私たちはサンプルの痕跡とTin Ki Tsangの助けを借りて、絵の助けを借りてYe Zhangに感謝します。この研究は、レイ・トーマス・エドワーズの早期キャリア賞とC.-YSおよびNIHグラント（R01DC009597およびR01DK092640）のNIHグラント（R01DC015519）がJWW

1. at4記録用ハードウェアの準備<ol><li>ピペットプラー装置を使用して、アルミノシリケートガラスキャピラリー（OD 1.0mm、ID 0.64mm）で電極を調製する。ハエの頭蓋内への挿入を容易にするために、一対の細かい鉗子で参照電極の先端をわずかに鈍らせる（ すなわち 、ハエ頭の前部、口部の上の丸いプレート）。 注：7日齢のWT男性（ベルリン）をこの研究で使用した。両方の電極の電解質としてAHL生理食塩水14を使用する。 </li><li> NaCl 6.312グラム、塩化カリウムの0.373グラム、NaHCO 3を0.337グラム、のNaH 2 PO 4、トレハロースּ2 H 2 O、スクロース3.423グラムの1.892グラムの0.1120グラムを用いて、蒸留水900mlを混合することによってAHLの1 Lを調製1.192gのHEPES、および8.2mLの1M MgCl 2を入れた 。蒸留水を使用して、全容量を1 Lにする。1 N NaOHを使用してpHを7.4にし、溶液を滅菌する。真空駆動フィルターシステム。長期間保存するには、AHLアリコートを4℃に保ちます。 注：パルミトレイン酸の一貫したデリバリーは、カートリッジ間の均一性に左右されます。各カートリッジが再現可能な方法で組み立てられることが重要です。 </li><li>カミソリの刃を使用して、200μLのピペットチップの先端から0.9cmを取り除いて、4.1cmの第1のカートリッジセクションを作成する。 図1Aに詳述されている寸法を参照してください。別の200μLピペットチップを使用し、チップとベースからそれぞれ1.7cmと1.5cmを取り除いて、1.8cmの第2カートリッジセクションを作成します（ 図1A ）。再現性を保証するためにルーラーを使用してください。 </li><li>濾紙からディスクを切断するには、1/8 &quot;穴パンチャーを使用してください。 </li><li>鉗子を使用して、第2カートリッジセクションの先端に濾紙ディスクを置きます。空気が通過できる開口部がカートリッジの先端にあることを視覚的に確認する。 </li><li> 図1Aに示すように、第1と第2のカートリッジセクションを一緒に取り付けます 。第2のカートリッジ部分を下方に傾けて、準備を正方形にすることを容易にする（ 図1B ）。 </li><li>カートリッジをマイクロマニピュレーターに取り付けられた臭気送達チューブに接続します。 注記：この設計により、交換を容易にするためにカートリッジを外側に旋回させることができます（ 図1C ）。 </li><li> 1つの質量コントローラで一定の加湿空気流量を2 L /分に設定し、別の質量コントローラで付臭剤フローを500 mL /分に設定します。 </li><li>ソフトウェア（ 表の表を参照）を使用して、500 msの臭気パフを管理する手順をプログラムします。 </li></ol> 2.送達のためのパルミトレイン酸匂い溶液の調製注：Or47b ORNは、 シス及びトランスパルミトレイン酸の両方に応答する。パルミトレイン酸はRで不安定であるのでTは-20℃で貯蔵し、開封後1ヶ月以内に使用する。エタノールは、パルミトレイン酸のために選択される溶媒である。 <ol><li>ボルテックスミキサーを使用して、10μLのシスまたはトランス -パルミトレイン酸のストックまたは希釈液を、1.7mLのマイクロチューブで10倍連続希釈するために100μLのエタノール90μLと完全に混合する。実験前に毎日新鮮なパルミトレイン酸希釈液を調製し、1日以内に使用する。 注：エタノールに溶けないにおい物質の場合、他の種類の有機溶媒で臭い希釈液を調製するには、ガラスバイアルの使用を推奨します。 </li><li> P10マイクロピペットを用いて、所望の希釈液のシス -パルミトレイン酸溶液5μLを対応するカートリッジの濾紙に塗布する。 注：最高用量（10 -1 ）には450μgの化合物が含まれています。 トランス -パルミトール酸溶液の場合、最高用量（10 -1 ）に450μLのt彼は化合物。 </li><li>溶媒を完全に蒸発させるために、パルミトレイン酸カートリッジを真空デシケーター中に室温および圧力7.59mmHgで1時間置く。 注記：カートリッジはRTで4時間まで使用できます。 </li></ol> インビボ電気生理学的記録のためのat4センシラへの容易なアクセスのためのショウジョウバエの調製注：WTハエ（ベルリン）は、12：12の明暗サイクルで25℃で標準的なコナミール培地で飼育される。勃起すると、ハエは性別によって10のグループに分けられ、それによって7歳までグループに収容されます。オスとメスの両方でor47b ORNがパルミトレイン酸に応答する。簡単にするために、現在の研究では雄ハエのみを調べる。 <ol><li>フライ・プレップ・スライドを組み立てる：ガラス・スライド上にガラス・カバースリップ（18×18mm 2 ）を少量のモデリング・クレー上に置き、スライドガラスと約3°の角度をなす。内部Eに両面テープを置きますカバースリップとすぐ下のスライドの領域に表示されます。記録の毎日のために新鮮なテープで交換してください（ 図2A ）。 </li><li>フライアスピレーター15を使用してチュービングのフライを集め、チューブの端に200μLのピペットチップを取り付けます。同時にチューブを前方に軽く叩きながらチューブに空気を吹き込み、ピペットチップの端にフライを押します。かみそりの刃を使って、フライの身体のすぐ下と、フライの上の2頭の長さを切断します。 </li><li>アンテナとクライスが両方露出するまで、飛行を上に押して、モデリング粘土でピペットチップの底を塞ぎます（ 図2B ）。フライの腹部が潰れないように、飛行機を殺すのを避けるために、アンテナとアルスターを暴露するのに十分な粘土だけを加えてください。さらに、粘土をゆっくりと穏やかに加えて突然の狭窄を防ぐ。ハエが生きていることを確認するには、または頸動脈の動き。 </li><li>フライを収容するピペットチップを操作するために鉗子を使用してください。頭頂部が観察者の右を向くように頭を向ける。アンテナの側面がテーピングされたカバースリップの表面（ 図2B ）に当たるまで、細かいピンセットを使用してカバースリップに沿って準備を調整します。 </li><li>アンテナを両面テープに固定して動きを防止するために、支柱に支柱を置きます （ 図2B ）。 注記：保持ロッドはピペットプラーでホウケイ酸ガラスキャピラリーから引き出され、モデリング粘土で定位置に保持されます （ 図2A ）。 </li><li>リグのステージ上にプレパラートを置く（ 図2C ）。顕微鏡を使用して、トリコイドがアンテナの3番目のセグメントの遠位端に沿って見えることを確認します。 注：理想的には、sensillaはバックグラウンドに対して明確なシルエットを持つ必要があります。<html>記録を容易にします（ 図3 ）。この調製では、アクセス可能なトリコイド感受性物質の大部分はat4型である。 </li><li>先に図2 に 示す ように、15のように、分取から約2cmの距離（ 図4）からの別個の空気送達チューブを介して送達定数加湿空気流（2L /分）下で分取を保ちます。 </li></ol> 4.パルミトレイン酸に反応したat4トリコイド中のOr47b ORNからのat4感覚活性の記録<ol><li>参照電極を鞘に挿入する（ 図3A ）。組織の損傷を避けるために、電極が表面のすぐ下に挿入されていることを確認してください。電極がキューティクルの下の血リンパと接触できるようにしてください。 </li><li>ターゲット電極と同じ平面に入るまで記録電極をゆっくりと下げてください（= &quot;xfig&quot;&gt;図3B）。 50倍の対物レンズで記録します。 注記：タフタコイダルキューティクルは、記録電極を感知器ベースに挿入する必要があり、その広い領域は、電極が偏向される可能性を低減する大きなターゲットを提供する（ 図3B 、挿入図）。 </li><li> 感覚刺激に匂い刺激を加える前に、以下の選択基準を守ってください。これらの基準を満たしていないトリコイドは拒絶され、もう一つの感覚は選択されるべきである。 <ol><li>高い信号対雑音比（例として図3Cを参照）を観察してください。 </li><li> at4Aおよびat4Cニューロンからの同定可能なスパイクを観察する（ 図3C ）。 注意：注目すべきは、at4Bスパイク振幅はat4A 10と非常によく似ており、臭い刺激なしでは容易に同定できないことです。 </li><li> at4Aニューロンの基礎発火率は、約20Hz以下である。 注：この基準は、ニューロンの基礎発火率が基底ORNs 2のそれよりも高いため、at4Aに特有である。はるかに高い基礎発火は、ニューロンが電極挿入中に損傷を受けた可能性があることを示す。 </li></ol></li><li>カートリッジを付臭剤供給チューブに接続します。溶媒制御装置で始め、次に臭い物質を低濃度から高濃度にします。マイクロマニピュレーターを使用してカートリッジを準備の方向に動かし、カートリッジを準備の頭に正対して向ける。数ミリメートル離れたところからカートリッジがアンテナに直接向いていることを目視で確認します （ 図4 ）。 注：目的は、カートリッジの開口部をアンテナに直接向け、標的組織に近接して配置することです。 </li><li>付臭剤カートリッジが記録電極から右に1〜2 mm離れていることを確認してください。pを約1 mm下にスライドさせます。 注記：ここで説明する設定では、付臭剤カートリッジは、記録電極、参照電極、フライ・プレップ・スライド（ 図4 ）と密接に接しています。 注記：カートリッジと記録/参照電極間の距離に注意してください。約4 mmの距離をお勧めします1 。意図しない接触は、信号を終了させ、記録電極の先端を壊し、現在のニューロンに損傷を与え、さらなる記録を複雑にする可能性がある。 注記：カートリッジとフライ・プレップ・スライドとの距離を考慮してください。カバースリップに触れても記録電極がはずれて記録が中断されることがあります。 </li><li>記録を開始するには、データ収集ソフトウェアの &quot;Record&quot;を押します。 注：10秒ごとの録音ごとに、ステップ1.9で説明したように、500 msの単一臭いパルスがアンテナに直接送られます。 </li><li>ニオイ剤塗布後、次の濃度のカートリッジに交換する前にカートリッジを注意深く引き出してください。投与量の全範囲が得られるまで続ける。 注：適応の影響を避けるために、各フライから1つのOr47b ORNしか記録されないことが推奨される。 </li><li>記録電極を蒸留水で徹底的にすすいでください。 </li><li>市販のオフライン解析ソフトウェアを使用してデータを分析およびプロットする。 </li></ol>

<ol>
	<li>Lin, H. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+modulation+of+pheromone+detection+enhances+male+courtship+success.">Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success.</a> Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).</li><li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire.">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li><li>Silbering, A. 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B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+sensillum+recordings+in+the+insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae.">Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

ここでは、Or47b ORNのパルミトレイン酸に対する応答を強く誘発し、記録することができる手順を記載した。我々は不十分フェロモン臭気物質の送達の問題を解決するために、従来の長距離臭気配信方法2、7、10を修正しました。臭気物質カートリッジを介して化合物を送達することにより、低い臭気物質の揮発性の問題に対処した。その開口部は、調製のミリメートル以内に配置されている。各匂いカートリッジの一貫した構築および配置を考慮すると、このプロトコルは、アクセスできない匂い物質を再現可能な方法で提示する有効な方法として現れる。 ここに記載された近距離匂い提示手順は、既存の匂い配送方法に関して重要である。それは、他のlのスクリーニングトリコイド感覚器1に収容されたORNだけでなく、任意の感覚器タイプに見られるORNにおける応答のための低変動性臭気物質である。この手順は、付臭剤を担持するガラスキャピラリーをアンテナ6に向かって物理的に移動させる代わりに、空気のパルスを介してフェロモン臭気物質を効率的に送達することを可能にする。本発明者らの変更は、臭気パルスを送達した後にのみパルミトレイン酸誘発応答を観察した実験結果によって支持されるように、臭気物質含有ガラス毛管で組織に直接接触する可能性を最小にする。さらに、本発明の方法は、迅速な臭気の開始およびオフセットの優れた時間的制御を提供する。 実証された手順の可能性にもかかわらず、それは制限がないわけではないことに留意すべきである。私たちの手順では、カートリッジの位置決めは、手動調整に完全に依存しています。これは、カートリッジを正確に配置することを技術的に困難にします試行から試用まで同じ場所にいる。さらに、正常に実行されるためには、プロトコルの重要なステップに特に注意する必要があります。場合によっては、所与の匂い濃度に対する非常に多様な応答が生じることがある。ほとんどの場合、原因は不整合なカートリッジの配置に起因しています。さらに、at4 sensillaの厳しい選択基準を記録前に観察する必要があります。適度な基礎発火率はニューロン損傷の欠如を示す一方で、高いシグナル対ノイズ比（ 図3C ）の均一なat4Aスパイクサイズは重要なベンチマークである。この手順の技術的難易度の程度は、求愛男性と対象女性との間の観察された近接性を厳密にシミュレートする範囲からフェロモン臭気物質を送達する能力によって相殺されている。 要約すると、匂い提示の方法は、Or47b ORNからのSSRでの使用のためのパルミトレイン酸へのアクセスを提供する。しかし、この技術は単一のフェロモンに限定されず、他の低揮発性の任意の匂い物質に容易に適応することができ、これまでにアクセスできない匂い物質をアッセイする際の汎用的な分析技術となる。

<html> ショウジョウバエ ORNは、エステル、アルコール、ケトン、ラクトン、アルデヒド、テルペン、有機酸、アミン、硫黄化合物、複素環および芳香族化合物を含む広範な炭素鎖長および様々な官能基を有する膨大な数の匂い物質に反応する2 、 3 。それらの物理化学的特徴が異なる匂い物質は、化合物の蒸気圧によって示される顕著に異なる揮発性を有することができる。特に、 ショウジョウバエのメラノガスターの生物学的に関連する臭気物質は、そのボラティリティにおいて著しく異なる。例えば、Ir92a ORNは、20℃で6322Hgの蒸気圧で、非常に揮発性の高いアンモニア4に反応します。対照的に、Or67d ORN類は男性フェロモン、 シス -vaccenyl酢酸（C VA）5、6、20°Cで43 mmHgであるの蒸気圧に応答します。 低揮発性の匂い物質に対する嗅覚応答の研究は、匂い物質が比較的長い距離（ すなわち、数センチメートル）にわたって担体空気流を介して送達される従来の匂い送達方法では特に困難である。所定の低揮発性臭気物質に臭気デリバリーシステムの設計に依存して、大きく変化することができ、例えば、C VAの高用量にOr67d ORN類の報告された応答は、約40 7の範囲である- &gt; 200スパイク/秒6さらに、従来の送達方法とCの VAの無効送達がそうVA C単独ではOr67d ORN類8を活性化するのに十分ではないという解釈につながる、偽陰性の結果に起因する。この解釈は、後で使用する別の研究によりチャレンジしました近距離匂い送達方法9それゆえ、それはイペラ低揮発性の臭気物質を効果的に提示するための強力な臭気供給システムを開発しています。 最近、我々は、Or47b ORNのリガンドとしていくつかの長鎖クチクラ脂肪酸を同定した。彼らはタイプ4 Antennal Trichoid Sensillum（at4）に収容されています。長鎖脂肪酸臭気物質の中で、我々はOr47bのORN類1を活性化することにより、男性の求愛を促進媚薬フェロモンとしてそのパルミトレイン酸機能を発見しました。しかし、従来の臭気送達法を用いた別の研究では、ラウリン酸メチルはOr47b ORNからの応答を誘発することが示されたが、パルミトレイン酸は同じ距離から提示された場合に応答を示さなかった10 。 VA Cと比較して、長鎖脂肪酸は、25°C 11未満で0.001 mmHgの蒸気圧であっても低揮発性です。長鎖脂肪酸臭気物質の本質的に低い揮発性は、経由するアンテナへの効率的な提示を妨げる​​。従来の匂いデリバリーシステムは、偽陰性の結果である可能性が高い10 。この不一致は、低揮発性臭気物質を提示する際の従来の匂い供給システムの不備を強調する。フライクチクラの臭いの効果的な送達には、臭気源と標的組織との間の近接性が必要であることが以前に示された6 。このように、完全に彼らはおそらく、自然12、13でショウジョウバエが遭遇され、そこから距離を模倣しながら、生物学的に活性なフェロモンの効果を特徴づけるために、我々は、最小距離が私たちの手順に高い優先順位を与えられる必要があることに同意しました。 我々の方法は、標準的な電気生理学リグおよび技術との互換性を含むさらなる利点を保持する。既存のリグセットアップでは、このプロトコルに対応するために最小限の変更が必要です。ほとんどのSSR手順では、わずかな調整しか必要ありません。この我々の技術はSSRで経験された研究者に容易にアクセス可能にする。さらに、我々の技術は、神経応答と刺激伝達を相関させる、鋭い発症およびオフセットを伴う低揮発性臭気物質の提示を可能にする。最後に、ハードウェアレイアウトは、ニオイのカートリッジ間の迅速な交換を容易にし、所望の用量範囲にわたってデータ収集を迅速化する。 我々は、参照電極および記録電極、成人ヘムリンパ様（AHL）溶液、付臭剤送達カートリッジ、および対応する嗅覚器の調製を検討することから始める。次に、パルミトレイン酸臭気物質溶液の調製、その後の記録用フライの調製について議論する。我々は、この方法を使用して得られた代表的なデータを提示する前に、トリコイド感知物質を選択し、付臭剤カートリッジの位置をより詳細に記録するための基準を検討することに進む。最後に、このtechniqの有用なアプリケーションを調べることで結論づけますue、いくつかの遭遇した問題、およびその解決策。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prep Setup &#38; Miscellaneous Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller Instrument&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>P97</td>
			<td>Pipette Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments 
			Sarasota FL USA</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>to make holding rods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate Glass Capillaries&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>AF100-64-10</td>
			<td>to make electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific 
			Pittsburgh PA USA</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td>for fly-prep station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch 
			St. Paul MN USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>for fly-prep station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus 
			Shinjuku Tokyo Japan</td>
			<td>BX51</td>
			<td>for recording rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastalina modeling clay</td>
			<td>Van Aken 
			North Charleston SC USA</td>
			<td>B0019QZMQQ</td>
			<td>for prep station and to stablize the holding rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm</td>
			<td>Nalgene 
			Rochester NY USA</td>
			<td>#156-4045</td>
			<td>to sterilize AHL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridge Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tip&#160;</td>
			<td>VWR 
			Radnor PA USA</td>
			<td>53508-810</td>
			<td>to make odor cartridges and fly prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Whatman 
			Maidstone Kent UK</td>
			<td>740-E</td>
			<td>to make odor cartridges&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer 
			Vernon Hills IL USA</td>
			<td>VX-06514-30</td>
			<td>to vaporize ethanol solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odorant Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cis-palmitoleic acid</td>
			<td>Cayman Chemical 
			Ann Arbor MI USA</td>
			<td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td>
			<td>Or47b odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-palmitoleic acid</td>
			<td>Cayman Chemical 
			Ann Arbor MI USA</td>
			<td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td>
			<td>Or47b odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Spectrum Chemical MFG.&#160; 
			New Brunswick NJ USA</td>
			<td>E1028-500MLGL</td>
			<td>to dilute palmitoleic acid&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rig Setup Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odorant Cartridge Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou 
			Grants Pass OR USA</td>
			<td>MX130R</td>
			<td>to position the olfactometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Vision software&#160;</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>FLOWVISIONSC</td>
			<td>software to control flow rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Controller</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>MC-2SLPM-D</td>
			<td>to control the flow rate for humidified air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Controller</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>MC-500SCCM-D</td>
			<td>to control the flow rate for odor stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices 
			Sunnyvale CA USA</td>
			<td>Ver. 10.4</td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air delivery tube</td>
			<td>Ace Glass 
			Vineland NJ USA</td>
			<td>8802-936&#160;</td>
			<td>to deliver humidified air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x objective lens&#160;</td>
			<td>Olympus 
			Shinjuku Tokyo Japan</td>
			<td>LMPLFL50X</td>
			<td>recording rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit 10</td>
			<td>Molecular Devices 
			Sunnyvale CA USA</td>
			<td>Ver. 10.4</td>
			<td>software for spike analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro 6</td>
			<td>WaveMetrics 
			Lake Oswego OR USA</td>
			<td>Ver. 6.37</td>
			<td>software for data analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audio Monitor</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>NPIEXB-AUDIS-08B</td>
			<td>Aurally reports individual spikes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular Amplifier</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>NPIEXT-02F</td>
			<td>to increase the amplitude of electrical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controller</td>
			<td>Warner Instruments&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>VC-8</td>
			<td>to control the opening of the valve for odor stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Electrode Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>MP-285</td>
			<td>to position recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage Amplifier</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>EQ-16.0008</td>
			<td>to increase the amplitude of electrical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix 
			Beaverton OR USA</td>
			<td>TDS2000C</td>
			<td>Visual report of individual spikes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recording from drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility

昆虫は、食物探索、捕食者回避、産卵、交尾など、生存に不可欠な幅広い行動を導くために、嗅覚に頼っています。変化する揮発性の無数の化学物質は、昆虫の嗅覚受容器ニューロン（ORN）を活性化する天然臭気物質として同定されている。しかしながら、低揮発性臭気物質に対する嗅覚応答の研究は、従来の臭気伝達方法を用いてそのような刺激を効果的に提示することができないことによって妨げられてきた。ここでは、インビボ Single-Sensillum Recording（SSR）の低揮発性臭気物質の効果的な提示を可能にする手順を説明します。臭気源と標的組織との間の距離を最小にすることによって、この方法は、生物学的に顕著なのアプリケーションが、パルミトレイン酸、求愛と交尾行動1に関与ORN類で実証効果を有する刺激性フェロモンを含むこれまでアクセスできない着臭剤、を可能にします。従って、我々の手順は、昆虫嗅覚およびフェロモン通信の研究のための低揮発性臭気物質の宿主をアッセイする新しい手段を提供する。

我々の技術は、パルミトレイン酸のシス （ 図5B ）異性体対トランス （ 図5A ）の相対的有効性を決定するために首尾よく適用された。本発明者らの代表的なデータは、 トランス -パルミトレイン酸が、 シスアイソフォームと比較した場合、Or47b ORNのより有効なリガンドであることを実証する（ 図5C ）。単一のニューロンを各フライから記録し、投与曲線ごとに12個のハエを記録し、合計24個のハエを記録した。集団データは、実験の3回の独立した反復から得られ、それぞれ8枚のハエが記録された。エラーバーは、 注目すべきは、匂いカートリッジの開口部とフライの頭部との間の距離は、記録の結果に重要な影響を及ぼすことである。 pへの有意な応答を引き出すOr47b ORNのalmitoleic acidを用いて、アンテナ1 （ 図6A ）から約4mm離れた近距離で匂い物質を提示した。パルミトレイン酸がアンテナからさらに離れて（約11mm）提示される場合、我々は同じOr47b ORNからの有意な応答をほとんど観察することができなかった（ 図6B ）。これらの結果は、パルミトレイン酸の近距離提示の重要性を強調している（ 図 6C〜D ）。データは、6匹のオスのハエ（ベルリン、7日齢）からの平行した実験から収集した。 1つのOr47b ORNが記録された/飛ぶ。エラーバーは、 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56147/56147fig1.jpg" /> 図1：カートリッジと累加計器のセットアップ。 （ A ）臭気カートリッジの準備。左から右へ：標準200μLピペットチップ、第1および第2のカートリッジセクション、および完成した付臭剤カートリッジを含む。 （ B ）オルファクトメーターに接続されたカートリッジ。第2セクションの下向きの角度を示します。 （ C ）装着された付臭剤カートリッジを備えた、マイクロマニピュレーター上に取り付けられた臭気送達管を描写する嗅覚器の設定。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56147/56147fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56147/56147fig2.jpg" /> 図2： ショウジョウバエの調製。 （ A ）フライ、カバースリップ、および保持棒の相対位置を示す完全な準備。 （ B ）準備のクローズアップビュー、フライの位置、その触角の向き、およびその粘膜を示す。保持棒はアルスターの上に置かれ、第3のアンテナセグメントを両面テープに固定する。 （ C ）リグの設定。すべての主要コンポーネントに注釈が付けられます。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56147/56147fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56147/56147fig3.jpg" /> 図3：SSRのためのat4 Sensillumの同定。 （ A ）脾臓に挿入された参照電極と、アルスタの上にある保持ロッドと、第3のアンテナセグメントの近くに配置された記録電極とを示す準備の4X図。 （ B ）at4トリコイドへの挿入のための、50Xの電極の図。インセット：記録電極の位置の説明。 （ C ）ベースラインスパイク活動の代表的なSSRトレースで、良好な（上の）または貧弱な（下の）信号対ノイズe比率。良好な信号対雑音比により、at4Aとat4Cのスパイクを確実に識別できます。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56147/56147fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56147/56147fig4.jpg" /> 図4：カートリッジの配置。 （ A ）匂いカートリッジは数ミリの距離からフライの頭の方に正に向けられています。 （ B ）別の角度からのprepとolfactometerの別のビュー。 （ C ）準備および嗅覚計の拡大図で、フライ・プレップ・スライドの上の付臭剤カートリッジの位置を示しています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56147/56147fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> 図5： シスまたはトランスパルミトレイン酸に反応したOr47b ORNの代表的なトレースおよび用量曲線。 （A）またはシス -palmitoleic酸（B） - at4AのトランスとOr47b受容体を発現するORN類から（AB）SSR。記録は7日齢のWTベルリン男性を用いて行った。対応するスパイクラスター（中央）および刺激刺激時間ヒストグラム（下、50msでビニングされた）がサンプルトレース（n = 12）の下に示されている。 （ C ）Or47b ORNスパイク応答をcis-またはtrans-パルミトレイン酸と比較した用量応答曲線。平均±sem（* p &lt;0.05; ** p &lt;0.01; t検定 ）。 Ctrl：パルミトレイン酸を含まないネガティブコントロール。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56147/56147fig5large.jpg" target="_blank">ここをクリックしてください</a>この図のより大きなバージョンを表示します。 <img alt="図6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56147/56147fig6.jpg" /> 図6：パルミトレイン酸によるat4Aの活性化には、近距離刺激が必要です。 7日齢の野生型ベルリン男性のat4A ORNからの（ AB ）SSR。 シス -パルミトレイン酸は、近距離（〜4mm）または遠方（〜11mm）（n = 6）で送達された。 （ C ）対応するスパイク応答の比較（50msでビンされ、刺激された周辺刺激時間ヒストグラム）。 （ D ）対応する平均スパイク応答の比較。パルミトレイン酸に対するat4Aの応答は、刺激距離が増加するにつれて著しく低下する。参考資料1の 図S4の許可を得て転載。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56147/56147fig6large.jpg" target="_blank">ここをクリックして</a>この図のより大きなバージョン。

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Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

このプロトコールの全体的な目標は、長鎖クチクラフェロモンに応答するショウジョウバエの嗅覚受容体ニューロンからの単一感覚記録のための低揮発性の付臭剤を提示する方法を示すことである。

からの電気生理学的記録<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;低揮発性の臭気物質に対するトリコイドセンシラ

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

8.8K ビュー.  University of California San Diego. このプロトコールの全体的な目標は、長鎖クチクラフェロモンに応答するショウジョウバエの嗅覚受容体ニューロンからの単一感覚記録のための低揮発性の付臭剤を提示する方法を示すことである。 

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Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

に概日リズムと睡眠のパラメータを研究するために運動活性を測定するショウジョウバエ</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

神経科学

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

ゼブラフィッシュ幼生における前脳電気生理学的記録

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, various technologies are being developed as control tools. A subset of these tools focuses on modifying the behavior of arthropods by attraction or repulsion. Therefore, arthropods are often the focus of behavioral investigations. Various tools have been developed to measure arthropod behavior, including wind tunnels, flight mills, servospheres, and various types of olfactometers. The purpose of these tools is to measure insect or arachnid response to visual or more often olfactory cues. The vertical T-maze oflactometer described here measures choices performed by insects in response to attractants or repellents. It is a high throughput assay device that takes advantage of the positive phototaxis (attraction to light) and negative geotaxis (tendency to walk or fly upward) exhibited by many arthropods. The olfactometer consists of a 30 cm glass tube that is divided in half with a Teflon strip forming a T-maze. Each half serves as an arm of the olfactometer enabling the test subjects to make a choice between two potential odor fields in assays involving attractants. In assays involving repellents, lack of normal response to known attractants can also be measured as a third variable.

A vertical, T-maze olfactometer is described for assaying the behavioral response of arthropods. The olfactometer allows the experimenter to measure choices performed by test subjects when subjected to two potential odor fields. Both attraction to and repulsion from odorants can be measured with this device.

匂い物質へ節足動物Responseの垂直T-迷路チョイスアッセイ

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

からの同時プリとポストシナプスの電気生理学的記録<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;神経筋共培養

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

無傷アダルトゼブラフィッシュの脳における電気生理学的記録

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

から電気生理学的記録<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt; Labellar味感覚器

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

同時電気生理学的記録およびげっ歯類の脳における阻害剤のマイクロ注射

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;光刺激に感光体と介在ニューロン<em&gt;インビボ</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.