この作業は、助成金の支援を受けて行われた 5R21HD080684-02、国立小児保健と人間開発から。著者は彼の継続的な熱意と支援の県町をお礼申し上げます。著者とも認めるしたいブルース ・ ブランバーグ彼のカメラ、リベカ チャーニー、原稿とショーン · マクナマラ、Marcin Wlizla 国立アフリカツメガエルリソース (RRID:SCR_013731) での重要な読書のための使用のための貴重なX. tropicalisの餌と動物の治療法についての会話。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物のケアとカリフォルニア大学アーバイン校の利用委員会によって承認されています。
1. PGC 移植の準備
<ol><li>前述23として解剖ツールを事前に準備します。 注: 眉髪のナイフは、切開手術を実行しているとき、胎児を安定させるために毛のループの支援に使用されます。眉毛と髪のループを炎で描かれた最初パスツール ピペット ホウケイ酸ガラスに接着し、薄くなった部分に壊れた (図 1 aを参照してください矢印) 手先の器用さより短くより狭いヒント (図 1 b) を作成するには手術の際に。</li>
	<li>手順説明した24を使用して sgRNAs を生成します。 注: 簡潔に、短い DNA テンプレート sgRNAs のためのコーディングが作成されます、エラー無料、耐熱性 DNA ポリメラーゼを焼鈍が 5' バクテリオファージ T7 プロモーターと「入力」を含む重複する deoxyoligonucleotides を使用しています。SgRNA 合成反応の in vitro (キット使用) によって一夜にして数時間孵化します。反応は、DNAse 処理テンプレートを削除します。SgRNAs は24キットの製造元の指示に従ってフェノール/クロロホルム抽出とアンモニウム酢酸/イソプロパノール沈殿の標準的な方法で精製しました。</li>
	<li>直前に薬剤を実行すると、最初の変化 〜 250 で Cas9 sgRNA 錯体を準備 RNAse フリー (ジエチルピロカーボネート処理) H2O 60 から 65 ° c 5 分の総量が 3 μ L sgRNA の ng は、5 分間氷の上迅速な冷却が続きます。数秒間、sgRNA を遠心 1 μ g/μ L Cas9 蛋白質の 1 μ L を追加して、複雑な形成を促進する 37 ° C で 10 分間インキュベートします。 注: このインキュベーション後チューブを維持する氷上一方マイクロインジェクションの胚を準備します。</li>
	<li>前述の25として標準的な方法を使用して体外受精によってX. tropicalis胚を取得します。25,26を解除ゼリー 10 分後受精で胚。 注: 受精の時間時間後に卵に精子懸濁液を追加し、料理は 1/9thX が殺到である Marc の着信音の変更 (MMR)26。X. tropicalis25、 X. laevisとは異なり実行 1/9 で解除ゼリー x MMR システインの遊離の塩基の 3% (ない塩酸塩) を含む pH 7.8 8.0 に調整は 1/9 で複数の洗浄が続く x MMR。(1%)、アガロースに胚を転送-1/9 を含むコーティング皿室温で x MMR。</li>
	<li>すぐの 1 を含んでいる 1% アガロースゲル コーティング皿注入胚を転送パスツール ピペットを使用して x MMR。</li>
	<li>
1 細胞の段階で投入します。参照26,27 アフリカツメガエルマイクロインジェクション メソッドの詳細についてを参照してください。
	<ol>
<li>4 動物極で 1 つのサイトでそれぞれの胚に注入 Cas9 sgRNA 複合体の nL (最終的な金額 = 1 Cas9 と sgRNA の ~ 250 pg の ng; 見なさい議論)24。インジェクション サイト癒しの 10-20 分後 1/9 を含む agarose コーティングの皿に胚を転送 x MMR 25 ° c. で孵化させなさいと胚移植の受信者として使用される uninjected の兄弟の皿を作成もできます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
〜 5 mm を含むペトリネット プレート (60 mm) を準備-0.3、1% の agarose の厚い層 x MMR、 X. tropicalis、または 1 の移植を行う場合X. laevisの x MMR。
	<ol>
<li>3 ~ 4 のくぼみを作成 mm、3 を挿入することによって深い-4 ウェル金型 (96 ウェル PCR プレートを切断することによって作成された) x 溶融 agarose プレートを注ぐときに (図 1を参照してくださいとD)。Agarose が固まるまで、リング スタンドに接続されているクランプを使用してシャーレの底の上の数ミリの金型を保持します。</li>
		<li>さらに、1/9、1% の agarose の薄層で井戸をコーティングすることにより家個々 の胚に 24 ウェル プレートを作る x MMR。 注: これらの井戸に追加培養培地はゲンタマイシン硫酸塩/mL の 50 μ g を添加した MMR 1/9 x。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PGCs の移植
<ol><li>とき胚だけ Nieuwkoop とフェーバー28胞胚の段階に達する 9 (図 2 a) ~4.5 h X. tropicalisのためのポスト受精 (hpf) 25 の ° C の定温器から削除し、さらに室温に釣り合うように0.5 h。</li>
	<li>5 に移植を開始する hpf (図 2 b)、0.3 のくぼみ (1.7 のステップで作成した) を含む 60 mm agarose の皿に (Cas9 sgRNA と挿入された) 1 つの PGC ドナー胚を転送するパスツール ピペットを使用して、x MMR (または 1 x MMR X. laevisを使用している場合)。また、1 つ uninjected 兄弟の胚移植の受信者は、この皿に転送します。 注: これらの胚のそれぞれのアイデンティティが混同されていないことが重要です。</li>
	<li>手動で鉗子を使用してそれぞれの胚から卵黄の封筒を削除し、植物極がビューで、手術のためアクセス両方の胎児を回転させます。 注: 胚のマニュアル ・ デ ・ vitellination の説明に記載されている26がきた。</li>
	<li>髪、眉のナイフの鋭い先端を使用して、マーク、原口将来ボトル細胞が形成されますゾーン中、受信者の胚の植物極に正方形の形をした 4 つの浅い切開を作る。胚は、毛のループを持つ胚の安定が上向きの動きをスライスして、表面のすぐ下に眉髪のナイフの先端を挿入して切開を行います。 注:図 2 4.5 7.0 hpf セル サイズを表示してボトル細胞が (白の破線円) を形成を推定するためのガイドを提供するから half-hourly 間隔で胚の植物性のビューを示します。目的は、ように切開し、破線のブラック ボックスが示されているです。</li>
	<li>正方形の 4 つの側面は、切開で区切られる、一度眉髪のナイフが類似の切断動作を使用して深さの約 1/3、1/2 胞胚腔の床までの距離に到達すると各切開を深めます。</li>
	<li>無料の受信者の胚からの植物組織植 (図 3 a とB) (植物の表面に平行) 水平することによって深い植物地域で cut(s)。 注: PGC 含む植物性外植体のサイズは約 0.4-0.45 mm 面ごと mm で深さ 0.25 0.3。受信者の胚からこの植物の植が不要し、破棄される脇したがって設定する必要があります。</li>
	<li>すぐに働いて、この手順 (手順 2.4 2.6) PGC ドナー胚移植のための同様に大きさで分類された植物組織片を作成するを繰り返します。 注: その傷口を癒すために受信者の胚のための時間を最小限に抑えるため遅延の少ないこの第二の郭清を行うことが重要です。</li>
	<li>ドナー胚始原生殖を含む組織を削除すると、受信者の胚は、開口部の位置にこの植を移動するのに眉髪のナイフと髪のループを使用します。 注: ドナー移植片の内部の表面は受信者の胚の内部に直面する必要があります。受信者の胚で移植の背腹軸、左右の軸の向きを揃える必要はありません。</li>
	<li>受信者の胚の植物の表面の開口部に移植をそっと押して、移植片の表面に平行に開催眉髪のナイフの軸の長いエッジを使用します。</li>
	<li>一度移植を配置すると、ドナー胚の「死体」をアガロースうつ病優しく agarose 表面にスライドするのに、hairloop または、眉髪のナイフのシャフトを使用します。死体の傷口で大量の液体が直面していることを確認します。該当しない場合は、この方向性を達成するために胚を回転させる眉髪のナイフを使用します。</li>
	<li>癒しの場所に隣接するうつ病に移植の受信者の胚をスライドし、同様に接木された植物極組織が大量の液体を直面していることを確認してください。</li>
	<li>ドナーと受信者の胚の別のペアを使用して移植/死体の別のペアを作成するこの手順 (手順 2.1 2.11) を繰り返します空のくぼみに、これらを転送します。 注: 死体と胚移植軸受のペアを追跡する表記をするとが重要です。ドナー死体移植軸受け動物性的成熟に達するまで簡単に測定できない移植の PGCs の Cas9 sgRNA 誘発突然変異の効率のプロキシとして使用されます (以下、3.3、手順を参照してください、ディスカッション).</li>
	<li>胚までは約 6.5 約初期原腸胚ステージ 10、移植を作り続けるX. tropicalisで hpf (図 2 eを参照してください)。</li>
</ol>3. 胚世話治癒後
注: 移植を癒す ~ 30 分以内の場所に、通常セル換散 (図 3) 胚から染み出すからいくつかの卵黄の残骸を観察します。
<ol><li>
癒される、アガロース コーティング 24 ウェルのプレートの個々 の井戸にくぼみから非常に優しく移植胚にパスツール ピペットを使用します。液になります流体転送中に混合によって (図 3 D) を削除します。
	<ol>
<li>一括ソリューションを直面する植物性極配置されますので、胚を回転します。また、ドナーの死体を置き移植胚のペアを追跡するのに支援するために隣接する井戸の受信者この情報を記録します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一晩文化の 25 ° C の定温器に胚を含む 24 ウェル プレートに転送します。 注: 次の日、胚が持っている尾の段階に達した。</li>
	<li>ゲンタマイシン硫酸塩/mL、ウェルあたり 1 胚での 50 μ g を添加した MMR 1/9 x を含む agarose コーティング 6 ウェル プレートをきれいにする移植の受信者を移動します。これらに一致するドナー死体の明確な記録の受信者を移植します。</li>
	<li>シーケンス PCR 産物5,17,24または PCR 産物 (ディスカッションを参照) に依存する他のメソッドを使用して突然変異誘発効率を評価するために個々 の死体を 0.2 mL PCR ストリップ管に移動します。媒体のほとんどを削除し、100 μ L 換散バッファー24プロテイナーゼ K (PK) によって繰り返し上下ピペッティング P200 ピペットを使用してを含む均質化します。</li>
	<li>胚換散24 PK 消化を許可するように一晩に 6 h 56 ° C でを実行します。クイック 4 ° C に冷却後、10 分の 90-95 ° C に加熱することによって PK を不活性化します。直接サンガー DNA シーケンス24の短い産物を取得するのに PCR の反作用をシードするのにさらにクリーンアップ手順を実行することがなく溶解液を使用します。-20 ° C の溶解液を保存します。 注: いくつかの日以内オタマジャクシ栄養段階 (約ステージ 45 46) になるし、浮遊性粉末 (血清ミクロン) の懸濁液を供給することができます。</li>
	<li>培地に清潔を維持し、微生物の増殖を最小限に抑えるための日変化との 〜 1 週間後点滴の流れと循環水生システムの小型タンクにオタマジャクシを移動します。シーケンス データを使用すると、突然変異誘発に低い効率とオタマジャクシから高効率人為 PGCs のオタマジャクシを分離します。変身が完了したら、一度、froglet をラボで大人の水生システムに移動します。 注: 国立アフリカツメガエルリソース (MA、ウッズホール海洋生物学研究所) が開発した療法は29と大人カエル メンテナンス30餌オタマジャクシのガイドを提供します。</li>
</ol>

<ol>
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K., Tarbashevich, K., Pieler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elr-type+proteins+protect+Xenopus+Dead+end+mRNA+from+miR-18-mediated+clearance+in+the+soma.">Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).</li><li>Yang, J., Aguero, T., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+maternal-to-zygotic+transition+from+the+perspective+of+the+germline.">The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline.</a> Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).</li></ol>

著者は、何を開示します。

このレポート提供中動物の生殖細胞を変更する PGCs。 移植の PGCs を含む植物性の組織移植のための詳しいプロトコルはゲノム編集技術 (例えばCRISPR/Cas9) と組み合わせて使用遺伝子野生型としてその体細胞組織のほぼすべてを維持します。成功するリープフロッギングの行う移植を実行する前に考慮すべき重要な要因の数があります。
生殖細胞の突然変異体の対立遺伝子との完全な代替品を確保するため、1 つは最初 sgRNAs の生体内で効率を決定することをお勧めします。経験では、ほとんど sgRNAs CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) または CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) によって設計されている 250 pg/胚で使用すると効率的を示唆しています。ただし、場合によっては、高濃度 (例えば電撃ら17刊gsc sgRNA ~ 1 ng/胚を必須) を使用する必要がある場合があります。ターゲット ・ サイトの突然変異誘発性を評価することが不可欠であると潮の使用により、定量的評価31。強調したメソッドはここで直接サンガーを使用中 (F0胚の突然変異体の対立遺伝子の人口を表す)、PCR 産物の多数の他の方法使用されているゲノム編集文献でこの目的のため。一般的に使用される他の穏健派にローコスト テクニックがあります損失制限酵素33や測量、Cas9/TALEN 胸の谷間のサイト34T7 エンドヌクレアーゼ 135のいずれかを使用してフラグメント長多型解析36試金、37、ヘテロ二本鎖のモビリティ アッセイの高分解融解法38、フラグメント キャピラリー電気泳動39,40, と qPCR 法41,による分析42。
第 2 考察は、ターゲット サイトのターゲット遺伝子内の場所の選択です。F1世代の突然変異体の表現型の効率的回収を許可するには、完全な LOF の対立遺伝子のためのチャンスを最大化することが重要です。古典的なアプローチを使用して突然変異系統を作る蛋白質コード領域の先頭付近は時期尚早翻訳終結を引き出すために、地域のコーディングの 5' 端近く Cas9 胸の谷間を対象とする共通の戦略です。フレーム シフト突然変異で、F1のヘテロ接合体が識別され、これらの動物には劣性を運ぶことが期待されますので、以降の作業選択されているでしょう。馬跳びの戦略は、F0 intercrosses を使用しているのでターゲットにコード配列の 5' 端のアプローチは高効率になります。F0胚モザイク germlines、ほとんど F1突然変異体の人口の交配結果複合ヘテロ接合体17。この方法で生成されるほとんどの F1胚がフレーム内で少なくとも 1 つの対立遺伝子が大規模解析は、平均して、二重鎖切断による突然変異の予想 ~1/3rdはフレームで43を検証するため突然変異であり、野生型の活動を保持可能性があります。したがって、これらのフレームで変異遺伝子の null にする可能性がありますを確実にする別の戦略が必要です。通常のタンパク質の機能に不可欠なタンパク質フォールディングのドメイン内で二重鎖切断をターゲット完了 LOF (null 対立遺伝子)17,44のより高いチャンスが発生する予定です。タンパク質ドメインの原子レベルの構造を慎重に考慮、利用可能な場合、ドメイン構造 (を混乱させることは、単一のアミノ酸のフレームの削除を含む場合でもを予想する二次構造の領域を識別するに役立ちます例えば、 gsc電撃ら17刊の Δ3bp 突然変異)。これらの地域内 CRISPR/Cas9 ターゲット サイトを識別できる場合 null 対立遺伝子を正常に作成するより高いチャンスがあります。柔軟な地域変異がタンパク質まだありますので、蛋白質二次構造コンポーネント間の溶媒露出ループ内で小さな削除が少ないことが望ましい。
リープフロッギングの第 3 考察は受信者の胚から PGC 除去の効率です。この手順は、完全な生殖系列の置換を確保するために効率的になる必要があります。ここで説明したメソッドによって作成されたすべての移植受容胚が胞胚期の胚における PGC マーカーのローカリゼーションで交配を変動場のPGCs 全体マウントの完全な除去をあるかどうかは不明です。多くの場合、すべて、またはほぼすべての信号が見つかった付近の胚の植物性ほとんど終わりしたがって、ここで説明した手術によって除去が (そこに電撃ら17と引用)。しかし、いくつかの胚は、胞胚腔床に近いいくつかのセルで PGC マーカー式を示します。生殖質は、まず受精後植物極で連結し、胸の谷間の溝に沿って初期亀裂の中にスイープし。いくつかの生殖質植物性の半球の中央にあるセルの分散になることがあります、胞胚腔まで移植を使わず効果的に削除できません。しかし、それもマイクロ Rna が細胞45,46mRNAs を PGC をオフに知られているこれらの深い細胞の生殖細胞マーカーが含まれている可能性があります、生殖に寄与していないことに注意する重要です。これらの深い細胞 PGC マーカー陽性染色などのクリアランスを受ける体細胞があります。受信者の胚から完全に PGC 削除を確認する手法を開発中です。
最後に、それもリープフロッギングして生成するどのように多くの F0動物を考慮する重要です。可変個動物の性的な成熟に生き残るれませんと 20 以上の胚を移植を含むを作成することをお勧めします。それは、(1) 男女の十分な数を確保するため十分な生存動物のいただきますが必要とこれらが研究者によって計画された解析に合うように十分に高い頻度で変異遺伝子を送信 (2) になります。
ここでは、いくつかの練習で説明されたプロトコルを使用して両生類胚はいくつかの練習と PGC 移植テクニックをマスターすることができる必要があります。飛び越えては他の両生類も、容易に移植可能胚発生の初期の段階で個人間孵卵を含んでいる他の生物だけではなく、可能なはずです。

遺伝子型が表現型にエンコードし、メンデルの法則の再発見から生物学の主要な質問がされています。発掘の新しい生物学および従って, これらの疾患状態のツールを提供するためにエンコードされた製品約束の機能と遺伝子、その調節と遺伝子ネットワークの相互作用の役割の理解。半分以上世紀1アフリカツメガエル、アフリカツメガエルは、基礎生物学、生物医学、開発の遺伝制御を含むさまざまなトピックに関する研究の主要なモデルをされています。歴史的に、アフリカツメガエルのほとんどの研究は、allotetraploid カエル、 X. laevisを使用しているが、最近では、その二倍体遺伝のために、 X. tropicalisを両生類遺伝モデルとして開発されています。全ゲノム配列は、両方アフリカツメガエル種2,3から組み立てされています。「カエルのコミュニティ」は基礎ゲノム改質技術が許可されている遺伝子機能の研究事実上はターニング ポイントで今です。プログラマブル CRISPR/Cas9 酵素からの遺伝子の突然変異を誘発した非常に効率的に、シュミレーション可能な大部分の細胞の変異動物4,5,6,7、 8,9,10,11。バッタチャリヤらによって強調したこれらの研究12重田ら13F0モザイク動物の突然変異誘発による多くの遺伝子の機能を学ぶことができることが示されています。このアプローチは多くの利点;ただし、Cas9 sgRNA microinjected 胚はしばしば関数 (LOF) の不完全な損失のため変数表現型を表示します。大きくなり、突然変異系統の生成は、いくつかのアプリケーションのため、非常に有利、特に母性 mRNA 貢献をしている遺伝子の研究の際に。母性 Mrna とタンパク質とエピジェネティクス、胚発生14,15,16、多くの遺伝子の早期発達貢献をレンダリング長時間にわたって永続化します。F0解析する耐火物。したがって、他の LOF のアプローチが必要です。
突然変異系統を作成しようとすると、ホモの LOF の胚を取得するパスはいくつかの障害には。必須な遺伝子機能の損失結果として生き残るために性的に成熟、現実的なラインの生産と干渉する障害シュミレーションの突然変異を生成する最初、効率的な変異が不利なるです。一般的なソリューションは、Cas9 sgRNA の配信量の慎重な滴定です。ここでは、目的はまた生殖細胞系突然変異誘発効率を最大化しながら致死率を減らすことの間のバランスを達成するためにです。2 番目の問題は、表現型解析が F2世代まで遅延される標準的な育種方式から発生します。標準的なアプローチを使用すると、性的成熟する F0動物生殖細胞を通じて対立遺伝子が F1ヘテロ「キャリア」が、性的な成熟に成長して生成する outcrossed 変異体を送信します。2 F1ヘテロ接合体は、25% の期待されるメンデル頻度で F2変異胚を作り出すため、intercrossed します。したがって、繁殖の二世代が突然変異体の表現型解析のため必要です。変異動物は、急性または複合ヘテロ接合体 (すなわち、子孫含む 2 つの異なる変異対立遺伝子、F1エムアンドエー インター クロスにおける親動物の遺伝子型に依存する) 可能性があります。
これらの障害は、プログラマブル ヌクレアーゼを介した突然変異誘発による生殖細胞、馬跳び17と呼ばれる新しいメソッドの基礎となる拘束で克服できます。2 つの主要コンポーネントがありますリープフロッギング: (1) 一緒に sgRNA、またはヌクレアーゼ sgRNA 錯体 (または原則、TALENs または亜鉛指核酸) Cas mRNA マイクロインジェクション (2) 続いて胚性ゲノムを効率的に mutagenize に単一細胞の段階でPGCs の内因性の PGCs が削除された、野生型の兄弟の胚への移植。両方の手順が突然変異体の生殖細胞を効率的で、完全な生殖系列の置換を取得できます。Blackler は、後半 neurula で胚と早く尾段階18,19アフリカツメガエル始原生殖を移植できれば、1960 年代初頭に示した。リープフロッギングの Blackler のアプローチは、胞胚のステージ17で移植胚20,21の植物極の PGCs がローカライズされる場合を実行することによって変更されました。原腸陥入前に移植には 2 つの主な利点。まず、移植とそれに続く正常な発達の生着は (未発表観察) 胞胚の段階で移植するときより効率的なことが判明しました。第二に、ココヤシの転写の開始後まもなく、胞胚期移植を実行する、不正な後半 neurulae に導いてくれる原腸陥入を混乱させる変異進化の遺伝子から生じる致死避けることが 1 つ。PGC 移植軸受 (「アベンテイル」) 胚が性的に成熟、成長、これら F0動物間の intercrosses は、F1子孫の 100% は多くのケースで、LOF 表現型 (ほとんどされている化合物も表示を示しています。ヘテロ接合体)、対象となる遺伝子変異を有する完全な生殖系列の置換を示します。
リープフロッギングアフリカツメガエルの遺伝的アプローチを加速する予定です。22 「ホスト転送」メソッドに代わるは母性効果遺伝子 (未発表観測) の LOF の分析も、飛び越えて.現在の文書では、PGC 移植中心メソッドの詳細な説明はX. tropicalisで (、 X. laevisに変更を加える) されます。PGCs の移植は、アフリカツメガエルの使用他の所により迅速な技術移転を容易にする紹介です。この方法の原理は他の両生類 (例えば有尾) に成功したする必要があり、効率的な変異を実現する他の多くの動物への応用方法論で生物固有の変更を許可し、PGCs が容易に移植できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20 or 11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyebrow hair knife</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair loop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc.</td>
			<td>KG581</td>
			<td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Custom ordered</td>
			<td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 kit</td>
			<td>Ambion/ThermoFisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, Tris buffered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality chloroform from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality ethanol from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma Chemical Co.</td>
			<td>D5758-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td>
			<td>PNA Bio, Inc.</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#39;s recommendations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Marc&#39;s Modified Ringers solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 X15 mm Petri plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Chemical Co.</td>
			<td>C7352-100G</td>
			<td>Free base, not HCl salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03 115 828 001</td>
			<td>Typically ~20mg/ml from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sera Micron</td>
			<td>sera</td>
			<td></td>
			<td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

ゲノム編集による突然変異系統の作成は多くの有機体の遺伝解析を加速しています。CRISPR/Cas9 方法は、アフリカツメガエル、アフリカツメガエル、生物医学研究のための長年のモデル有機体の使用のために適応されています。CRISPR/Cas9 標的突然変異のホモ接合体の突然変異系統を作成するための伝統的な育種方式があるいくつかの時間がかかり、骨の折れる手順。特に、胚形成に不可欠な遺伝子をノックアウトに関連付けられている障害を克服するために突然変異体の胚の作成を容易にするには、リープフロッギングと呼ばれる新しい方法を開発しました。この手法は「カットアンド ペースト「アフリカツメガエル胚の堅牢性を活用して胎生学的方法。リープフロッギング PGC アブレーション野生型兄弟に効率的に突然変異誘発ドナー胚から始原生殖細胞 (PGCs) の伝達を利用します。このメソッドは、必須遺伝子の効率的な変異の変異の生殖細胞を運ぶ野生型細胞とキメラ動物を作成することによってできます。ときを運ぶ 2 つの F0動物」を抜いて移植」(すなわち、突然変異体生殖細胞) を intercrossed、彼ら胚を作り出すホモ、または複合ヘテロ接合体、null F1 、そのため表現型データを取得する完全な生成時間節約します。F0表現型解析 CRISPR/Cas9 変異を次に不応性である母性効果遺伝子を解析するための新しいアプローチを示しますもリープフロッギングします。この原稿は、リープフロッギング、PGC 移植を正常に実行する方法に特別な重点を置いての方法を詳しく説明します。

次の移植、CRISPR/Cas9 の突然変異の効果の定性定量は、成長し、性成熟に動物を維持し畜産の努力を費やす前に行わなければなりません。リープフロッグ移植を運ぶ動物アデノーマ野生型、生殖細胞は直接測定のアクセスも困難ですのでドナー胚の死体の保存が重要になります。死体から DNA 解析は、移植生殖17で発生する突然変異の程度のためのプロキシとして機能します。
突然変異の成功を評価する 1 つの方法は、対象となっているゲノムの領域にまたがる PCR 産物を直接シーケンスすることです。多くの動物から多数個別に複製する DNA のフラグメントのシーケンスに特にコストと非効率な 1 つの願いになります。モザイク胚遺伝子から派生するいるとターゲット ・ サイトで異種 amplicons のシーケンスを使用して各胚19の変異導入効率を評価する代わりに、クロマト グラムの可視化は、ターゲットのシーケンスとなるピーク「スクランブル」(すなわち、各塩基の位置で表示される複数拠点に対応するピークの共起) 野生型シーケンス (ピーク) 上流を示していますの下流Cas9 触媒を用いた二本鎖切断のサイト。このようなプロファイルの例としては、S1 のブリッツの図ら見つけることが。17. これらのスクランブルのピークで表される突然変異の範囲の正確な定量はシーケンス分解アルゴリズム、潮 (https://tide-calculator.nki.nl/)31を使用して得ることができます。自信、それぞれの胚は正しく注入し、突然変異誘発のために目標を与えるこの手法を用いた個々 の胚をスクリーニングします。蛍光タグ デキストランなどのトレーサーは成功した射出24の確認に使用することができ、オタマジャクシは、移植された組織 (未発表データ) を運ぶ確かに確立を支援することができますも。一緒に Cas9 sgRNA 蛍光デキストランの射出が Cas9 の変異導入効率を恐れ形式的な可能性が検討されていないことに注意してくださいすることが重要です。不十分なまたは unmutagenized ドナーから移植を含む任意の"leapfrogged"胚は破棄できます。
リープフロッギング F1胚における効率的な表現型解析を許可することによって標準的な育種のスキームで F2世代分析の必要性を回避できます。必須遺伝子を変異させる標準的なアプローチを使用して、Cas9 sgRNA 線量の慎重な滴定がで減らされた突然変異誘発効率創始者胚の生存性を確保するためです。F0を存続この標準の配色から動物はその後にキャリアを識別するために上映される、実行可能なの F1胚を取得する wildtypes と outcrossed します。最後に、これらの F1ヘテロ接合体は性的な成熟に成長され突然変異体の表現型を表示するホモの F2個人を取得する intercrossed。対照的に、突然変異体の対立遺伝子を持つ彼らの germlines の完全な交換を持って作り出す動物を飛び越えて、ためにはこれら F0動物を交配 F1世代の突然変異体の表現型を生成します。電撃ら17 F0動物がメラニン形成細胞と網膜の色素沈着に必要なチロシナーゼ(tyr) の軌跡をターゲットの大半が 100% 生殖 ( 、アウトブ リードによって測定を示したことを報告しました。tyr-/- アルビノ動物) のドナー由来変異ゲノム (図 4 a Bと表 1を参照)。したがって、リープフロッギングによって生成される 2 つの動物を交配ホモ接合体あるいは複合ヘテロ接合体変異 F1胚をもたらすでしょう。
同様の結果は、 goosecoid (gsc) 遺伝子 (DNA 結合ホメオ ドメイン エンコード) ホメオ ボックスの突然変異を運ぶ F0アベンテイル動物を交配により17を求めた (図 4 a, C Hを参照してください)。X. laevis [morpholino アンチセンス オリゴヌクレオチドを使用して Gsc 式のノックダウン示唆gsc遺伝子は32の前頭部の完全な開発に必要な Cas9 sgRNA 注入オタマジャクシもショー胚性致死表現型17。ただし、leapfrogged F0動物、野生型であるアデノーマは実行可能で、堅牢な、F1コンテンツクリエイター生産X. laevisノックダウン17の発行するものに同一の LOF の表現型の胚。Morpholino の表現型と同様、原則の証拠を飛び越えてのこれらのデータ提供遺伝の確証は、胚性致死の表現型を克服するために使用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56035/56035fig1.jpg"> 図 1: 移植に必要な材料。(A) ホウケイ酸ガラス パスツール ピペットを使用して眉髪のナイフと髪が初期胚のマイクロサージェリーのループします。ブンゼン バーナーを使用してガラスを図面は髪の挿入のための狭い端にことができます。赤の矢印は、ガラスを破ることでおおよその位置をマークします。(B) ピペットに速乾性の接着剤で固定眉髪のナイフ (上) と毛のループ (下) の例。96 ウェル PCR プレートの (C) の部分は金型の周りを固めるための 1% の agarose を許可することで、アガロース ・ プレートのくぼみを作成する使用されます (アガロースは 0.3 x または 1 で作られてX. tropicalis で、移植が行われているかどうかに応じて、x MMRまたはX. laevis、それぞれ)。Agarose の厚さは 3-4 mm ~ 5 mm-深井戸。(D) 移植、12 のアガロース ・ プレートの例のくぼみ、パネルCに示すように。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56035/56035fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56035/56035fig2.jpg"> 図 2: 中原腸胚初期と郭清の戦略に後期胞胚の植物極の形態。(A ~ F)アフリカツメガエルの性胚胞胚期 9 の初めからの half-hourly 間隔で植物性ビューに表示 (4.5 hpf) 初期原腸胚ステージ ~10.25 に (7 hpf)。5 の前に hpf、割球が大きくより簡単に破損します。白破線の円は、パネル (EおよびF) の背側 (上) の先頭を形成を見ることができる原腸陥入時にボトル細胞形成の正常な位置をマークします。リープフロッギングの 4 つが切開広場内、黒の破線で描かれた、最終的なカット (示されていない) 組織の表面に平行な作られた植物性の外植体を解放します。スケール バー = 400 μ m.<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56035/56035fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56035/56035fig3.jpg"> 図 3: 移植します。(A) 植物性の PGC を含む組織の除去後 ~5.5 hpf 胚の例。黒い点線のボックスと白い破線の円は、図 2に示すように、同じ相対寸法です。パネル、ビューアーに直面して内面の胚から削除 (B)、植物性植側 mm あたり約 0.4-0.45 mm で深さ 0.25 0.3 です。(C) 移植された植物組織を持つ胚。画像は、移植後 〜 10 分を買収されました。(D)、植物性、移植後 30 分組織 (穏やかな旋回、眉髪のナイフで上記パネルCに見られる破片を一掃渦を作成する使用された胚) 場所に治癒が見られています。1/9 倍 MMR と 25 ° C で培養する転送後、ほとんど胚の原腸陥入通常完了します。スケール バー = 400 μ m.<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56035/56035fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56035/56035fig4v2.jpg"> 図 4: F0動物から生殖のリープフロッギング プロデュースします。(A) リープフロッギングの 2 つの遺伝子は、CRISPR/Cas9、チロシナーゼ(上)、 goosecoid (下) に狙われました。Tyr遺伝子は、N 末端のシグナルペプチド (SP、赤影) (青) のコーディングのシーケンス内でターゲットを絞った4、5 、 gsc遺伝子がコーディングでシーケンス内でターゲットを絞った17ホメオ ボックス (赤影) の初め、2 つのエクソン間で分割されています。5' と 3' exonic の非翻訳領域が影付きです。(B) からのすべての 160 F1オタマジャクシ (表 1を参照してください) leapfrogged F0男性 (LF1) とアルビノの繁殖 (tyr-/-)女性だったことを示すアルビノ leapfrogged 男性から全体の生殖であったtyr変異の生殖細胞に置き換えられます。はめ込みは、通常網膜とメラニン色素沈着と野生型の幼生を示しています。(C H)2 F0エムアンドエー インター クロスから派生した F1胚アベンテイルアフリカツメガエルホメオ ボックス遺伝子をターゲットとgsc。Gscの表現型変異胚の約 2/3rds、表現型とされる (E H) 頭の前部切り捨ての度合い。変異体の半分かサイクロ ピックやその他の半分が眼 (H) 密接に間隔の目 (F) を持っていた。ジェノタイピングは、これらについてまたは複合ヘテロ接合体を示した。野生型のホモまたはヘテロ接合体 (C, D) の野生型表現型を示す胚の 1/3rd .Otx2 (前脳、中脳、目のマーカー)、 egr2 (マーカー 3 と 5、および神経の頂上のストリームを菱脳 rhombomeres) およびhoxb9 (脊髄のマーカー) のin situハイブリダイゼーションは、の損失を示しています。gsc関数otx2ドメインの前方の部分のみに影響を与えます。電撃らからこれらのデータを再生しています。生物学者の会社から許可を得て17 。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56035/56035fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>クロス</td>
			<td>男性</td>
			<td>女性</td>
			<td>アルビノ</td>
			<td>野生型</td>
			<td>合計</td>
			<td>% アルビノ</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>LF1</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>160</td>
			<td>0</td>
			<td>160</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>LF2</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>148</td>
			<td>0</td>
			<td>148</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>LF3</td>
			<td>409</td>
			<td>0</td>
			<td>409</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>LF4</td>
			<td>0</td>
			<td>519</td>
			<td>519</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>LF5</td>
			<td>223</td>
			<td>0</td>
			<td>223</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>LF6</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>493</td>
			<td>703</td>
			<td>1196</td>
			<td>41.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>LF7</td>
			<td>1</td>
			<td>94</td>
			<td>95</td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>LF8</td>
			<td>125</td>
			<td>0</td>
			<td>125</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>LF9</td>
			<td>0</td>
			<td>417</td>
			<td>417</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>LF10</td>
			<td>252</td>
			<td>0</td>
			<td>252</td>
			<td>100</td>
		</tr>
</tbody></table>チロシナーゼの突然変異を運ぶリープフロッグ移植によって表 1: 効率的な生殖細胞系列交換。チロシナーゼをターゲットに、男女の移植軸受け動物が得られました。これらの動物は、ホモtyr-/-、突然変異体の対立遺伝子の生殖と幼生段階で検定した白子症を示した F1胚の % の効率をテストするためのアルビノと交差しました。「男性」と「女性」というラベルの付いた列内のエントリは、親がtyr-/- またはリープフロッギング (LF) から派生した実験動物のいずれかを示します。アルビノ表現型は「% アルビノ」の下で示されるクロス表示内で胚の割合リープフロッグ移植 10 動物の 6 が突然変異体の対立遺伝子と完全に (100%) 代替を示したことに注意してください。電撃らからこのテーブルを再現します。17権限を持つ。

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Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

生存に不可欠な遺伝子突然変異系統を作成するための技術的なハードルをもたらします。リープフロッギング ゲノムの生殖細胞系突然変異を運ぶ野生型動物を作成する始原生殖細胞移植と編集を組み合わせることにより致死性を回避できます。リープフロッギング F1世代でホモの null 変異体の効率的な生成ができます。ここでは、移植の手順が示されています。

アフリカツメガエルのリープフロッギング CRISPR/Cas9 ベースの始原生殖細胞の移植

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

primordial-germ-cell-transplantation-for-crisprcas9-based

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

8.3K ビュー.  University of California, Irvine. 生存に不可欠な遺伝子突然変異系統を作成するための技術的なハードルをもたらします。リープフロッギング ゲノムの生殖細胞系突然変異を運ぶ野生型動物を作成する始原生殖細胞移植と編集を組み合わせることにより致死性を回避できます。リープフロッギング F1世代でホモの null 変異体の効率的な生成ができます。ここでは、移植の手順が?...

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Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

遺伝学

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9 仲介の対象となる統合生体内で相同性を介した終わり参加ベースの戦略を使用して

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data in all cells, including stem cells, and its integrity is fundamental to its regenerative ability. Stem cells undergo rapid propagation in labs to achieve the necessary numbers for transplantation. Accelerated cell growth leads to the loss of DNA integrity by accumulated metabolites, such as reactive oxygen, carbonyl, and alkylating agents. Transplanting these cells would result in poor engraftment and regeneration of the deteriorating organ. Moreover, transplanting DNA-damaged cells leads to mutations, DNA instability, cellular senescence, and possibly, life-threatening diseases such as cancer. Therefore, there is an immediate need for a quality control method to evaluate the cell's suitability for transplantation. Here, we provide step-by-step protocols for the assessment of the DNA integrity of stem cells prior to cell transplantation.

Here, we provide a detailed description of an experimental setup for an analysis of the assessment of DNA integrity in stem cells prior to cell transplantation.

心臓の細胞治療幹細胞 DNA の完全性を評価します。

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

CRISPR Cas を用いた哺乳類細胞におけるゲノム編集

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in vivo gene control of neocortical projection neuron morphology. This method is based on (1) in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors as "test" and "control" cells, (2) their co-transplantation into wild-type brains, and (3) paired morphometric evaluation of their neuronal derivatives. Specifically, E12.5 pallial precursors from panneuronal, genetically labeled donors, are employed for this purpose. They are engineered to take advantage of selected promoters and tetON/OFF technology, and they are free-hand transplanted into neonatal lateral ventricles. Later, upon immunofluorescence profiling of recipient brains, silhouettes of transplanted neurons are fed into NeurphologyJ open source software, their morphometric parameters are extracted, and average length and branching index are calculated. Compared to other methods, this one offers three main advantages: it permits achieving of fine control of transgene expression at affordable costs, it only requires basic surgical skills, and it provides statistically reliable results upon analysis of a limited number of animals. Because of its design, however, it is not adequate to address non cell-autonomous control of neuroarchitecture. Moreover, it should be preferably used to investigate neurite morphology control after completion of neuronal migration. In its present formulation, this method is exquisitely tuned to investigate gene control of glutamatergic neocortical neuron architecture. Taking advantage of transgenic lines expressing EGFP in other specific neural cell types, it can be re-purposed to address gene control of their architecture.

Based on in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors, their co-transplantation into wild-type brains and paired morphometric evaluation of "test" and "control" derivatives, this method allows accurate modeling of in vivo gene control of neocortical neuron morphology in a simple and affordable way.

生化神経建築研究における工学的神経前駆体の脳内移植

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...