになっている薬物の含まれています。5が、このモデルは、動物実験を完全に置き換えることはできません、それは特定機能仮説ex vivo細胞を使用してテストし、虚血/再灌流に関する基礎的研究に使用される動物の数を減らす方法を提供します。傷害または (ゼノ) の移植。
説明モデルは設定どのブタ大動脈内皮細胞 (PAEC) のマイクロ ・ キャリア ビーズ上に成長したおよび全体、非高血圧症血液で培養した異種を模倣する使用されました。補体系やトロンボモジュリン (hTBM) 凝固系の規則のための規則のためのありなさい CD46 などいくつかのひと遺伝子を運ぶ別のトランスジェニック PAEC は、その抗凝固特性分析しました。血管内皮細胞の活性化、補完、および凝固のシステムは堅く制御され、相互に連結されます。6様々 な形質転換細胞の接着分子の発現やサイトカインのリリースに関して人間の血液への暴露後動作方法を理解することが重要、そのための糖衣と抗凝固の蛋白質の損失を流します。7

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PAEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from pig aorta in our Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcarrier beads (Biosilon)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Bovine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10644-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1726.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T406-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirrer flasks</td>
			<td>Tecnomara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological stirrer</td>
			<td>Brouwer</td>
			<td>MCS-104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti CD31</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB33871</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG-Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>112-166-003</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti VE-cadherin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-6458</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti vWF</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dk anti Gt IgG &#8211; Alexa 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Rabbit - FITC</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-25MG-F</td>
			<td>Dilution 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Concentration: 10% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367286</td>
			<td>Size: 0.8x19 mm (21&#610; 3/4&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>14.1205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td></td>
			<td>Available for free at: https://imagej.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td>2mL in 500mL of DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Concentration: 1% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Concentration: 1% in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinun natricum</td>
			<td>Drossa Pharm AG</td>
			<td></td>
			<td>Stock concentration: 5000 U.I./ mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamberslides</td>
			<td>Bioswisstec AG</td>
			<td>30108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 x 2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x6 H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.5833.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycergel mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>C0563</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the anticoagulant and anti-inflammatory properties of endothelial cells using 3d cell culture and non-anticoagulated whole blood

生体内で、内皮細胞は循環血液の自然な抗凝固療法のために重要です。その結果、血管内皮細胞の活性化は、血液凝固をもたらします。この現象は、虚血/再灌流障害、臓器移植、異種移植を含む前もって形成された抗ドナー抗体の存在下でのような多くの臨床状況で観察されます。モデルによると、3 r 基準 (削減、交換・洗練)培養内皮細胞の影響を検討する動物実験を減らすためには、血液凝固活性化は非常に望ましいでしょう。ただし、内皮細胞培養の一般的なフラット ベッド システムは、自然、内皮細胞を介した抗凝固療法の不十分な血の mL あたり内皮の 1 5 cm2の表面に容積比を提供します。マイクロ ・ キャリア ビーズに内皮細胞を培養すると、40-160 cm2/mL に表面・体積比が増加します。この増加率は、抗凝固薬の使用を避けることができるように、全血での「自然な」抗凝固療法を確実に十分です。ここで体外マイクロ ・ キャリア ・ ベース システムは全体、非高血圧症ひと血液の凝固に及ぼすブタ血管内皮細胞の遺伝子組み換えの研究に記載されています。説明アッセイがプライマリ ブタ大動脈の血管内皮細胞、いずれかの野生型 (WT) で遺伝子組み換え人間ありなさい CD46 および、トロンボモジュリンをマイクロ ・ キャリア ビーズ上に成長したて非高血圧症ヒトの血液にさらされるのか。このモデルは、補完性と、血漿中の血液凝固マーカー測定及び活性化と同様に、サイトカインのリリースの定量化できます。さらに、活性化血管内皮細胞および免疫グロブリンの沈着のイメージング、endothelialized ビーズの補完・凝固の蛋白質を行った共焦点顕微鏡。この試金は、血管内皮細胞の活性化や、したがって、凝固を防ぐためになっている薬をテストする使用できます。このような調査に使用される動物の数を減らすには、その可能性の上に説明アッセイは、簡単に実行で一貫して再現可能なです。

スピナー フラスコ (図 1) の文化の 7 ~ 10 日後セルが合流、マイクロ ・ キャリア ビーズ (図 2) の全体の表面を覆います。合流の状態の検証、ミクロ粒子のニキビトリートメントに EC の非合流単層凝固時間の著しい減少につながるので重要なステップですが、ビーズの表面は強くプロ凝集剤、マイクロ ・ キャリア (凝固時間: 4 ± 1 分) (図 3)。
注意を必要とするもう一つの重要なポイントは、傾斜板の速度です。血液凝固高傾斜速度を高めます。EC の単分子膜があればマイクロ ・ キャリア ビーズの表面に凝固時間の延長を観察できます。GalTKO/hCD46/hTBM トランスジェニック PAEC を使用は、WT PAEC (図 3) と比較して凝固時間の大幅な増加を示した。PAEC (GalTKO) のギャル-α-1, 3-ギャル xenoantigen の不在は、凝固時間 (25 ± PAEC WT 8 分)、68 ± PAEC GalTKO 30 分で増加を示した。凝固時間の別の強い増加を認めたとき PAEC GalTKO/hCD46/hTBM マイクロ ・ キャリア ビーズに存在していた (205 ± 32 分)、補体 (hCD46) と凝固システム (hTBM) の両方の成功した変調を示唆しています。表示されて血栓が形成されると、実験の終わりが定義されます。グループの同じのサンプル内の可変性間試金変動とドナーの血液が原因両方です。すべての実験があった 3 複製と異なるたびに献血データの信頼性を高めるに使用されました。各ドナーの血液分析 (血小板、白血球、赤血球、HCT、他のパラメーター) は、外部の医療機関で実施しました。図 3に示す結果は、別の献血者と異なる実験から取得されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56227/56227fig1.jpg"> 
図 1: マイクロ ・ キャリア ・ アッセイの略図。(A)は EC が T175 フラスコで展開され、 (B)はコラーゲン塗布マイクロ ・ キャリア ビーズと一緒にスピナー フラスコに転送。(C) 、 (D) EC コーティング マイクロ ・ キャリア ビーズを混合し、37 ° C で培養した健康なボランティアから新鮮な非抗凝固療法の血液を採血します。「非高血圧症血」のフレーズは、血液の抗凝固剤と扱われていないことを意味します。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56227/56227fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56227/56227fig2.jpg"> 
図 2: EC コーティング マイクロ ・ キャリア ビーズを免疫蛍光染色します。マイクロ ・ キャリア ビーズを取得され、CD31 のステンド グラス (PECAM 1)、密度を評価します。青 (DAPI) で染色された核および CD31 の赤 (Cy3) で染まっていた。スケール バー: 100 μ m。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56227/56227fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56227/56227fig3.jpg"> 
図 3: 凝固時間別 EC の血液凝固時間が視覚的に決定され、表示されている血栓を認めた時に実験の終わりが定義されました。マイクロ ・ キャリアの非 EC コーティング ビーズが全体の非高血圧症ヒトの血液にさらされたとき、強力な凝血促進効果が認められました。PAEC (GalTKO) のギャル-α-1, 3-ギャル xenoantigen の不在は、凝固時間 (25 ± PAEC WT 8 分)、68 ± PAEC GalTKO 30 分で増加を示した。とき PAEC GalTKO/hCD46/hTBM に存在していたマイクロ ・ キャリア ビーズ補体 (hCD46) と凝固システム (hTBM) の両方の成功した変調を示唆している凝固時間のさらなる増加が観察されました。データは、平均 ± 標準偏差として表示されます。統計解析が行われている多重比較補正ボンフェローニの ANOVA を使用します。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56227/56227fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

全体、高血圧症非血の研究と凝固解析を可能にする生体外モデルを提案します。健康な内皮細胞の自然な抗凝固効果に依存するシステムの抗凝固療法と血管内皮細胞の活性化血液凝固になります。

3 D 細胞培養と非高血圧症全血を用いた血管内皮細胞の抗凝固および抗炎症作用の評価

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

8.3K ビュー.  University of Bern. 全体、高血圧症非血の研究と凝固解析を可能にする生体外モデルを提案します。健康な内皮細胞の自然な抗凝固効果に依存するシステムの抗凝固療法と血管内皮細胞の活性化血液凝固になります。

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Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

全血刺激のためのアッセイを用いて炎症性サイトカインIL -1βの正確かつ簡単に測定

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

医学

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the low-molecular-weight-heparin (LMWH), enoxaparin. There are also urgent clinical situations where it would be important if this could be determined rapidly. The present assay is designed to accomplish this. We only assayed human blood samples that were spiked with known concentrations of enoxaparin. The essential feature of the present assay is the quantification of the efficacy of enoxaparin in a patient's blood sample by degrading it to complete inactivity with heparinase. Two blood samples were drawn into Vacutainer tubes (Becton-Dickenson; Franklin Lakes, NJ) that were spiked with enoxaparin; one sample was digested with heparinase for 5 min at 37 &deg;C, the other sample represented the patient's baseline anticoagulated status. The percent shortening of clotting time in the heparinase-treated sample, as compared to the baseline state, yielded the anticoagulant contribution of enoxaparin. We used the portable, battery operated Hemochron 801 apparatus for measurements of clotting times (International Technidyne Corp., Edison, NJ). The apparatus has 2 thermostatically controlled (37 &deg;C) assay tube wells. We conducted the assays in two types of assay cartridges that are available from the manufacturer of the instrument. One cartridge was modified to increase its sensitivity. We removed the kaolin from the FTK-ACT cartridge by extensive rinsing with distilled water, leaving only the glass surface of the tube, and perhaps the detection magnet, as activators. We called this our minimally activated assay (MAA). The use of a minimally activated assay has been studied by us and others. 2-4 The second cartridge that was studied was an activated partial thromboplastin time (aPTT) assay (A104). This was used as supplied from the manufacturer. The thermostated wells of the instrument were used for both the heparinase digestion and coagulation assays. The assay can be completed within 10 min. The MAA assay showed robust changes in clotting time after heparinase digestion of enoxaparin over a typical clinical concentration range. At 0.2 anti-Xa I.U. of enoxaparin per ml of blood sample, heparinase digestion caused an average decrease of 9.8% (20.4 sec) in clotting time; at 1.0 I.U. per ml of enoxaparin there was a 41.4% decrease (148.8 sec). This report only presents the experimental application of the assay; its value in a clinical setting must still be established.

Demonstration of a rapid quantitative assay of the inhibition of blood coagulation by the low-molecular-weight-heparin, enoxaparin. The contribution of enoxaparin is assessed by removing its influence through digestion with heparinase. A fuller description of the assay is detailed in our published paper.1 The assay still requires clinical confirmation.

全血におけるエノキサパリン抗凝固効果の迅速なポイントオブケアアッセイ

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Non-invasive Assessment of Microvascular and Endothelial Function

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of cardiovascular disease. Capillaroscopy is a non-invasive, relatively inexpensive methodology for directly visualizing the microcirculation. Percent capillary recruitment is assessed by dividing the increase in capillary density induced by postocclusive reactive hyperemia (postocclusive reactive hyperemia capillary density minus baseline capillary density), by the maximal capillary density (observed during passive venous occlusion). Percent perfused capillaries represents the proportion of all capillaries present that are perfused (functionally active), and is calculated by dividing postocclusive reactive hyperemia capillary density by the maximal capillary density. Both percent capillary recruitment and percent perfused capillaries reflect the number of functional capillaries. The forearm blood flow (FBF) technique provides accepted non-invasive measures of endothelial function: The ratio FBFmax/FBFbase is computed as an estimate of vasodilation, by dividing the mean of the four FBFmax values by the mean of the four FBFbase values. Forearm vascular resistance at maximal vasodilation (FVRmax) is calculated as the mean arterial pressure (MAP) divided by FBFmax. Both the capillaroscopy and forearm techniques are readily acceptable to patients and can be learned quickly.
The microvascular and endothelial function measures obtained using the methodologies described in this paper may have future utility in clinical patient cardiovascular risk-reduction strategies. As we have published reports demonstrating that microvascular and endothelial dysfunction are found in initial stages of hypertension including prehypertension, microvascular and endothelial function measures may eventually aid in early identification, risk-stratification and prevention of end-stage vascular pathology, with its potentially fatal consequences.

Capillaroscopy is a non-invasive, relatively inexpensive methodology for directly visualizing the microcirculation. The forearm blood flow technique provides accepted non-invasive measures of endothelial function.

微小血管と内皮機能の非侵襲的評価

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

マルチとシングルセルベース球アッセイを用いてヒト卵巣癌細胞における幹細胞特性の評価

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別によるヒトリンパ内皮細胞の単離

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

腫瘍特異的内皮細胞の単離および培養拡大

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Imaging-とフローサイトメトリーベースのセル位置の解析と3Dメラノーマスフェロイドにおける細胞周期

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Ultrasound Assessment of Endothelial Function: A Technical Guideline of the Flow-mediated Dilation Test

Cardiovascular disease is the primary cause of mortality and a major cause of disability worldwide. The dysfunction of the vascular endothelium is a pathological condition characterized mainly by a disruption in the balance between vasodilator and vasoconstrictor substances and is proposed to play an important role in the development of atherosclerotic cardiovascular disease. Therefore, a precise evaluation of endothelial function in humans represents an important tool that could help better understand the etiology of multiple cardio-centric pathologies.
Over the past twenty-five years, many methodological approaches have been developed to provide an assessment of endothelial function in humans. Introduced in 1989, the FMD test incorporates a forearm occlusion and subsequent reactive hyperemia that promotes nitric oxide production and vasodilation of the brachial artery. The FMD test is now the most widely utilized, non-invasive, ultrasonic assessment of endothelial function in humans and has been associated with future cardiovascular events.
Although the FMD test could have clinical utility, it is a physiological assessment that has inherited several confounding factors that need to be considered. This article describes a standardized protocol for determining FMD including the recommended methodology to help minimize the physiological and technical issues and improve the precision and reproducibility of the assessment.

The flow mediated dilation (FMD) test is the most commonly utilized, non-invasive, ultrasound assessment of endothelial function in humans. Although the FMD test has been related with the prediction of future cardiovascular disease and events, it is a physiological assessment with many inherent confounding factors that need to be considered.

内皮機能の超音波評価：フロー依存性血管拡張テストの技術ガイドライン

Cardiovascular disease is the primary cause of mortality and a major cause of disability worldwide. The dysfunction of the vascular endothelium is a ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

犬の動脈と静脈からの初代内皮細胞の単離および培養

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...