この研究は、イスラエル癌研究基金のResearch Career Development Award、Israeli National Nanotechnology Initiativeの助成金、Personalized Theranostics（VP-K）のNanomedicinesに関するFocal Technology AreaのHelmsley Charitable Trust、およびNational健康教育機関R01GM076360（XCへ）。

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	<li>Padler-Karavani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aiming+at+the+sweet+side+of+cancer:+Aberrant+glycosylation+as+possible+target+for+personalized-medicine.">Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine.</a> Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).</li><li>Amon, R., Reuven, E. 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著者は何も開示することはない。

成功したグリカンマイクロアレイ作製には注意深い計画が必要であり、プロトコルにいくつかの重要なステップが含まれています。これらは、（1）すべての後続のパラメータ（ 例えば、距離、間隔、サンプルの量、および印刷）を定義ブロックおよびプレートのレイアウトを計画します。 （2）ピンの清掃およびピンの完全性の確保。これはスポットの均質性を制御するために重要である。 （3）印刷中に高湿度を維持する。これは、スポットの均質性を損なう可能性のある長い印刷ランの間に試料の蒸発を避けるために重要である。 （4）結果に影響を与え得る適切なアライメントおよび分析パラメータ（ 例えば、バックグラウンド減法、閾値、およびスポットサイズの柔軟性）を選択すること。 この方法は、特定の実験計画および目標を満たすようにさらに改変することができる。例えば、プリスポット番号は、アレイ上に印刷される各タイプの材料に適合するように変更することができる。ピン洗浄工程印刷物は、異なる印刷物に適合するように最適化することができ、短いまたは長い洗浄サイクルで行うことができる。さらに、ピンがディップ毎に印刷するスポットの量は、より多くのスポットまたはより少ないスポットを含むように変更することができるが、アレイ上で使用される材料の種類ごとに個別の較正を必要とする。蛍光標識のタイプおよびその濃度は、それが結合のための適切な化学基（ すなわち、エポキシ被覆スライドのための第一級アミン）を含有する限り修飾することができる。 STD曲線の濃度およびタイプは、延長することができる（ 例えば、ヒト/マウス/他の生物体IgG、IgM、IgA など ）。緩衝液の条件は、異なる材料に適合するように最適化することができ、好ましくはアレイへの非特異的結合を避けるために第一級アミンを含む材料を欠くことで、バックグラウンドが増加する。重要なことに、Neu5Gcの最適な検出のために、生物学的ブロッキング試薬は、Neu5Gc-シアログリカン検出を減少させる可能性があるため、 Neu5Gcを含まなくてはならない（ 例えば、 BSA乳を避ける）ncrease背景19、20。一次および二次検出濃度は、高いバックグラウンドおよび非特異的結合を避けるために最適化すべきである。さらに、スキャンパラメータ（ 例えば、パワー、ゲイン、および解像度）を変更して、バックグラウンドを低減したり、低信号を強調したりすることができます。最後に、アライメントおよび解析パラメータは、高いバックグラウンドまたは異なる形状のフィーチャに合うように変更することができます。グリカンマイクロアレイデータを報告するための推奨基準に関するさらなる情報およびガイドラインは、MIRAGEイニシアチブ17によって最近記載されており、最終的にデータ共有および解釈を容易にすることができる。 要約すると、グリカンマイクロアレイは、グリカンと生体分子の相互作用を調べるための堅牢なツールを提供し、様々な生物学的サンプルに適合させることができる。抗Neu5Gc抗体は、ヒトの疾患において異なる役割を果たす23 。例えば、癌において、抗Neu5Gcを抗体は二重の役割を果たしている。一方で、彼らは潜在的なバイオマーカーとして機能しますが、一方で、彼らは潜在的な治療薬7、21、24となります。これらの抗体はまた、アテローム性動脈硬化症25の増悪、異種移植20、26の効力、およびグリコシル化バイオ治療薬27の効果に寄与する。したがって、様々なヒト試料中の抗Neu5Gc抗体のプロファイリングが関心を集めており、ここに記載されているようなハイスループットアッセイは、ヒトの健康および疾患におけるそれらの役割の理解を促進することに寄与し得る。

Siasは、脊椎動物の細胞表面糖タンパク質および糖脂質上のグリカン鎖を覆う酸性糖である。 SIA発現は、癌細胞1に変更し、進行および/または転移2,3と相関されます。哺乳類における主要なシアル酸の形の二つはNeu5Acで、そのヒドロキシル形、Neu5Gcを2です。ヒトは、CMAH酵素をコードする遺伝子の特異的不活性化のためにNeu5Gcを合成することができない。この非人間シアル酸は、代謝、食事のNeu5Gcが豊富な食品（ 例えば、赤肉）4、5から「自己」発信されたものとして、人間の細胞に組み込まれています。 Neu5Gcは、ヒト上皮および内皮の細胞表面上に低レベルで存在するが、特に癌腫に蓄積する。 Neu5Gcは、ヒト体液性免疫系2,6によって異物として認識されます。Neu5Gcグリカンの抗原複雑さは、すべての人間6における抗のNeu5Gc抗体応答の複雑さによって反射された、のNeu5Gc修正、結合、基礎となるグリカン及び足場、およびそれらの濃度を含む複数のレベルで生じ得ます。これらの抗体の一部は、癌腫バイオマーカーおよび潜在的な免疫療法剤として役立つ7 。異なるsialoglycans 8の化学酵素合成の出現は、グリカンマイクロアレイ技術9、10の使用によって容易にそのような抗体のより詳細な分析のために道を開きました。このように、天然および合成炭水化物の大きなライブラリーの促進準備と操作で、グリカンマイクロアレイは、生体分子10、11の無数と炭水化物の相互作用を調査するための強力なハイスループット技術となっています</sup&gt; 12、13。アレイ形式では、最小限の量の材料が使用され、生物学的に関連するグリカンのこの多価ディスプレイは、単一の実験において数千の結合相互作用の調査を可能にする。重要なことは、この技術はまた、バイオマーカー探索へと様々なサンプル7、12で免疫応答をモニタリングに適用することができます。 成功したグリカンマイクロアレイ作製には、プリンターロボットタイプ、グリカンコンジュゲーション化学、および検出光学系という3つの重要な側面を考慮する必要があります。印刷装置の考察に関しては、接触型および非接触型の2つの技術が利用可能である。接触印刷では、1〜48個のスチールピンを、グリカン溶液を含むマルチウエル源プレートに浸漬し、ガラススライド表面に直接接触させることにより官能化ガラススライド上にスポットする。解の量deスライドに生きているのは、スライド表面上の持続時間の関数である。通常、試料はスライド表面に印刷される前にガラスブロック上に先ず予めスポットされ（均質なスポットに到達する）。非接触プリンタ（ 例えば、圧電式プリンタ）では、制御された電気信号を用いてグリカンをガラスキャピラリから印刷する。電気信号は、接触印刷に比べてより正確な印刷を達成するために細かく較正することができる。スポットのサイズおよび形態も比較的均一である。さらなる利点は、印刷後にサンプルをソースプレートに再循環させることである。それにもかかわらず、ピエゾ電子式プリンタの主な欠点は、印刷チップの制限（4または8）であり、スライドの安定性、温度、湿度およびサンプルの蒸発に特に注意する必要がある非常に長い印刷時間をもたらす。非接触型インクジェットプリンタは、より大きなサンプル体積14を必要とする。 <p class = &quot;jove_content&quot;&gt;印刷法の利用可能なオプションが限られているのに対して、グリカン結合化学はより複雑な選択肢であり、選択肢は数多くあります。選択された固定化化学は、グリカン上の活性基および摺動表面反応性の両方を考慮しなければならない。特定のマイクロアレイ表面上に固定化されるグリカンは、合成的に合成されるかまたは天然に単離されるかのいずれも、同一の反応基を必要とする。さらに、グリカンは純粋で均質である必要があります。一方、固定化表面および化学物質は、再現性および信頼性のある付着密度を提供すべきである。複数の固定化方法は、共有結合または非共有結合（物理吸着）アタッチメント10、11、12、13のいずれかを用いて開発されてきました。 Uninitiateのための印刷されたグリカンマイクロアレイ技術に関する詳細な情報についてはDの研究者は、これらの優れたレビューは13、15を参照してください。重要なのは、グライコミクス実験（MIRAGE）イニシアチブのための最近の最低限必要な情報は、サンプル調製16のためにと、この成長分野で基準を改善するために17を解析し、糖鎖マイクロアレイからのデータを報告するためのガイドラインを説明します。 ここでは、特定の接触ナノプリンターを用いて16ウェルフォーマットでシアログリカンマイクロアレイを作製するための詳細なプロトコールについて説明する。各グリカンは、エポキシ活性化ガラススライドへのそれらの共有結合を媒介する第一級アミンを有する。我々はまた、様々なヒト血清サンプル、抗体、およびSia結合性植物レクチンを用いた1つのスライドの開発および分析について記載する。 Sialoglycanマイクロアレイアッセイは、アレイ作製、プロセシング、展開、および分析を含むいくつかの主要なステップを含む。アレイの製造には、arグリカンおよびソースプレートの準備、ナノプリンターのプログラミング、およびスライドの印刷を行うことができます。続いて、スライドを処理し、開発し、分析する（ 図1 ）。

<table><tbody><tr><td>Primary-amine containing sialoglycans</td><td>Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services)</td><td>Contact info@glycohubusa.com for compound requests</td><td>Printed glycans</td></tr><tr><td>Monosodium phosphate monohydrate</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Printing buffer component</td></tr><tr><td>Disodium phosphate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>Printing buffer component</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Hy-Labs</td><td>BP-507/500D</td><td>Printing buffer/ incubation/washing buffer</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Slide blocking reagent</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G-7893</td><td>Printing buffer component</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>0700/08</td><td>Slide blocking reagent</td></tr><tr><td>Ovalbumin (Grade V)</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td>Slide Blocking protein</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>Slide washing detergent</td></tr><tr><td>Alexa 555-Hydrazide</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A20501MP</td><td>Marker on array</td></tr><tr><td>ChromPure Human IgG, whole molecule</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>009-000-003</td><td>Printing component</td></tr><tr><td>Biotinylated- SNA</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1305</td><td>Plant Lectin &amp;ndash; binding Sia-alpha2&amp;ndash;6-linked</td></tr><tr><td>Biotinylated-MALII</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1265</td><td>Plant Lectin &amp;ndash; binding Sia-alpha2&amp;ndash;3-linked</td></tr><tr><td>Chicken-anti Neu5Gc IgY</td><td>BioLegend</td><td>146903</td><td>Primary detection</td></tr><tr><td>Cy3-Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-0848</td><td>Biotin binding</td></tr><tr><td>Cy3-anti Human IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>109-165-088</td><td>Secondary detection against human IgG</td></tr><tr><td>Cy3-anti Chicken IgY</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-165-155</td><td>Secondary detection against chicken IgY</td></tr><tr><td>Human sera samples</td><td>Israeli Blood Bank</td><td></td><td>Primary detection</td></tr><tr><td>Compressed Nitrogen (Grade 5)</td><td></td><td></td><td>General dusting/drying tool</td></tr><tr><td>Epoxy-coated slides</td><td>Corning</td><td>40044</td><td>Slides</td></tr><tr><td>Epoxy-coated slides</td><td>PolyAn</td><td>2D 104-00-221</td><td>Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 &amp;micro;m size spots.</td></tr><tr><td>384-well microtiter plate</td><td>Genetix</td><td>2070</td><td>Printing plate</td></tr><tr><td>VWR lab marker</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td>Slide labeling</td></tr><tr><td>Staining Tube</td><td>ArrayIt</td><td>MST</td><td>Slide developing tool</td></tr><tr><td>Staining bath</td><td>VWR</td><td>25608-904</td><td>Slide developing tool</td></tr><tr><td>Slides glass holders</td><td>VWR</td><td>631-9321</td><td>Slide developing tool</td></tr><tr><td>GenePix Scanner</td><td>Molecular devices</td><td>4000B</td><td>Slide scanner</td></tr><tr><td>LM-60 NanoPrinter</td><td>ArrayIt</td><td>LM-60</td><td>Array printer</td></tr><tr><td>Pins</td><td>ArrayIt</td><td>946MP3</td><td>Printing pins</td></tr><tr><td>ProPlate Module</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>P37004</td><td>Slide developing module</td></tr><tr><td>Distilled water</td><td>Bio-Lab</td><td>2321020500</td><td>Required for arrayer and humidifier</td></tr><tr><td>Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 &amp;mu;L</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Matrix)</td><td>MA-2131 Impact2 Equalizer 384</td><td>Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate</td></tr></tbody></table>

profiling anti-neu5gc igg in human sera with a sialoglycan microarray assay

細胞は、癌で一般的に変化し、シアル酸（Sia）発現の変化を含む炭水化物鎖（グリカン）の外皮で覆われている。これらは、9炭素骨格を有し、細胞表面上の脊椎動物グリカンをキャップする酸性糖である。哺乳動物の主要な2つのSia型は、 N-アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）およびそのヒドロキシル化形態であるN-グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）である。ヒトは、シチジン5 &#39;モノホスフェート-Neu5Ac（CMP-Neu5Ac）ヒドロキシラーゼ（CMAH）をコードする遺伝子の不活性化のために、内因性Neu5Gcを産生することができない。外部Neu5Gcは、赤肉および乳製品の食物摂取を通じてヒト細胞によって獲得され、その後、細胞表面上の多様なグリカンに現れ、主に癌腫に蓄積する。結果として、ヒトは、癌および他の慢性炎症媒介性疾患において多様な役割を果たす循環型抗Neu5Gc抗体を有し、潜在的な診断および治療の可能性になっているラッツ。ここでは、ヒト血清中のそのような抗Neu5Gc抗体を評価するためのハイスループットのシアログリカンマイクロアレイアッセイを記載する。 Neu5Gc含有グリカンおよびそれらの対応する対の対照（Neu5Ac含有グリカン）は、それぞれコア第一アミンを有し、エポキシ被覆ガラススライドに共有結合される。我々は、1プリントあたり最大896個のアレイを生成することができる特定のナノプリンタを用いて、16ウェルフォーマットで56枚のスライドを印刷することを例示する。各スライドを使用して、抗Neu5Gc抗体特異性、強度および多様性の評価のための16の異なるヒト血清サンプルをスクリーニングすることができる。プロトコルは、この堅牢なツールの複雑さを記述し、配列形式で多様な臨床サンプルでNeu5Gc食物炭水化物抗原への応答を調査することを目指しているもののための基本的なガイドラインを提供します。

アレイ印刷、開発、分析： 複数のグリカンサンプルおよびヒトIgG STD曲線を含む16個の異なるブロックにシアログリカンマイクロアレイを印刷するには、スライドごとに16個のブロックすべてと同じ印刷操作ですべてのスライドにできるだけ均一にすべてのサンプルを印刷するための徹底的な較正が必要です。したがって、特定の印刷パラメータが決定される前に、384ウェルプレート中のサンプル体積、スライドタイプおよび製造、384ウェルプレートタイプ、湿度レベル、サンプル体積あらゆるタイプのサンプル、ヒトIgG STD曲線濃度、およびマーカータイプについての印刷。このような印刷されたシアログリカンアレイスライドの耐久性は、室温で暗所で真空密閉ボックス中で最大10ヶ月間持続することが立証された。あらゆる印刷実験において、均一性はさらにSia結合レクチンおよび抗体を用いた品質管理実験によってモニタリングおよび検証された。開発およびスキャニングのプロトコルは、同じ印刷作業のスライド内およびスライド間のサンプルを比較することによって、均一性および精度を達成するように最適化されています。スライドは最適化されたブロッキング条件（化学的および生物学的）、洗浄、およびインキュベーション時間を使用して、ブロック間の適切な分離を保証する16ウェル分画器で開発されています。一次および二次検出は、最小限のバックグラウンドおよび非特異的結合で最大の検出を確実にするように広範囲にわたって較正されていた。スライドのスキャンと分析では、出力結果をスプレッドシートファイルに転送し、分析して各スポットの検出を決定しました。各スポットは異常値のチェックを受け、QCを満たさない場合は省略された（％CVが&gt; 20であり、スポットが4つの複製の平均から標準偏差の範囲外にある場合）。そして、平均信号強度afte局所的なバックグラウンドの減算は、サンプル当たりの複製スポットについて平均化され、印刷サンプルあたり相対蛍光単位（RFU）データポイントを生成した。試験したすべてのブロックでIgG STD曲線の一様性が検証されたら、RFU値をng /μLIgGに標準化し、実験内および実験間で試料をよりよく比較する機会を可能にした。 Sia結合ハイスループットアッセイ： Sia含有グリカンに結合する決定基（ 例えば、タンパク質、レクチン、抗体、ウイルスなど ）を検出するために、シアログリカンアレイを使用することができる。印刷後のQCについては、Sia結合植物レクチンおよび抗Neu5Gc IgYが使用される19 。 SNAはα2-6結合Siaに結合し、MALIIはα2-3結合Siaに結合し、抗Neu5Gc IgYはNeu5Gc含有シアログリカンに結合するが、Neu5Aに結合しない図2（a）に示すように、sialoglycans 19 Cを含みます。 QC実験は、4つの異なるピンを使用して印刷されたブロック間のスポット印刷およびアイデンティティおよび変動性の妥当性を検証することを目的とする。スライドごとの一次検出ごとに4つのブロックを開発し、4つのピンのそれぞれに印刷されたブロックを同じ一次検出部分で比較することにより、ブロック間の変動性を監視する。大きな違いがないことを確認するために比較が行われます。 ヒト血清は、種々のヒト疾患2、21、22、23のための含意を用いて多様な抗のNeu5Gc抗体6を含みます。ヒト血清IgG中のシアログリカン認識を評価するために、健康なヒトドナー由来の12の血清を、プリントされたシアログリカンmicr蛍光標識抗ヒトIgGを用いて発色させた（ 図2B ）。各印刷されたブロックは、すべてのブロックにおいて同等で均質なヒトIgG STD曲線を含む（ 図2C ）。各ブロック（ 図2C ）のSTD曲線の品質を検証した後でのみ、グリカンスポットの結果はブロックの傾きに従って正規化され、次いで希釈係数が乗算される。 図2Bに示すように、試験したヒト血清は全て、様々なレベルの抗Neu5Gc IgGを含み、一致する対のNeu5Ac含有シアログリカンはほとんど認識されない。さらに、抗Neu5Gc IgG認識パターンは、強度および多様性レベルの両方において、これらの異なる血清間で非常に多様である。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56094/56094fig1.jpg" /> 図1：概要アレイ印刷、現像、イメージ解析（ A ）Neu5Gc9Acα2-6GalNAcαProNH2は、エポキシ被覆ガラススライド上に印刷された第一級アミンを有する代表的なNeu5Gc含有Siaグリカンとして示される。 （ B ）印刷されたアレイは、様々なSia結合タンパク質で発現され、続いて適切な蛍光標識二次抗体で検出される。各サブアレイは個別に開発することができます。 （ C ）蛍光スキャナー中でプローブされたスライドを走査することにより、スキャナー画像ソフトウェアを用いてさらに分析される画像が生成される。サブアレイには、アレイ上の各スポットをマッピングするグリッドが重ねられ、各スポットについて蛍光が検出される。結果はスプレッドシートファイルに転送されます。単一のウェル内の単一のアレイが概略的に表される。 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56094/56094fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56094/56094fig2v2.jpg" /> 図2：様々なSia結合タンパク質を用いたSialoglycanマイクロアレイのプロファイル スライドは、各ブロックに1つずつ、16の異なる一次検出部分を用いて開発した。 （ A ）Sia特異的植物レクチンSNAおよびMALIIおよびポリクローナルモノ特異的ニワトリ抗Neu5Gc IgYの結合パターンを示すQCスライドの代表的な3ブロック。結果は、個々のブロック（赤、白、青、それぞれ100 番目 、50 番目 、および0 番目のパーセンタイルを表す）のヒートマップ形式のRFUとして表示されます。 （ B ）12種類の健康なヒト血清を1：100希釈で試験し、抗Neu5Gc IgG反応性をプロファイルするために抗ヒトIgGを用いて検出した。 RFUデータは、それぞれの値をそれぞれの特定のblにおけるIgG STD曲線勾配で割ることによってng /μLに正規化した次に希釈係数を掛けたものである。データは（赤、白、青、TE 100 番目 、50 番目 、0 番目のパーセンタイルを表し、それぞれ）結合されたすべてのブロックに対してヒートマップ形式で表現されます。 （ C ）データを正常化するために用いられたヒト血清を用いて開発された12個のブロックのヒトIgG STD曲線。 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56094/56094fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> グリカンID </td><td colspan="4"> 構造 </td></tr><tr><td> 1 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2α3Galβ4GlcNAcβO（CH 2）2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα3Galβ4GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2/ sub&gt; NH 2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2α6Galβ4GlcNAcβO（CH 2）2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα6Galβ4GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="4"> Neu5Acα6GalNAcαO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 6 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα6GalNAcαO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 7 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2α3Galβ3GlcNAcβO（CH 2）2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 8 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα3Galβ3GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 9 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2α3Galβ3GalNAcαO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 10 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcαO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 11 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 12 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 13 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3Galβ3GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 14 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα3Galβ3GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 15 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3Galβ3GalNAcαO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 16 </td><td colスパン= &quot;4&quot;&gt;Neu5Gcα3Galβ3GalNAcαO（CH 2）2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 17 </td><td colspan="4"> Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 18 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα6Galβ4GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 19 </td><td colspan="4"> Neu5Acα6Galβ4GlcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 20 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα6Galβ4GlcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 21 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3Galβ4GlcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 22 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα3Galβ4GlcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 23 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2α6GalNAcαO（CH 2）2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 24 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα6GalNAcαO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 25 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3GalβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 26 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα3GalβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 27 </td><td colspan="4"> Neu5Acα6GalβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 28 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα6GalβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 29 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2α3GalβO（CH 2）2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 30 </td><td colspan="4"&gt;Neu5Gc9Acα3GalβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 31 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2α6GalβO（CH 2）2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 32 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα6GalβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 33 </td><td colspan="4"> Neu5Acα3Galβ3GalNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 34 </td><td colspan="4"> Neu5Gcα3Galβ3GalNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 35 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2α3Galβ3GalNAcβO（CH 2）2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 36 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td&gt; 37 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2α6Galβ4GlcβO（CH 2）2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 38 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Ac6Galβ4GlcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 39 </td><td colspan="4"> Neu5,9Ac 2α3Galβ4GlcβO（CH 2）2 CH 2 NH 2 </td></tr><tr><td> 40 </td><td colspan="4"> Neu5Gc9Ac3Galβ4GlcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 </td></tr></tbody></table> 表1：印刷されたグリカンのリスト。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 一番目の、二番目の </td><td> 抗体/レクチン </td><td> ストック濃度 </td><td> 特異性 </strong&gt; </td><td> 作業希釈/濃度 </td></tr><tr><td rowspan="4">一次検出</td><td>ビオチン化MALII </td><td> 1mg / mL </td><td> α2-3結合のシアル酸</td><td> 1:50,20μg/ mL </td></tr><tr><td>ビオチン化-SNA </td><td> 2mg / mL </td><td> α2-6結合のシアル酸</td><td> 1：100,20μg/ mL </td></tr><tr><td>ニワトリ抗Neu5Gc IgY </td><td> ND </td><td> Neu5Gcシアル酸</td><td> 1：7,000 </td></tr><tr><td>ヒト血清</td><td> 100％ </td><td>多数のエピトープ</td><td> 1：100 </td></tr><tr><td rowspan="3">二次検出</td><td> Cy3-Streptavidin </td><td> 0.75mg / mL </td><td>ビオチン</td><td> 1：500,1.5μg/ mL </td></tr><tr><td> Cy3抗チキンIgY </td><td> 0.75mg / mL </td><td>鶏IgY </td><td> 1：2,000,0.375μg/ mL </td></tr><tr><td> Cy3-抗ヒトIgG H + L </td><td> 0.6mg / mL </td><td>ヒューマn IgG </td><td> 1：1,500,0.4μg/ mL </td></tr></tbody></table> 表2：一次および二次検出タンパク質のリスト。 補足図： <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56094/SUPP_040917Leviatan_Ben-Arye_JoVE_Rev1.docx">このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。</a>

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Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Sialoglycanマイクロアレイアッセイによるヒト血清中の抗Neu5Gc IgGのプロファイリング

シアログリカンマイクロアレイアッセイを用いてヒト血清中の抗Neu5Gc抗体を評価し、癌および他の慢性炎症媒介ヒト疾患のハイスループット診断アッセイを可能にする。

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Behavior

9.4K ビュー.  Tel Aviv University. シアログリカンマイクロアレイアッセイを用いてヒト血清中の抗Neu5Gc抗体を評価し、癌および他の慢性炎症媒介ヒト疾患のハイスループット診断アッセイを可能にする。 

ビデオ: Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

スフィンゴ糖脂質抗原の質量分析

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

免疫・感染学

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

N型糖鎖アレイ開発および HIV 抗体のための化学酵素合成プロファイリング

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

化学

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and determine glycan alterations in diseases. Most commercially available biopharmaceutical proteins are glycoproteins. The efficacy of these drugs is affected by glycosylation patterns. Therefore, an in-depth characterization method for the N-glycans is necessary. Here, we present a comprehensive approach for qualitative and quantitative analysis of N-glycans using hydrophilic interaction liquid chromatography equipped with fluorescence detection and tandem mass spectrometry (HILIC-FLD-MS/MS). N-glycans were released from glycoproteins with a facile method and labeled by a procainamide fluorophore tag in the strategy. Subsequently, the procainamide labeled N-glycans were analyzed by a HILIC-FLD-MS/MS technique. In this approach, N-glycan structures were confirmed by the tandem mass spectrometric analysis, whereas fluorescence detection was used for the quantitative analysis. An application for data analysis of the detected N-glycan peaks is described in the study. This protocol can be applied to any glycoprotein extracted from various species.

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

N-glycan profiling of glycoproteins is essential for discovering novel biomarkers and understanding glycan functions in cellular events. Additionally, N-glycan analysis of protein biopharmaceuticals is very important for human use. In this current article, a high-throughput strategy for identifying and quantifying N-glycan structures was presented using the HILIC-FLD-MS/MS technique.

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and ...

生化学

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの結合力および特異性を評価するための小型糖鎖マイクロアレイアッセイ

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing termini of oligo- and polysaccharides, as well as its unique chemical characteristics, sialic acid is involved in a multitude of different receptor-ligand interactions. By modifying the expression of sialic acid on the cell surface, sialic acid-dependent interactions will consequently be influenced. This can be helpful to investigate sialic acid-dependent interactions and has the potential to influence certain diseases in a beneficial way. Via metabolic glycoengineering (MGE), the expression of sialic acid on the cell surface can be modulated. Herein, cells, tissues, or even entire animals are treated with C2-modified derivatives of N-acetylmannosamine (ManNAc). These amino sugars act as sialic acid precursor molecules and therefore are metabolized to the corresponding sialic acid species and expressed on glycoconjugates. Applying this method produces intriguing effects on various biological processes. For example, it can drastically reduce&#160;the expression of polysialic acid (polySia) in treated neuronal cells and thus affects neuronal growth and differentiation. Here, we show the chemical synthesis of two of the most common C2-modified N-acylmannosamine derivatives, N-propionylmannosamine (ManNProp) as well as N-butanoylmannosamine (ManNBut), and further show how these non-natural amino sugars can be applied in cell culture experiments. The expression of modified sialic acid species is quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) and further analyzed via mass spectrometry. The effects on polysialic acid expression are elucidated via Western blot using a commercially available polysialic acid antibody.

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid is a typical monosaccharide-unit found in glycoconjugates. It is involved in a plethora of molecular and cellular interactions. Here we present a method to modify cell surface sialic acid expression using metabolic glycoengineering with N-acetylmannosamine derivatives.

Nを用いたシアル酸の代謝独自-アシル-Mannosamines を変更

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

生物工学

<meta charset="utf8"></head><body>Bead Array in a Single Tip (BIST)を用いたレクチンベースの糖鎖プロファイリングの自動化

Rapid Glyco-Qualitative Assessment of Recombinant Proteins Using a Fully Automated System

Protein glycosylation, a critical post-translational modification, influences the stability, efficacy, and immunogenicity of recombinant proteins, including biopharmaceuticals. Glycan structures exhibit significant heterogeneity, varying with production cell types, culture conditions, and purification methods. Consequently, monitoring and evaluating the glycan structures of recombinant proteins is vital, particularly in biopharmaceutical production. The lectin microarray, a technique complementary to mass spectrometry, boasts high sensitivity and ease of use. However, it typically requires more than a day to yield results. To adapt it to non-glycoscience research or drug product process development, an automated, high-throughput alternative is needed. Therefore, the world's first fully automated lectin-based glycan profiling system was developed, utilizing the "bead array in a single tip (BIST)" technology concept. This system allows for the preparation and storage of lectin-immobilized beads in units of 1,000, with customizable parallel insertion orders for various purposes. This article presents a practical protocol for research involving "glyco-qualified" recombinant proteins. After testing their reactivity against 12 polyacrylamide-glycan conjugates, 15 lectins were selected to increase the system's versatility. In addition, the sample labeling process was optimized by switching from Cy3 to biotin, reducing the overall processing time by 30 min. For immediate data qualification, lectin-binding signals are displayed as a dotcode on the top monitor. The system's reliability was confirmed through day-to-day reproducibility tests, repeatability tests, and long-term storage tests, with a coefficient of variation of &lt;10%. This user-friendly and rapid glyco-analyzer has potential applications in the quality monitoring of endogenous glycoproteins for biomarker evaluation and validation. This method facilitates analysis for those new to glycoscience, thereby broadening its practical utility.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:全自動システムを使用したタンパク質グリコシル化研究の進歩

A system for the automated and rapid analysis of glycans on proteins was previously developed. This article presents the protocol for "glyco-qualitative analysis," optimized for a broad spectrum of users, such as those engaged in analyzing glycan structures in biopharmaceuticals and other glycoconjugate materials.

全自動システムを用いた組換えタンパク質の迅速な糖質定性評価

Protein glycosylation, a critical post-translational modification, influences the stability, efficacy, and immunogenicity of recombinant proteins, ...

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the individual immune condition determines the success in combating internal and external potential threat signals, but also the existence of a particular pattern of circulating anti-glycan antibodies (and their serological level variation) could be a significant marker of the onset and progression of certain pathological conditions. Here, we describe a Printed Glycan Array (PGA)-based methodology that offers the opportunity to measure hundreds of glycan targets with very high sensitivity; using a minimal amount of sample, which is a common restriction present when small animals (rats, mice, hamster, etc.) are used as models to address aspects of human diseases. As a representative example of this approach, we show the results obtained from the analysis of the repertoire of natural anti-glycan antibodies in BALB/c mice. We demonstrate that each BALB/c mouse involved in the study, despite being genetically identical and maintained under the same conditions, develops a particular pattern of natural anti-carbohydrate antibodies. This work claims to expand the use of PGA technology to investigate repertoire (specificities) and the levels of circulating anti-carbohydrates antibodies, both in health and during any pathological condition.

This work shows the potential of printed glycan array (PGA) technology for the analysis of circulating anti-carbohydrate antibodies in small animals.

印刷された糖鎖の配列: 小動物対策炭水化物抗体のレパートリーの分析のための高感度な技術

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Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ

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Sialoglycanマイクロアレイアッセイによるヒト血清中の抗Neu5Gc IgGのプロファイリング

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