プロジェクトは、ルンドベック財団、ノボ ノルディスク財団、デンマークの医学研究評議会、Ludvig とサラ Elsass 財団、イテ ・神経研究財団とカイ Dahlboms 財団によって支えられました。R.A 国立保健医療研究評議会のオーストラリア (#1091006) の初期のキャリア ドクトラル交わりに支えられて

ここで説明したすべての実験手順は動物愛護及びシドニー ニューサウス ウェールズ大学の倫理委員会に適合し、国民の健康と動物実験のためのオーストラリアの規則の医学研究評議会 (NHMRC) に従い行った。
1. 実験のセットアップ
注: この手順では 12 週齢、女性のロング ・ ラットが使用されました。
<ol><li>分 O2流量あたり 4% イソフルランと 1 L を用いた誘導室でラットを麻酔します。立ち直り反射テストにより十分な麻酔を確認し、誘導室から動物を削除する前にその不在を確認します。様々 な麻酔薬が神経興奮性10差動効果を持っていることに注意してください。</li>
	<li>安全に鼻の円錐形のアタッチメントで動物の鼻を配置および分 O2流量当たり 2.5% イソフルランと 1 L の維持投与量を提供します。</li>
	<li>動物の足の指をつまんで、目に優しく触れによってペダル撤退および角膜反射の両方をチェックするには、適切な麻酔を確認します。 注: 麻酔、乾燥を防ぐための目に獣医軟膏のアプリケーションは推奨されるが、必須ではありません、通常動物あたり 30 分を要します。</li>
	<li>フィードバック制御を用いた暖房のマットの直腸体温計プローブ使用で 37 ° C でラットの体温を維持します。40 の ° C より高い温度で発生する皮膚損傷を防ぐために暖房のマットと統合的な温度センサーを設定します。 注: お勧め (心拍数、酸素飽和度、体温、呼吸数) の監視と記録の生理対策に動物の生理学的モニタリング システムを使ってすべての 10 秒。周辺の温度はコア温度11 (図 1) のそれよりも寒いことがあるので、最適なレコーディング手順は下肢の温度のローカル測定を含める必要があります。</li>
	<li>防腐剤の手袋を着用し、常にプロシージャ全体で病原体フリーの環境を維持するために 70% エタノールで洗浄されている楽器を使用します。</li>
</ol>2 電気生理学的設定
<ol><li>この手順で低インピー ダンス プラチナ脳波 (EEG) 針電極を使用します。</li>
	<li>研究筋と 4 桁の背側面を介して参照電極を記録電極 (図 1; で示された紫色) を挿入することによって記録針電極を準備 (図 1で示されている;オレンジ) 複合筋活動電位 (概念地図) を記録します。</li>
	<li>刺激電極 (図 1; 緑で示されている) と前腕の優れた側面に皮膚を通して接地電極を配置します。筋肉組織を避けるために電極を挿入するときに注意します。</li>
	<li>経皮的刺激的な針の電極を陰極 (図 1; のラベル青) を挿入することによって準備約 4 mm、肘への遠位肘トンネルします。挿入 (図 1; のラベル付き赤) 陽極腋窩領域の皮膚を通して近位約 1 cm。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56102/56102fig1.jpg"> 図 1: ラットの前肢の針電極配置の図。陰極 (青) が約 4 mm 肘肘部管の遠位に挿入され、陽極 (赤色) を挿入腋窩領域の皮膚を通して近位約 1 cm。刺激電極を記録と前腕の優れた側面に皮膚を通して地面針電極 (緑) が挿入されます。研究筋と 4番目の桁の背側面を通して記録 (紫) と参照 (オレンジ) 針電極が挿入されます。温度プローブ (グレイ) は、母指球筋の優れた側面に配置されます。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56102/56102fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
3. 軸索興奮性の手順
<ol><li>齧歯動物の運動神経による半自動 TRONDNF プロトコルを実行、コンピューター制御された軸索興奮性プログラムは一定の電流刺激装置とアンプにリンク (材料の表を参照してください)。50/60 Hz ノイズ除去を使用して余分な 50 Hz 電気的なノイズを削除します。<ol>
<li>同時に CMAP 形態を可視化し、1 を適用することによって研究筋から CMAP を記録電極針で尺骨神経に ms 矩形波パルス。<ol>
<li>最適な録音を達成するため、振幅が一定の最適な相性の応答曲線になるまで慎重に角度や陰極の位置を調整するには、(図 2 a.) を達成しました。最適な位置を決定すると、一度変え電極ホルダーに陰極を安定させます。 注: 自動的に使用されるソフトウェア、下記テスト刺激を提供し増加またはしきい値を達成するために必要な電流を減少します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>1 の刺激強度を段階的に増加して刺激-反応曲線を記録 1 ms インパルス mA 最大応答が達成されるまで。 注: 図 2 b および 2 C の紫と緑の線はそれぞれ刺激強度と自動化されたシステムの増分増加を表します。追跡のしきい値のターゲットの振幅は刺激-反応曲線の急勾配法面の面積に対応する最大振幅の 40% に自動的に設定されます。「しきい値」に変更 (40% を引き出すために必要な刺激すなわち CMAP) による各種テスト刺激はの変数プロトコルの残りを得た。</li>
		<li>しきい値 electrotonus (TE) を含む複数の軸索興奮性パラメーターを記録電流しきい値 (私/V) 関係回復サイクル (RC) 参照に従って12。 注: コンピューター制御軸索興奮性プログラム評価閾値 (TE) を 100 ms の脱分極と過分極電流、サブスレッショルド電流制御しきい値の ± 40% と ± 20% で設定されています。後脱分極と過分極電流しきい値の変更は、自動的に偏光現在後現在偏光 100 ms と 12 ポイントの間に 14 の時点で記録されます。間接的しきい値 electrotonus 節間のコンダクタンスを評価、膜電位のマーカーです。私 V 関係が交互に +50 から強度 200 ms サブスレッショルド エアコン電流評価/-100% 10% ごとの増減制御しきい値の %。I/V の関係とは異なり、TE に電流が期間の長い、偏波の強度は 50 から変更徐々 に-100% % としきい値の変更は各強度 1 で評価は偏光の現在がなくなった後 ms。I/V の関係軸索1の整流特性への洞察力を提供します。対パルス パラダイム、初期の激刺激が適用されるこのパラメーター結節で発生するイベントの明確に定義された一連のテスト 200 さんに、2.5 ms から特定の間隔でテスト刺激のシリーズに続くと RC を評価します。激刺激軸索の領域。これらのイベントは、その後の応答を引き出すことが難しく、不応期と相対不応期1定量化している電位依存性の Na+チャネルの不活性化を含みます。これは節間と高速カリウム チャネル、superexcitability によって定量化による高められた興奮性の期間の充電が続きます。最後に、ゆっくり活性化カリウム チャネルは、subexcitability として定量化の減らされた興奮の後期を仲介します。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56102/56102fig2.jpg"> 図 2: 軸索興奮性テストから Raw データパネル A は、尺骨神経への刺激の増分増加後 abiphasic CMAP 応答曲線を示します。パネル B と C は、それぞれ刺激強度 (mA) と CMAP (mV) の振幅を表します。B と C の緑のコンポーネントは、刺激強度の自動増分減少と追跡のしきい値に必要な CMAP で関連付けられているシグモイド形減少を示しています。
4. ポスト電気生理学手続き
<ol><li>それは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻したまで別々 のケージにラットを転送します。動物は、無人と他の動物の会社で、それは完全に麻酔から回復するまでには、放置しないでください。ラットは完全に麻酔から回復、かつては、その元のケージに戻って転送します。</li>
	<li>調査の完了時に、バルビツール酸塩 (例えば lethabarb) の動物、例えば致命的な腹腔内注入の痛みを伴わないラットを安楽死させます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Krishnan, A. V., Lin, C. S. -. Y., Park, S. B., Kiernan, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+ion+channels+from+bench+to+bedside:+a+translational+neuroscience+perspective.">Axonal ion channels from bench to bedside: a translational neuroscience perspective.</a> Prog neurobiol. 89 (3), 288-313 (2009).</li><li>Lin, C. S. -. Y., Krishnan, A. V., Park, S. B., Kiernan, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulatory+effects+on+axonal+function+after+intravenous+immunoglobulin+therapy+in+chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy.">Modulatory effects on axonal function after intravenous immunoglobulin therapy in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy.</a> Arch neurol. 68 (7), 862-869 (2011).</li><li>Park, S. B., Goldstein, D., Lin, C. S. -. Y., Krishnan, A. V., Friedlander, M. L., Kiernan, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+abnormalities+of+sensory+nerve+function+associated+with+oxaliplatin-induced+neurotoxicity.">Acute abnormalities of sensory nerve function associated with oxaliplatin-induced neurotoxicity.</a> J. Clin. Oncol. 27 (8), 1243-1249 (2009).</li><li>Arnold, R., Pussell, B. A., Pianta, T. J., Lin, C. S. -. Y., Kiernan, M. C., Krishnan, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+calcineurin+inhibitor+treatment+and+peripheral+nerve+dysfunction+in+renal+transplant+recipients.">Association between calcineurin inhibitor treatment and peripheral nerve dysfunction in renal transplant recipients.</a> Am. J. Transplant. 13 (9), 2426-2432 (2013).</li><li>Bo&#235;rio, D., Greensmith, L., Bostock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitability+properties+of+motor+axons+in+the+maturing+mouse.">Excitability properties of motor axons in the maturing mouse.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 14 (1), 45-53 (2009).</li><li>Bo&#235;rio, D., Kalmar, B., Greensmith, L., Bostock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitability+properties+of+mouse+motor+axons+in+the+mutant+SOD1(G93A)+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Excitability properties of mouse motor axons in the mutant SOD1(G93A) model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Muscle &amp; Nerve. 41 (6), 774-784 (2010).</li><li>Alvarez, S., Calin, A., Graffmo, K. S., Moldovan, M., Krarup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+motor+axons+of+SOD1(G127X)+mutant+mice+are+susceptible+to+activity-dependent+degeneration.">Peripheral motor axons of SOD1(G127X) mutant mice are susceptible to activity-dependent degeneration.</a> Neurosci. 241, 239-249 (2013).</li><li>Fledrich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+neuregulin-1+modulates+disease+pathogenesis+in+rodent+models+of+Charcot-Marie-Tooth+disease+1A.">Soluble neuregulin-1 modulates disease pathogenesis in rodent models of Charcot-Marie-Tooth disease 1A.</a> Nat. Med. 20 (9), 1055-1061 (2014).</li><li>Vianello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+doses+of+arginine+butyrate+derivatives+improve+dystrophic+phenotype+and+restore+membrane+integrity+in+DMD+models.">Low doses of arginine butyrate derivatives improve dystrophic phenotype and restore membrane integrity in DMD models.</a> FASEB J. 28 (6), 2603-2619 (2014).</li><li>Osaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+anesthetic+agents+on+in+vivo+axonal+HCN+current+in+normal+mice.">Effects of anesthetic agents on in vivo axonal HCN current in normal mice.</a> Clin Neurophysiol. 126 (10), 2033-2039 (2015).</li><li>Biessels, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+animal+models+of+diabetic+neuropathy:+a+consensus+statement+of+the+diabetic+neuropathy+study+group+of+the+EASD+(Neurodiab).">Phenotyping animal models of diabetic neuropathy: a consensus statement of the diabetic neuropathy study group of the EASD (Neurodiab).</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 19 (2), 77-87 (2014).</li><li>Bo&#235;rio, D., Greensmith, L., Bostock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+mouse+motor+nerve+excitability+and+the+effects+of+polarizing+currents.">A model of mouse motor nerve excitability and the effects of polarizing currents.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 16 (4), 322-333 (2011).</li><li>Arnold, R., Moldovan, M., Rosberg, M. R., Krishnan, A. V., Morris, R., Krarup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+excitability+in+the+rat+forelimb:+a+technique+to+improve+translational+utility.">Nerve excitability in the rat forelimb: a technique to improve translational utility.</a> J. Neurosci. Methods. 275, 19-24 (2017).</li><li>Moldovan, M., Alvarez, S., Krarup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+excitability+during+Wallerian+degeneration.">Motor axon excitability during Wallerian degeneration.</a> Brain. 132 (Pt 2), 511-523 (2009).</li><li>Madison, R. D., Robinson, G. A., Krarup, C., Moldovan, M., Li, Q., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electrophoresis+and+in+vivo+electrophysiology+of+peripheral+nerve+using+DC+field+stimulation.">In vitro electrophoresis and in vivo electrophysiology of peripheral nerve using DC field stimulation.</a> J. Neurosci. Methods. 225, 90-96 (2014).</li><li>Moldovan, M., Krarup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Na+/K++pump+function+following+repetitive+activity+in+mouse+peripheral+nerve.">Evaluation of Na+/K+ pump function following repetitive activity in mouse peripheral nerve.</a> J. Neurosci. Methods. 155 (2), 161-171 (2006).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

記載された手順を示します、シンプルで信頼性の高い、低侵襲技術ができる生物物理物性評価および軸索の膜電位時間の短い期間でです。神経の露出を必要とする他のより侵襲的な技術と比較して軸索興奮性のテスト法誘導の生理状態を維持する体内の評価ができ最小限の組織損傷、興味の神経、繰り返し測定が可能します。
確実に一貫性のある結果が、対処する必要がありますいくつかの方法論的考察です。このような要因の一つは、濃度と麻酔薬の種類です。それは以前、イソフルランは過分極作動した循環ヌクレオチド ゲート チャネル10の効果実証されています。また、メデトミジン、ミダゾラム、ブトルファノールの注射麻酔薬の混合物は調べたし、も10時間以上神経の興奮性に及ぼす影響を実証します。メデトミジン/ミダゾラム/フェンタニル (MMF) は神経の興奮性にはほとんど影響を持っているが表示され、正常にされている神経に時間をかけてもその効果、多く神経興奮性研究7,13,14使用興奮は体系的に解明されていません。注記のうち、この麻酔薬はフェンタニルは厳格な輸入規制に規制物質として米国とオーストラリアで入手が困難。関係なく、選択した麻酔投与量と麻酔下に注意深く監視する必要解析において考慮のため。
考慮する別の要因は、電極の品質です。強くて長時間過分極・脱分極電流軸索興奮性の適用のための研究高品質電極が必要です。本研究では低インピー ダンス プラチナ脳波 (EEG) 針電極が使用されました。低インピー ダンス電極通常キロ オームの範囲内であり、プラチナの脳波電極従来作動する - 0.5 内低インピー ダンス電極との資格を 5 k ω の範囲。軸索興奮性プログラム電流出力を記録し、ターゲット out の電圧とインピー ダンスを計算して現在は、このプロトコルは15の典型的な長さは、30 分間安定それ既に確立されています。さらに、これらの電極は、最近マウス16で導入されているし、偏光効果14,15を受けないことがわかった。したがって、偏波が実験プロシージャの間に問題になりません。
興味の神経を公開プロトコルとは対照的は、これらの研究は、刺激的な電極のおおよその位置になりますそのままモデルを利用します。したがって、縦断研究に電極配置の正確な複製は難しいかもしれません。これにもかかわらず、異なる麻酔と以前の研究は脛骨と仙骨神経13に見られるように 3 別々 の研究で 30/34 尺骨神経興奮性パラメーターの良い再現性を実証しました。さらに、この研究では、右と左の概念地図の比較は一貫性 (図 4)、この限界を相殺するために十分な正確かつ適切な電極配置を示唆を示した。
CMAP 応答を取得中にいくつかの重要な手順があります。刺激針電極の適切な一貫した配置は、振幅の再現性のある測定に不可欠です。さらに、バック グラウンド ノイズを最小限に抑えるための針電極の適切な配置を確保するため不可欠です。したがって、同時に応答曲線に視覚化する刺激の針電極を配置することが一貫性のある配置を確認することが重要です。
神経疾患の動物モデルのこの低侵襲技術の使用は病態生理学的変化と早期の疾患特性を調査するための貴重なツールにあります。これらはバイオ マーカーとして機能し、手の機能の行動対策と連携して新しい治療的介入の検討を容易にする可能性があります。また、齧歯動物、これらのテクニックの検証は、新規化合物の薬物動態および薬力学的関係の調査を有効にできます。これがフェーズ 1 および 2 の臨床試験前に治療化合物のよりよい翻訳を有効にします。

電気生理学的技術の使用は神経疾患における末梢神経機能の生体内で調査のために不可欠なツールです。従来神経伝導メソッドは、潜時や振幅運動の活動電位を記録する激刺激を利用します。これらの技術は、繊維の実施数と最速の線維の伝導速度したがって有用な情報を提供します。貴重な相補的なツールは、軸索興奮性のテストのことです。この手法は、イオン チャネル、エネルギー依存性ポンプ、イオン交換プロセス、膜電位の活性などの末梢神経の生物物理学的プロパティを直接評価する洗練された電気生理学的刺激のパターンを使用してください。1。
病態生理学的プロセスと様々 な脳神経疾患の治療介入の効果を検討する臨床場面における軸索興奮性テストを利用して一般的。重要なは、軸索興奮性対策2静脈内の免疫グロブリン (IVIg) 療法など末梢神経機能に影響を与える治療に敏感である化学療法3カルシニューリン阻害剤 (CNI) 治療4. 臨床研究がこれらの研究は、重要な洞察を提供している、初期の病の特徴と治療の新しい選択肢5の調査を排除する頻繁。したがって、神経疾患の動物モデルでこれらのメソッドの使用は最近トラクション6,7,8,9を得ています。確かに、これらのメソッドは、トランスレーショナル ・ リサーチを推進したがって、これらの疾患に関連付けられている特定の神経の興奮性の変化を理解する機会を提供します。
ここで説明する手順は、そのままのラットの尺骨神経にレコードの軸索興奮性対策にシンプルで信頼性の高い方法です。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>QTracS Program</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Axonal excitability program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AM-Systems 2200, Analog Stimulus Isolator, 2200V/50Hz</td>
			<td>SDR Scientific</td>
			<td>850005</td>
			<td>Stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Performance AC Amplifier Model LP511</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humbug 50/60Hz Noise eliminator</td>
			<td>Quest Scientific Instruments</td>
			<td>726310</td>
			<td>Noise eliminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Impedance Platinum Monopolar Subdermal Needle Electrodes</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>F-E2-24</td>
			<td>Recording electrodes, 10 mm length, 30 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Impedance Platinum Electroencephalography Needle Electrodes</td>
			<td>Cephalon</td>
			<td>9013L0702</td>
			<td>Stimulating electrodes, 10 mm length, 30 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifunction I/O Device Model USB-6341</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Multifunction input/output device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron Base Plate IP</td>
			<td>Narishige Scientific Instrument Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for holding stimulating needle electrode in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating X-block X-4</td>
			<td>Narishige Scientific Instrument Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for holding stimulating needle electrode in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stand GJ-8</td>
			<td>Narishige Scientific Instrument Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for holding stimulating needle electrode in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator M-3333</td>
			<td>Narishige Scientific Instrument Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for holding stimulating needle electrode in place</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo electrophysiological measurement of the rat ulnar nerve with axonal excitability testing

電気生理学末梢神経機能のin vivoの客観的な評価ができます。潜時や振幅検出慢性軸索損失と脱髄、それぞれなど伝統的な神経伝導を測定します。イオン チャンネル、ポンプ、急性機能に関連し、退化的なイベントの前にことがあります交換のアクティビティに関する情報を提供することによってこれらの措置により軸索興奮性技術"しきい値を追跡"を展開します。そのため、神経疾患の動物モデルにおける軸索興奮性の使用新しい治療的介入を評価するために有用な生体内測定があります。ここでラットの尺骨神経で運動軸索興奮性技術の複数の措置の実験装置について述べる。
動物はイソフルラン麻酔、麻酔の定数と十分な深さを確保するため慎重に監視します。体温、呼吸、心拍数、血液中の酸素の飽和を継続的に監視します。軸索興奮性の研究は、尺骨神経と前肢足の研究筋から記録の経皮的刺激を使用して実行されます。正しい電極配置、刺激強度の増加とともに振幅の増加明確な複合筋活動電位が記録されます。自動化されたプログラムを利用する一連の次の順序で 5 特定の興奮性対策を生成する電気パルスを提供する: 刺激応答性状、強度期間時定数、しきい値 electrotonus、電流しきい値関係と回復のサイクル。
ここで表示されるデータは、これらの措置を繰り返し同じ日に評価すると左と右尺骨神経との間の類似性を示すを示します。この設定にこれらの手法の制限は、投与量と麻酔時間の効果です。慎重に監視し、これらの変数の記録は、解析時に考慮のため行わなければなりません。

ラットの尺骨神経の電気生理学的措置は、この議定書が得られました。図 3は、12 週齢雌長いエバンス ラットの左尺骨神経から記録担当者を示します。複合筋活動電位は、同時にアクティブになっている繊維を導電性の数に関連します。激ピーク応答 (mV) (図 3 a) は、(図 2 b) 応答の変化がないまで刺激を段階的に増加するときに達成ピーク応答を示します。
図 3 bは、電流電圧を表します (私/V) 長い期間 (200 ms) とその強度の電流によって生成される関係は、50 から 10% 単位で変更-100% しきい値の %。I/V 関係脱分極と過分極電流に対する電流の違いを調べることによって内側と外側の整流を評価します。左下のセクションは、内向き整流収容過分極し、内向き整流性コンダクタンス1活性化を反映しています。右上の象限は、高速と低速の K+チャネル活性化と脱分極現在まで利用可能な外へ向かう整流に反映されます。
節間のコンダクタンスは、長いサブスレッショルド脱分極と過分極電流に応答しきい値 electrotonus 波形 (図 3) を使用して調べることができます。過分極と TE を脱分極性しきい値変更特定の時間ポイント 10-20 ms、20-40 ms と 90-100 ms 間の平均として計算することができます変数があります。
ケガや治療上の介在のアプリケーションのための時間の経過とともに変更は、神経興奮性パラメーターに固有の変更を引き起こす可能性があります。これは病態生理的変化、早期疾患特性と神経疾患の動物モデルで治療効果に関する有用な生体内情報を提供可能性があります。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56102/56102fig3.jpg"> 図 3: 代表的な軸索興奮性プロットします。(A) 刺激-反応曲線八田ピーク応答 (mV) を描いたします。(B) 電流-電圧 (私/V) +50 に至る 200 ms 偏光刺激によって生成される関係-100% しきい値電流 %。(しきい値 C) electrotonus 長期サブスレッショルド偏光現在 20%、40% が (上記の y 軸上の 0) 脱分極と (以下 y 軸の 0) 過分極電流によって誘発されるへの応答波形を示します。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56102/56102fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
N の左し、右前肢で行われた連続した軸索興奮性テスト 4 ラット (12 週齢) を =。左と右の両方の録音は、ペダルの逃避反射の損失の後 35 分以内完了しました。対非パラメトリック ウィルコクソン符号付き順位検定を用いて分析を行った。これらの分析は、左と右尺骨神経軸索興奮性変数のいずれかの間に有意差を認めなかった。標準的な神経伝導パラメーター、CMAP 振幅遅延 (図 4 a と B) と superexcitability、しきい値 electrotonus (話した) 過分極を含む神経興奮性変数の一貫性を示した90-100 (図 4 および D)。しかし、以前の研究10はイソフルラン麻酔下でパラメーターを時間の経過とともに大きな変化が発生する示されている (ディスカッションを参照してください)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56102/56102fig4.jpg"> 図 4: 録音を意味 (n = 4) (A) ピーク応答の待ち時間 (B) superexcitability (C) と (D) 過分のしきい値の electrotonus (90-100 ms) 左 (赤) と右 (青) 尺骨神経の両方で取得します。誤差範囲 (SEM) 平均値の標準誤差を示します。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56102/56102fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing at JoVE.com

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

生体内で軸索興奮性のテストでラットの尺骨神経の電気生理学的測定

軸索興奮性のテクニックは、病態と不可逆的な変性イベントの前に生体の変化を調べるための強力なツールを提供します。この原稿は、麻酔下ラットの尺骨神経のこれらのテクニックの使用方法を示します。

Electrophysiology enables the objective assessment of peripheral nerve function in vivo. Traditional nerve conduction measures such as amplitude and ...

in-vivo-electrophysiological-measurement-rat-ulnar-nerve-with-axonal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

9.1K ビュー.  University of New South Wales. 軸索興奮性のテクニックは、病態と不可逆的な変性イベントの前に生体の変化を調べるための強力なツールを提供します。この原稿は、麻酔下ラットの尺骨神経のこれらのテクニックの使用方法を示します。

ビデオ: In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

Nerve Excitability Assessment in Chemotherapy-induced Neurotoxicity

Chemotherapy-induced neurotoxicity is a serious consequence of cancer treatment, which occurs with some of the most commonly used chemotherapies1,2. Chemotherapy-induced peripheral neuropathy produces symptoms of numbness and paraesthesia in the limbs and may progress to difficulties with fine motor skills and walking, leading to functional impairment. In addition to producing troubling symptoms, chemotherapy-induced neuropathy may limit treatment success leading to dose reduction or early cessation of treatment. Neuropathic symptoms may persist long-term, leaving permanent nerve damage in patients with an otherwise good prognosis3. As chemotherapy is utilised more often as a preventative measure, and survival rates increase, the importance of long-lasting and significant neurotoxicity will increase.
There are no established neuroprotective or treatment options and a lack of sensitive assessment methods. Appropriate assessment of neurotoxicity will be critical as a prognostic factor and as suitable endpoints for future trials of neuroprotective agents. Current methods to assess the severity of chemotherapy-induced neuropathy utilise clinician-based grading scales which have been demonstrated to lack sensitivity to change and inter-observer objectivity4. Conventional nerve conduction studies provide information about compound action potential amplitude and conduction velocity, which are relatively non-specific measures and do not provide insight into ion channel function or resting membrane potential. Accordingly, prior studies have demonstrated that conventional nerve conduction studies are not sensitive to early change in chemotherapy-induced neurotoxicity4-6. In comparison, nerve excitability studies utilize threshold tracking techniques which have been developed to enable assessment of ion channels, pumps and exchangers in vivo in large myelinated human axons7-9.
Nerve excitability techniques have been established as a tool to examine the development and severity of chemotherapy-induced neurotoxicity10-13. Comprising a number of excitability parameters, nerve excitability studies can be used to assess acute neurotoxicity arising immediately following infusion and the development of chronic, cumulative neurotoxicity. Nerve excitability techniques are feasible in the clinical setting, with each test requiring only 5 -10 minutes to complete. Nerve excitability equipment is readily commercially available, and a portable system has been devised so that patients can be tested in situ in the infusion centre setting. In addition, these techniques can be adapted for use in multiple chemotherapies.
In patients treated with the chemotherapy oxaliplatin, primarily utilised for colorectal cancer, nerve excitability techniques provide a method to identify patients at-risk for neurotoxicity prior to the onset of chronic neuropathy. Nerve excitability studies have revealed the development of an acute Na+ channelopathy in motor and sensory axons10-13. Importantly, patients who demonstrated changes in excitability in early treatment were subsequently more likely to develop moderate to severe neurotoxicity11. However, across treatment, striking longitudinal changes were identified only in sensory axons which were able to predict clinical neurological outcome in 80% of patients10. These changes demonstrated a different pattern to those seen acutely following oxaliplatin infusion, and most likely reflect the development of significant axonal damage and membrane potential change in sensory nerves which develops longitudinally during oxaliplatin treatment10. Significant abnormalities developed during early treatment, prior to any reduction in conventional measures of nerve function, suggesting that excitability parameters may provide a sensitive biomarker.

This abstract describes a novel method to assess the development of neurotoxicity in patients receiving chemotherapy treatment. While conventional assessment methods are limited in their ability to detect early changes in nerve function, nerve excitability techniques provide early identification of patients at risk of severe neurotoxicity and insight into pathophysiology.

化学療法誘発性神経の神経興奮性の評価

Chemotherapy-induced neurotoxicity is a serious consequence of cancer treatment, which occurs with some of the most commonly used chemotherapies1,2. ...

神経科学

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

マウス坐骨神経に生体内電気生理学的測定値の

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する<em&gt;インビボ</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

同時<em&gt; ex vivoで</emによる二つの網膜の&gt;機能テスト<em&gt; in vivoで</em&gt;電図システム

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

実験視神経の脱髄のラットモデルにおける視覚誘発電位の記録

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

エレクトロポレーションによる齧歯類坐骨神経内のシュワン細胞へのインビボ遺伝子導入で

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings provide a sensitive approach to measure nerve conduction in humans and rodent models. To broaden the technical possibilities for electromyography in mice, the measurement of compound muscle action potentials (CMAPs) from the brachial plexus nerve in the forelimb using needle electrodes is described here. CMAP recordings after stimulating the sciatic nerve in hindlimbs have been previously described. The newly introduced method here allows for the evaluation of the nerve conductivity at an additional site, and thus provides a more profound overview of the neuromuscular functionality. The technique provides information on both the relative number of functional axons and the myelination level. Thereby, this method can be applied to assess both axonal diseases as well as demyelinating conditions. This minimally invasive method does not require extraction of the nerve and therefore it is suitable for repeated measurements for longitudinal follow-up in the same animal. Similar recordings are performed in clinical setups to emphasize the translational relevance of the method.

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

The measurement of nerve conduction is a useful tool to assess mouse models of neurodegeneration but it is frequently only applied to stimulate the sciatic nerve in hindlimbs. Here, we describe a technique to measure compound muscle action potential (CMAP) in vivo in the mouse forelimb muscles innervated by the brachial plexus.

生体内で運動ニューロンの変性症のマウスモデルの前肢からの複合筋活動電位の電気生理学的測定

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Screening of Axonal Degeneration in Carpal Tunnel Syndrome Using Ultrasonography and Nerve Conduction Studies

Axonal degeneration, indicative of surgical decompression, may coexist in carpal tunnel syndrome (CTS) as the disease progresses. However, the current diagnostic and severity gradation system cannot clearly indicate its coexistence, resulting in&#160;confusion of appropriate treatment prescription. There are also constraints in conventional methods for&#160;differentiation as well. This study aims at introducing an innovative, efficient, and quick screening protocol to differentiate axonal degeneration associated with CTS, using ultrasound and nerve conduction studies (NCS). It starts by using NCS to perform orthodromic stimulation at the wrist, to obtain the sensory conduction of the median and the ulnar nerves respectively. Meanwhile, the motor conduction&#160;of the median nerve is collected by stimulating the palm, wrist, and elbow, followed by the stimulation of the ulnar nerve at the wrist,&#160;below and above the elbow. Then, an ultrasound assessment is performed, using a linear array transducer, with cross-sectional area (CSA) and perimeter (P) at the wrist and at the one-third distal forearm calipered. Ratios (R-CSA, R-P) and changes from wrist to one-third distal forearm (&#916;CSA and &#916;P) are calculated according to a standard format. Potential axonal degeneration coexisting in CTS will be screened according to the criteria of NCS and cut-off values of ultrasound measurements established in a previous study. In terms of its noninvasiveness, low cost, convenience, and efficiency, it is easy to apply ultrasound complimentarily in clinical practice to prescreen patients with potential coexisting axonal degeneration. Nevertheless, the ultrasonographic imaging cannot directly reflect axonal degeneration. It still relies on conventional but invasive methods&#160;such as electromyography (EMG) and biopsy&#160;for confirmation if needed.

Here we present a protocol using nerve conduction studies and ultrasound to screen potential axonal degeneration associated with carpal tunnel syndrome. The criteria for differentiation are established. Compared to conventional approaches, this method is noninvasive, convenient, and efficient, with an overall satisfactory accuracy, sensitivity, and specificity.

超音波検査と神経伝導検査を使用して手根管症候群における軸索変性のスクリーニング

Axonal degeneration, indicative of surgical decompression, may coexist in carpal tunnel syndrome (CTS) as the disease progresses. However, the current ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

軸索抑制と再生を研究するラットモデルにおける顔面神経外科

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...