この作品は、連邦教育省、ドイツ研究、マックス ・ プランク協会によって共同で資金が供給される MaxSynBio コンソーシアムの一部です。

著者が明らかに何もありません。

対称および非対称の高塩分濃度の条件下での位相状態観察の Guv の成功の生産
ここで紹介するプロトコルは、高塩分濃度のバッファーとソリューションの非対称性の組成物の広い範囲にわたって荷電膜の膜の相状態に及ぼす影響を評価するための戦略を紹介します。この目標の達成に向けた主要な課題の 1 つは、高塩分濃度バッファーで荷電膜の生産です。
ショ糖液とで塩分の高いバッファーで膜を生成される正常に堆積した脂質膜の前水和ステップおよび小胞の成長のための一晩の最終的な水分補給手順を含んだ単純な自発的な腫れアプローチで。ベシクルの収量にも脂質が広がっているように荒く PTFE 板に脂質沈着が行われることに注意してくださいすることが重要です。さらに、脂質膜が同種と流体の相州は温小胞準備中にすべてのステップを行うために不可欠です。他、小胞の人口構成の多と最終的な人口相の状態分析をバイアスします。一方で再取得する小さなボリュームで中断する可能性を提供する小胞塊 Guv 利回りの自発の腫れの特定のプロトコル高濃度分散液胞と非対称のソリューションを提供する一方、膜小胞8,28の希薄化を最小限に抑えながら条件。小胞希釈または外部のソリューション中に交換、内部と浸透圧の不一致による形態変化が誘発または Lo + Ld 相分離41を防ぐため、または低張の場合外 osmolarities まま一致するが肝要です。条件は、小胞が破裂する可能性があります。
PVA による腫れをもたらした多重層膜ベシクル中、高塩濃度の electroformation プロトコルを最適化しよう結果ない膜の生産に。にもかかわらず、自発的に準備時間が長くなると低品質10,17の小胞バッチの結果、荷電ベシクルの巧妙な生産が必要です腫れは付加的な利点が付属します。統計バッチ分析のための十分な収穫で、その結果、最小限の労力を要求し、electroformation とは異なり高度な機器や最適化は必要ありませんでした。さらに、脂質の酸化による汚染が観察されていない42,43。文献によると小胞の脂質組成とそれらが7,17が栽培された対応する株の違いはございません。さらに、PTFE 基板上小胞形成は外国の分子を基板23によって導入されるゲルによる腫れメソッドとは対照的に任意の汚染を含めることを要求されません。Electroformation は、非対称ソリューションの条件を作成するとき過剰な小胞の希釈に関連するそれ以上の欠点が付属します。Electroformation によって生成される膜 (自発的な腫れの中に形成される塊の形で高濃度小胞サスペンション) と対照をなして均一分散として通常存在しています。外部ソリューションの任意の希釈は実質的に同様の小胞数を希釈します。さらに、観察されたこの作品のコース上に高塩分濃度バッファーで希釈した場合不安定な DOPG/eSM/哲膜がショ糖の electroformation によって生成されることなった。蛍光顕微鏡スライドの脂質パッチからの目視検査が可能だった前に、小胞が破裂する示されています。このような不安定と思われる自発的な腫れ10によって得られるものと比較して electroformation により作製したベシクルの上昇した膜緊張します。
高率に部分的な外部ソリューション exchange それだけに実現している小胞希釈非対称 GUV ソリューションの条件を作成する簡単かつ迅速な方法ですが、(ここで: 95%、図 2) の痕跡を希釈時に、ソリューションを腫れが残ります。外部ソリューション exchange の程度の選択は、(セクション 2) の腫れのソリューションと共に小胞塊をピペッティングし、ないあまり希釈間のトレードオフです。したがって、迅速かつ完全な外部ソリューション exchange GUV 相状態観測中に希釈した位相状態の観察を確認することができます詳細37で他の所で説明した代替マイクロ アプローチを紹介小胞。対称非対称ソリューションの条件に変更する場合の位相状態変化の観察はことに同意確かに観察されました。両方の方法、非対称ソリューション条件表示ここでは、比較的簡単な (比較参考文献8) を生み出し、いいえ、知られているリスクの局所組成変化 (比較参照30,31) とさらに、膜張力 (比較参考32)、増加額又は局所加熱 (比較参照33)、別の方法としては、導入で説明されています。マイクロ トラップ中に小胞の内部と外部の浸透圧のバランスではない前述の相状態の成果物だけでなく、高張液条件によるデフレを避けるために唯一のエッセンシャルはスリップに閉じ込められた膜を引き起こす可能性があります。外部ソリューション交換後の記事。
ダイレクトオン/eSM/哲システムでは、その他の場合は、料金の不在からの小胞が GUV 個々 膜44 間の反発の結果の欠如による膨潤を損なう可能性がありますにもかかわらず、自発的な腫れは、非荷電成長に正常に適用されています。.あらかじめ腫れの期間延長またはかさばる脂質 headgroups を導入することは、この問題45をカウンター可能性があります。さらに、腫れに使用したものと異なるソリューションで、希釈後小胞の安定性は、異なる脂質組成と希釈のメディアは、我々 はここで検討していないため異なる場合があります。我々 はまた、紹介調製法と旦那の平均粒径を調整の可能性を検討していません。発泡組成やソリューションを膨潤などのパラメーターが結果に影響を与える可能性があります。代替方法46のアプリケーションは脂質およびここで使用されるソリューションの大きい小胞をもたらす可能性があります、しかし、彼らは、メソッドに関連付けられている他の欠点と来るかもしれない。対称および非対称の高塩分濃度条件で膜を生成する上記のアプローチは、異なる脂質組成から成り、別のメディアに分散した小胞のさらなる研究のため潜在的なツールを提供します。我々 はこれらの可能性を検討していないと、未来の試験は GUV 準備と希釈方法を適用可能性がありますどのように一般的に表示されます。
さまざまな温度で相分離を観察すること
さまざまな温度で膜を研究に適した異なった実験組み立ては存在します。これらの設定は、一般的、文献内で詳細に記載されていない、現在の仕事研究の適用の基本的なアセンブリを示します。
_content"> コントロール測定表示これ社内の設計および構築室の温度はサーモスタットによりきめ細かい制御が、チャンバー内の温度勾配は実験温度分解能内。それは実験熱条件がサーモスタットの読書の間の一貫性が保証されています。
広い温度範囲にわたって GUV 位相状態の評価、時に温度が変更された後は、観察された小胞は平衡も重要です。これを実現する方法の 1 つは、履歴を確認することです。ヒステリシスがある場合温度ステップを下げる必要がありますおよび/または平衡時間は増加します。この作品で制御は動作温度の範囲は 0 - 100 ° C に理想的に限定して確立水ベースのサーモスタットによってその温度としてこの範囲を展開する石油など他の温度制御の液体を使用するかなど、その他の設定を採用することによりペルチェ素子。実習では、動作温度は、可能な限り凝縮または蒸発によっても制限されます。さらに、温度室温から遠く離れて、観察室の間で定常状態温度勾配の発生に可能性が高くなります。また、撮像装置は、極端な温度で被害かもしれない。典型的な温度範囲脂質ベシクル研究 (~ 10-50 ° C7,9) 適切な観測装置の損傷考慮すべきが期待されていません通常。
小胞のドメイン観察成果物
ワイド フィールド蛍光顕微鏡を用いた観察成果物のソース数があります。まず、1 つは小胞段階状態の外観検査の適用されるオブジェクトの最大解像度rが脂質ドメインの検出限界を決定することに注意してくださいする必要があります。 
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56034/56034eq2v2.jpg"> λは、波長、NA は対物レンズの数値の絞り。X 倍率と緑色発光を検出する 0.6 NA 40 の典型的な目的光約 560 nm に達する光学解像度で ~0.6 μ m. したがって、フェーズ状態間で異なる特定の脂質の混合物から作られた小胞の比較研究条件は、同じ目的を同じ脂質混合物の使用にしてください。
他のアイテムは、励起光41への延長露出のため脂質光酸化の結果として脂質ドメインの出来事です。写真の損傷は、脂質の不飽和炭化水素鎖で優先的に発生します。実際には、いくつかの脂質組成の最初均質な小胞のようなドメイン形成後に観察されたここで励起光照射の長期間 (~ 30 s)。その問題に対抗するため励起光保たれた焦点を 1 つのビューのフィールドで相状態評価の数秒。したがって、DiIC18は、我々 の目的に適していた。他の染料は、ただし、可能性がありますはるかに敏感、励起光照射時間の短縮と低い励起強度で処理する必要があります。
小胞のピペット転送から機械的せん断応力は潜在的ドメインを一時的に、それにより歪曲明白な小胞の相挙動をミックスします。いくつかのバッチの異なる小胞は異なる相挙動を示した 0 分後と 5 分後ピペット顕微鏡 coverslip に転送します。また47の混合ドメインで発生するマイクロ流体デバイスにおける流体の流れによるせん断応力を示されています。小胞は、観察する前に平衡のための時間の十分な量の妨げられていない残っているべき。この研究内小胞マイクロ流体デバイスに閉じ込められて後の残された 1 h の妨げられていない小胞の読み込みと観察する前にソリューション交流。
核磁気共鳴分光法48や超解像顕微鏡技術49など代替方法、光の回折限界によって課された制限と同様に、上記の問題のいくつかを避けるために採用される可能性があります。
結論と展望
提示された作品は、高塩分の対称および非対称のソリューションの条件が膜相分離に及ぼす影響の解析は、一連のメソッドを示します。すべての提示されたメソッドは、他のアプリケーションに適しています。マイクロ流体デバイスは、たとえばドメイン形成と解決策の非対称性の誘導の時に消失の動力学を調査するためのプラットフォームを提供します。また、そのように塩分濃度の関数としてドメインの外観を検査できます。すべてのメソッドは、見て興味の他のソリューションを使用して相挙動に及ぼす影響にも使えます。

液-液相分離巨大リポソーム (Guv) 蛍光顕微鏡による微小ドメインの観測以来膜は脂質ラフト仮説1,2を調査するモデル システムとして使用されています。,3. 彼らの自立膜の細胞からの範囲にある、仮説のいかだを備えた細胞膜の適切な模倣です。このような膜に関する数多くの研究は、純粋な水、ショ糖や低塩分ソリューション4,5,6,7、8に分散した小胞で行われています。これらの条件も反映されません高塩分環境と膜ソリューション非対称性生体膜の生理学的に関連する暴露細胞のための条件は。
この仕事と私たちのグループ9から前の文書では、膜荷電成分 Guv の相状態を塩とソリューションの非対称性の存在の関数として調べた。Dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG)、卵スフィンゴミエリン (eSM)、及びコレステロール (哲) (浸透圧 210 mOsm/kg) とショ糖液や高塩分濃度バッファー (100 mM の NaCl、10 mM トリス、pH 7.5、210 の比が異なる混合膜の調製mOsm/kg)。脂質の選択は、すでにこの混合6,8の相図で得られたデータによって正当化されました。
Guv の準備のためのメソッドの数は文献10、11,12で利用できる (ここで注意、水性相油ベースから脂質の転送を含むそれらを考慮13,14膜相挙動に影響を与えるかもしれない残りの石油留分の固有の危険のために)。高塩分濃度バッファーで膜の準備は、具体的な課題に関連付けられます。低いイオン強さの解決策は、については、electroformation 法15,16は、小さな欠陥10,17高収率で膜を準備する簡単な方法を示します。メソッドは、導電性表面 (電極) 脂質の層を堆積、それらを乾燥、交流電界の適用中に水溶液で潤いに基づいています。ただし、このメソッドは、調整塩は水溶液18,19にある必要があります。Electroformation による小胞の成長の原動力である高い伝導率20で妨げられる浸透16と見なされます。したがって、高塩分溶液中膜の electroswelling は、それは異なる塩濃度には腫れのソリューションの最適化を必要と簡単な方法ではありません。21,22を膨潤ゲルによる小胞は形成時間がさらに高速の electroformation の潜在的な代替です。(アガロースまたはポリビニル アルコール (PVA)) ゲルを基板として使用する場合、このアプローチは強化された脂質膜の水和に基づいています。これらのアプローチでは、ただし、場合 agarose ベース腫れ23および/または温度制限の PVA 系の腫れの場合と同様に膜の汚染のリスクが付いています。同様に、セルロース紙基板に膜を成長するプロトコル最近確立された24となっています。このメソッドの一般的な問題は、基板の純度を制御の欠如だけでなく、脂質の大量の使用。この作品の紹介、GUV の準備、すなわち、自発的な膨潤法25,26の最も伝統的な方法の利点を提示します。水蒸気雰囲気でその後腫れ腫れ解決する潤い疎油基基板上の脂質層を乾燥ので構成されます (図 1とプロトコルのセクションで詳細を参照してください)。このメソッドは小胞のサイズ分布の制御を提供していません、高分子基板またはマイクロ流体を意味する電界印加による生産を支援する、手法と比較して全体的に小さい小胞の結果します。しかし、小胞の品質とサイズはここで探検として膜の相状態の確認のために適切にあります。
同様に特定の課題に関連付けられて小胞膜ソリューション間の非対称性を作成します。一般的に使用される方法の 1 つは、目的の外部ソリューション27,28小胞懸濁液の直接希釈です。ただし、これも小胞の分布密度は低くなります。別の戦略は、ゆっくり Guv のソリューションは、フローセルの下部に決済周りの外部ソリューションを交換することで、送受信。不安も流れに小胞を失ったりしないように、低流量、応用8、このアプローチの時間非効率的なレンダリングです。さらに、これらのアプローチのどちらもは完全な外部ソリューション exchange を保証します。明白な解決策は、外部ソリューション交換中にそれらを失うことを避けるために小胞を固定化することです。例えば、ビオチン化膜は、ストレプトアビジン コーティングの表面の29につながれることができます。しかし、このアプローチは、付着の組成の変化につながる可能性があります、したがって非付着膜セグメント30,31。小胞の膜を課す結果をトラップする磁気のアプリケーションまたは電界は緊張32です。ハンドルを持つ必要があります小嚢をトラップする光ピンセットを用いた光担架の使用は局所加熱33を含む可能性があります (すなわちビーズ)、接続されています。膜のトラップは、最終剥離34なし白金線にそれらを成長することにより実現できます。これはただし、薄い脂質管 (テザー) によって分離され、通常ワイヤに接続されている小胞または他の小胞を得られます。
提示された作品は、前述の制限を克服するための戦略を強調表示します。最初自発の膨潤法適応、高塩分濃度バッファーで膜の生産用に最適化の詳細な説明を提案します。その後、単純な希釈やマイクロ流体デバイスの使用率によって非対称ソリューション条件を効率的に作成する 2 つのアプローチを紹介します。私たちの目標は、別のソリューションの条件で膜の膜相状態の解析は、後続のセクションは、統計解析に成功の条件と偽の分類を避けるため現在のヒントについて説明します。
温度変動下におけると同様、等温条件下で解析が行われました。温度 c 中管理を用い、実験的温度制御チャンバーの詳細については、ほとんど説明。ここでは、さまざまな温度条件で膜を観察する社内構築されたセットアップが表示されます。

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phospho-(1&#039;-rac-glycerol), sodium salt</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475C</td><td>abbreviated as DOPG in the text</td></tr><tr><td>chicken egg sphingomyelin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860061</td><td>abbreviated as eSM</td></tr><tr><td>cholesterol (ovine wool, &gt; 98 %)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>abbreviated as Chol</td></tr><tr><td>1,1&#039;-dioctadecyl-3,3,3&#039;,3&#039;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td><td>Molecular Probes</td><td>D-282</td><td>abbreviated as DiIC&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Chloroform, HPLC grade (&amp;ge; 99.8 %)</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (&gt; 99.8 %)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl (37 %)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris (&amp;ge; 99.9 %)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (&amp;ge; 99.5 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Threaded vial 45x27 mm, 15 mL</td><td>Kimble</td><td></td><td>Soda flat bottom, white screw cap</td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Mettler Toledo</td><td>MP220</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat030</td><td></td></tr><tr><td>Epi-fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer D1</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Objective 40x, 0.6 NA</td><td>Zeiss</td><td>LD Achroplan</td><td></td></tr><tr><td>Objective 40x, 0.75 NA</td><td>Leica</td><td>506174</td><td></td></tr><tr><td>Objective 63x, 0.9 NA</td><td>Leica</td><td>506148</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 &amp;plusmn; 0.01 mm</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover slip, 22x22 mm, 0.17 &amp;plusmn; 0.01 mm</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;aser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Bremix Flexible Packaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringes, 5 mL, 10 mL</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m syringe filter</td><td>GVS North America</td><td>Cameo 25AS, 1213723</td><td>Acetate, sterile</td></tr></tbody></table>

phase behavior of charged vesicles under symmetric and asymmetric solution conditions monitored with fluorescence microscopy

相分離巨大リポソーム (Guv) と共存する出展液注文し、液体不規則ドメインが脂質ラフト仮説を調査する一般的な生物物理学的ツール。多くの研究は、しかし、生理学的なソリューションの条件の影響を無視します。そのアカウントの現在の仕事は dioleylphosphatidylglycerol、卵スフィンゴミエリンやコレステロールから成長して荷電膜の液-液相分離に及ぼす高塩分濃度のバッファーと膜ソリューションの非対称性を示します。等温およびさまざまな温度条件下での効果を調べた。
装置および対称および非対称の高塩濃度条件下での荷電ベシクル共存液体ドメインの安定性を監視するため該当する実験的戦略について述べる。これは、高温高塩分濃度バッファーで荷電成分 Guv の準備へのアプローチが含まれています。プロトコルは、小胞の希釈を最小限に抑えながら単純な希釈段階で外部のソリューションの部分的な交換を実行するオプションを必要があります。代替的アプローチは、完全な外部ソリューション exchange では、マイクロ流体デバイスを利用した提示されます。温度変動下における相分離ソリューションの効果を検討した.このため、基本設計と、社内の内蔵温度試験槽のユーティリティを提案します。それとそれらを回避する方法に落とし穴が関連付けられているはさらに、我々 GUV 位相状態の評価に反映します。

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Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy

相分離巨大リポソーム (Guv) 実験は頻繁生理的水条件を無視します。この作品は、膜ソリューションの非対称性と温度の関数として多成分荷電の膜の液-液相分離の高塩分濃度の緩衝効果を研究するアプローチを提示します。

蛍光顕微鏡による監視対称および非対称のソリューションの条件下での荷電ベシクルの相挙動

Phase-separated giant unilamellar vesicles (GUVs) exhibiting coexisting liquid-ordered and liquid-disordered domains are a common biophysical tool to ...

phase-behavior-charged-vesicles-under-symmetric-asymmetric-solution

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.1K ビュー.  Max Planck Institute of Colloids and Interfaces. 相分離巨大リポソーム (Guv) 実験は頻繁生理的水条件を無視します。この作品は、膜ソリューションの非対称性と温度の関数として多成分荷電の膜の液-液相分離の高塩分濃度の緩衝効果を研究するアプローチを提示します。

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Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used for ATP production. The amphiphilic nature of membrane proteins requires particular attention to their handling, and reconstitution into the natural lipid environment is indispensable when studying membrane transport processes like proton translocation. Here, we detail a method that has been used for the investigation of the proton-pumping mechanism of membrane redox enzymes, taking cytochrome bo3 from Escherichia coli as an example. A combination of electrochemistry and fluorescence microscopy is used to control the redox state of the quinone pool and monitor pH changes in the lumen. Due to the spatial resolution of fluorescent microscopy, hundreds of liposomes can be measured simultaneously while the enzyme content can be scaled down to a single enzyme or transporter per liposome. The respective single enzyme analysis can reveal patterns in the enzyme functional dynamics that might be otherwise hidden by the behavior of the whole population. We include a description of a script for automated image analysis.

Here, we present a protocol to study the molecular mechanism of proton translocation across lipid membranes of single liposomes, using cytochrome bo3 as an example. Combining electrochemistry and fluorescence microscopy, pH changes in the lumen of single vesicles, containing single or multiple enzyme, can be detected and analyzed individually.

電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトン ポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

生化学

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local variations in calcium ion concentration. The main molecular components involved in these processes have been identified; however, the specific interplay between calcium ion gradients and the lipids within the cell membrane is far less known, mainly due to the complex nature of biological cells and the difficultly of observation schemes. To bridge this gap, a synthetic approach is successfully implemented to reveal the localized effect of calcium ions on cell membrane mimics. Establishing a mimic to resemble the conditions within a cell is a severalfold problem. First, an adequate biomimetic model with appropriate dimensions and membrane composition is required to capture the physical properties of cells. Second, a micromanipulation setup is needed to deliver a small amount of calcium ions to a particular membrane location. Finally, an observation scheme is required to detect and record the response of the lipid membrane to the external stimulation. This article offers a detailed biomimetic approach for studying the calcium ion-membrane interaction, where a lipid vesicle system, consisting of a giant unilamellar vesicle (GUV) connected to a multilamellar vesicle (MLV), is exposed to a localized calcium gradient formed using a microinjection system. The dynamics of the ionic influence on the membrane were observed using fluorescence microscopy and recorded at video frame rates. As a result of the membrane stimulation, highly curved membrane tubular protrusions (MTPs) formed inside the GUV, oriented away from the membrane. The described approach induces the remodeling of the lipid membrane and MTP production in an entirely contactless and controlled manner. This approach introduces a means to address the details of calcium ion-membrane interactions, providing new avenues to study the mechanisms of cell membrane reshaping.

We present a technique for contactless micromanipulation of vesicles, using localized calcium ion gradients. Microinjection of a calcium ion solution, in the vicinity of a giant lipid vesicle, is utilized to remodel the lipid membrane, resulting in the production of membrane tubular protrusions.

ローカライズされたカルシウム イオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

化学

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

生物工学

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main common features required for this activity resulted from the interactions of CPPs with the plasma membrane (lipids) and more particularly with components of the extracellular matrix of the membrane itself (heparan sulphate). Indeed, independent of the direct translocation or the endocytosis-dependent internalization, lipid bilayers are involved in the internalization process both at the level of the plasma membrane and at the level of intracellular traffic (endosomal vesicles). In this article, we present a detailed protocol describing the different steps of a large unilamellar vesicles (LUVs) formulation, purification, characterization, and application in fluorescence leakage assay in order to detect possible CPP-membrane destabilization/interaction and to address their role in the internalization mechanism. LUVs with a lipid composition reflecting the plasma membrane content are generated in order to encapsulate both a fluorescent dye and a quencher. The addition of peptides in the extravesicular medium and the induction of peptide-membrane interactions on the LUVs might thus induce in a dose-dependent manner a significant increase in fluorescence revealing a leakage. Examples are provided here with the recently developed tryptophan (W)- and arginine (R)-rich Amphipathic Peptides (WRAPs), which showed a rapid and efficient siRNA delivery in various cell lines. Finally, the nature of these interactions and the affinity for lipids are discussed to understand and to improve the membrane translocation and/or the endosomal escape.

The fluorescence leakage assay is a simple method that enables the investigation of peptide/membrane interactions in order to understand their involvement in several biological processes and especially the ability of cell-penetrating peptides to disturb phospholipids bilayers during a direct cellular translocation process.

細胞透過性ペプチドによる膜不安定化を調べる蛍光漏れアッセイ

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

神経科学

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのSNARE媒介性の融合

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

イメージングとパッチクランプ電気生理学用ジャイアントリポソーム製剤

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

生物学

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

pTIRFMによる画像形成細胞膜変形は

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

蛍光顕微鏡による監視対称および非対称のソリューションの条件下での荷電ベシクルの相挙動

要約

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電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトンポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定

ローカライズされたカルシウムイオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

平面支持された二分子層上の単一分子蛍光顕微鏡

細胞透過性ペプチドによる膜不安定化を調べる蛍光漏れアッセイ

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層を持つシングルプロテオリポソームのSNARE媒介性の融合

イメージングとパッチクランプ電気生理学用ジャイアントリポソーム製剤

pTIRFMによる画像形成細胞膜変形は

蛍光顕微鏡による監視対称および非対称のソリューションの条件下での荷電ベシクルの相挙動

要約

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電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトン ポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定

ローカライズされたカルシウム イオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

細胞透過性ペプチドによる膜不安定化を調べる蛍光漏れアッセイ

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのSNARE媒介性の融合

イメージングとパッチクランプ電気生理学用ジャイアントリポソーム製剤

pTIRFMによる画像形成細胞膜変形は

電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトンポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定

ローカライズされたカルシウムイオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

平面支持された二分子層上の単一分子蛍光顕微鏡

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層を持つシングルプロテオリポソームのSNARE媒介性の融合