著者は、研究と開発研究の三角形公園 (ORD RTP) グラフィックとメディア チーム開発のための米国環境保護庁テーピングし、教育のビデオの編集のキース tarpley 氏に感謝したいと思います。またデータ.の最適化に関する役に立つ会話の ProteinSimple からデボラ ・ プリチェットを感謝したいと思いますJM Guynn は、科学教育研究/参加プログラム米国の環境保護庁のオークリッジ国立研究所によって支えられました。

注: 製造業者に従ってすべての試薬とサンプルが準備されていることを確認 &#39; s プロトコルは、以下の通り。この手順、ニトリル手袋、白衣、閉鎖つま先の靴、安全ゴーグルなどの中に適切な個人用保護具を着用してください。特定の材料、試薬や必要な機器のテーブルが個別に提供しています。あらかじめブラッドフォード法 11 のように溶解バッファーを使用すると互換性がある確立された方法論を使用してサンプルの総蛋白濃度を決定する必要があります。
 1 ですサンプルと試薬製造元によって提供された標準的なパックからの準備 <ol>ジチオトレイトール (DTT) の 400 mM の作業ソリューションを準備、透明なチューブを含むに 40 μ l の脱イオン水を追加する <li>、。メーカーから在庫を供給しました。ゆっくりと穏やかなピペットで溶液の混合によってソリューションに気泡を導入することを避けることが重要です</li>。
	<li>追加 20 μ L 10 X サンプルバッファーと 20 μ L 蛍光 5 X を含むピンクのチューブに準備された 400 mM DTT ソリューションのマスター ミックス (材料の表 を参照してください). 
	注: マスター ミックス (MM) ホイル カバーの製造元によって密封される、ピペット チップでピアスする必要があります。ピペットの DTT を水しぶきを避けるために低速ピペッティングで優しくミックス</li>。
	2 μ L のサンプル バッファー、および製造元によって提供白ビオチンはしご管準備の 400 mM DTT ソリューションの 2 μ L × 10 を指定、<li>は次に、16 μ L の脱イオン水を追加します。穏やかに混合し、変性剤濃度を 0.6 mL チューブに移す</li>。
	<li>X サンプルバッファー水とソリューションを 1: 100 X 付属の 10 を希釈して 0.1 準備。十分な 0.1 x すべてのサンプルを希釈するサンプル バッファーを準備します</li>。
	<li>は、最終的な目的総蛋白濃度に依存するサンプルに追加される 0.1 x サンプルバッファーの量を計算します。ミックス 1 パート 5 蛍光 MM x 4 つの部分では、目的最終的な蛋白質の集中を達成するためにサンプルを希釈しました。
	<ol><li>計算通りボリューム: (i) 蛍光 MM x 5 巻 (希望最終的なタンパク質濃度) = 5;/(ii) 蛋白質在庫量 = (必要な容量 x 希望最終的なタンパク質濃度)/蛋白質素材濃度;(iii) ボリューム 0.1 x サンプルバッファー合計ボリューム - 5 MM ボリューム x - 蛋白質の在庫数量を = します</li>。
	</ol></li></ol> 2。サンプルとはしごの変性 <ol><li>に用意された場所のサンプルと、95 ° C の熱ブロック、孵化直後後 5 分ボルテックス チューブをビオチン化はしご実行 〜 5 のスピン卓上遠心と氷の場所で s 
	注: いくつかの蛋白質は蛋白質の集合を防ぐために、キャピラリーのマトリックスに移行を向上させる穏やかな変化の条件 (例えば、70 o C で 10 分間) を必要があります。(たとえばビデオを見なさい) より高い分子量の重いスミアがある場合このオプションを検討してください</li>。
</ol> 3。抗体の調製 <ol><li>最適化によって決定される (代表結果 と ビデオ を参照)、指定された抗体一次抗体 (例えば、1:50、1: 100) の目的の dilution(s) を準備希釈 2. 
	注: 抗体より高い濃度ではより伝統的な西部のしみのためのキャピラリー ベース イムノアッセイの通常使用されます。指定された二次抗体は希釈せずに使用する準備ができています</li>。
</ol> 4。ルミノール-S と過酸化物の準備 <ol><li>ルミノール S と過酸化水素の 1:1 の混合物を準備します</li>。
	<li>ミックス、氷に格納して渦 
	注: この混合物を各実験の試金のために新鮮な用意があることが重要です。250ul 合計ミックスは完全な板を実行に必要な</li>。
</ol> 5。アッセイ プレートの作製 <ol><li> 図 1 で示すように、読み込むサンプルと試薬アッセイ プレートに上記準備します。行ごとに以下の詳細な手順を参照してください。井戸からの蒸発を抑えるようにプレート蓋が試薬の追加と置き換えられます</li>。
	<li>も A1 に A、ビオチン化はしごのピペット 5 μ L の行で。残りの行のピペットは A2 A25 の井戸にサンプル (各 5 μ L) を準備します 。
	注: それはカートリッジ最初の毛細血管は、この標準を実行するため最適化されているので A1 がよく、常にはしごを含まれていること不可欠です</li>。
	<li>B (B1-B25) を各ウェルに抗体希釈 2 ピペット 10 μ L の行にします</li>。
	<li>も C1 に行 C 抗体希釈 2 ピペット 10 μ L で。残りの行の C 井戸、一次抗体 (ウェルズ C2 C25) のピペット 10 μ L.</li>
	<li>も D1 に行 D、ストレプトアビジン-HRP のピペット 10 μ L で。残りの行で D 井戸、二次抗体 (ウェルズ D2 D25) のピペット 10 μ L.</li>
	<li>E (E1 E25) を各ウェルに作りたてのルミノール過酸化ミックスのピペット 10 μ L の行にします</li>。
	<li>は、最後に、各バッファーの井戸の上部 3 行に当たりコンパートメント 500 μ L 洗浄バッファーを追加します 。
	注意: 軽くピペッティングし、泡が毛細血管の読み込みを妨げるし、実行しない先端から最終巻を追放して気泡を最小限に抑えることが重要です</li>。
	<li>すべての井戸を読み込んだら、泡を削除し、井戸の底に液体が確実に部屋の温度で 5 分間 ~ 1000 × g でプレートを遠心分離機します。小ピペット チップまたは清潔な針で任意の目に見える気泡をポップ (例えば、25 ゲージ滅菌 &#34; 担当者トップ &#34; 針).</li>
</ol> <img alt="Figure 1"class="xfigimg"src="/files/ftp_upload/55911/55911fig1.jpg"/> 図 1 。アッセイ プレート ピペッティング テンプレート。色分け適切な試薬、アッセイ プレートに追加のサンプル (最大 24 合計) を表します。A25 まで井戸 A2 からサンプルを準備も A1 (オレンジ) にビオチン化はしごを追加 (水色)、B25 B1 と C1 の井戸に抗体希釈 2 (ライト グリーン)、井戸 C2 C25 (青)、ストレプトアビジン-HRP も D1 にまでに一次抗体 (濃いピンク) に二次抗体D25 まで D2 の井戸 (ダーク グリーン) と E25 (紫) まで E1 の井戸にルミノール過酸化ミックス。洗浄バッファーが大きい中間プレートの最初の 3 つの行に追加されます (紺) の井戸。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55911/55911fig1large.jpg"target="_blank"> この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
 6。 キャピラリーのイムノアッセイ装置の開始 <ol><li>楽器とそれに伴うコンピューターの電源がオンになっていることを確認します。ウォーム アップ時間は必要ありません</li>。
	<li>は、コンピューターで計測ソフトウェアを開きます。最初に、選択、&#34; アッセイ &#34; ウィンドウの右側にあるタブと &#34; 新しいアッセイ &#34; の下で、&#34; ファイル メニュー &#34; 左側。サイズ、サイズの範囲 (例えば、12 230 kDa)、およびカートリッジ選択特定のアッセイに使用された型 (例えば、25 キャピラリー). 
	注: 1 つ 5 月も入力アッセイ パラメーター希望場合蛋白質の集中、抗体の種類、希釈を含むがこれらは測定を開始する必要はありません</li>。
	<li>オレンジのパネルの上にボタンを押すことにより計測器のドアを開きます</li>。
	<li>は、パッケージからキャピラリー カートリッジを慎重に取り外します。ガラス管に触れることがなく、自分自身はカートリッジ ホルダーにカートリッジを配置します。インテリア光のオレンジ色から青色に変化を観察することによってカートリッジの座席を確認してください</li>。
	<li>は、プレートをベンチにしっかりし、プレートの下の部分から蒸発シールを慎重にはがします。Sm とこれらの分離行列の井戸に見られる任意の気泡をポップします。すべてのピペット先端部やきれいな針 (例えば、25 ゲージ滅菌 &#34; 担当者トップ &#34; 針).</li>
	<li>がしっかり確保するプレート ホルダーにアッセイ プレートを置き、計測器のドアを閉じます</li>。
	<li>をクリックして、&#34; 開始 &#34; ソフトウェアでボタンします 。
	注: [スタート] ボタンが表示されない場合、計測器との接続が失われました。トップ左側のメニューから計測器を選択し、接続します。機器のシリアル番号; とポップアップが表示されます。これは、[接続] をクリックします。[スタート] ボタンが表示されます</li>。
	<li>の実行が完了したときは、プレートを破棄します。カートリッジを取り外し、気泡をポップして使用された針と一緒に処分のため鋭利な容器に入れます。楽器が定期的に使用されている場合、接続の問題を避けるために力を残す (例えば、少なくとも毎週) です</li>。
</ol> 7。実験解析 <ol><li>分析前に、確認次の品質チェックが行われます。
	<ol><li>ことを確認を選択して蛍光標準、&#34; 表示基準 &#34; アイコン。基準がで正しく認識されていることを確認、&#34; グラフ ビュー &#34;] タブ。彼らは間違っている場合に行く、&#34; 単一のビュー &#34; 正しいピークを右クリックし、アイコン、&#34; 力標準 &#34;、または不適切なピークを右クリックし、選択 &#34; ない標準 &#34;。各新しい毛細血管にこのチェックを実行します</li>。
		クリックして <li>を確認ビオチンはしご、&#34; サンプル &#34; と &#34; 単一のビュー &#34; アイコン。[実験] タブではしごを選択します。ピークが正しく識別されていない、もし右クリックで &#34; グラフ ビュー &#34; を選択、&#34; 削除ピーク &#34;. 
		注: たとえば、12 230 kDa キット用ビオチンはしごする必要があります表示 12、40、66、116、180、および 230 の kDa のサイズのピーク。この手順を実行しない場合サンプルのピークのサイズが正しく計算されない、誤った結果を生成します</li>。
		<li>ビューおよびサンプル ピークを分析します。実験的計算に必要な信号対雑音 (S/N)、ピークの高さやピーク面積分子量を含むピーク テーブルからデータを取得します</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bradley, H. L., Sabnis, H., Pritchett, D., Bunting, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hematopoietic stem cell protocols. 1185, (2014).</li><li>Guo, L., Eldridge, S., Furniss, M., Mussio, J., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+(hiPSC-CMs)+to+Monitor+Compound+Effects+on+Cardiac+Myocyte+Signaling+Pathways.">Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs) to Monitor Compound Effects on Cardiac Myocyte Signaling Pathways.</a> Curr Protoc Chem Biol. 7 (3), 141-185 (2015).</li><li>Chen, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitation+of+endogenous+proteins+with+precision+and+accuracy+using+a+capillary+Western+system.">Absolute quantitation of endogenous proteins with precision and accuracy using a capillary Western system.</a> Anal Biochem. 442 (1), 97-103 (2013).</li><li>Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. 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S3 (004), (2013).</li><li>ProteinSimple Western. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Size Assay Development Guide, Revision 1. , (2014).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western++blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fastest+Western+in+town:+a+contemporary+twist+on+the+classic+Western+blot+analysis.">The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis.</a> J Vis Exp. (84), e51149 (2014).</li><li>Thorn, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+pathways:+pharmacodynamics+and+adverse+effects.">Doxorubicin pathways: pharmacodynamics and adverse effects.</a> Pharmacogenet Genomics. 21 (7), 440-446 (2011).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+bradford+protein+assay.">Linearization of the bradford protein assay.</a> J Vis Exp. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-based+immunoassays:+principles+and+quantitative+applications.">Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications.</a> Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Capillary Electrophoresis Applications. , (1997).</li><li>. Wes reagents and consumables :: ProteinSimple Available from: <a target="_blank" href="https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html">https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</a> (2017)</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。この原稿が国立健康環境影響研究所によってレビューおよび承認します。コンテンツは、米国 EPA の見解を必ずしも反映しないも支持または推奨される使用法を構成する商号や商品の言及は。

何十年もがずっとあるキャピラリー電気泳動を用いた免疫測定法の開発で持続的な関心低いサンプルと試薬の支出のため、減少処理従来の方法と比較して時間と高い互換性手順4,15を自動化します。毛細血管、ふるい分けの電気泳動、動電、ポリマーと (それぞれ異なるプロパティによってタンパク質を分離、等電点方法などを利用して蛋白質の分離のための異なるプロトコルの数があります。静電気、分配平衡、ふるい分け分離マトリックス、および pH のプロパティ)16。ここでは、自動化されている分離をふるい高分子を用いた抗体ベース (または免疫測定法) のキャピラリー電気泳動法と商業的に採用された3について述べる。このシステムの利点は、使用の操作、標準化された市販試薬と少ない試薬と西部のしみなど伝統的な蛋白質の試金と比較してサンプルを必要とする信頼性の高い、高感度測定の容易さ酵素免疫測定法、その他は、3,4,5を書式設定します。それは、利用可能な分離行列4、しかし最近の製品は 440 kda17 2 から測定可能な範囲を拡大しているによって評価することができます蛋白質のサイズの範囲が制限されており、この技術の以前の評価で指摘されています.さらに、いくつかの溶解バッファーは、18のアッセイに対応する知られている、したがって使用実験試薬の選択考慮されなければならない事前。
市販のコンポーネントを持つ自動化されたプロシージャの主な利点は、標準化された方法と試薬を使用して結果の一貫性です。これはプロシージャ内で重要なステップを自動化してアッセイの失敗のチャンスを最小化します。しかし、キャピラリー電気泳動を用いたイムノアッセイに関する問題を最小限に抑えるためのプロトコル間に特定の慣行が守られなければならないことに注意する重要です。まず、平板載荷の前に新鮮なすぐをルミノール-S/過酸化水素混合物準備は重要です。一貫したタイミングは、一貫性のある発光アッセイ後特定の抗体アッセイの一貫性のある測定値になります、酸化剤を追加した後で発生します。さらに、酸化剤の効力に影響を与える主に試薬の期限切れでないが使用されることが重要です。また、その他の試薬、抗体、サンプルの読み込み順序が (図 1参照) を従うこと厳密に重要です。場違い戻どの試薬は、アッセイの失敗と無駄な実行になります。
これらの重要な手順に加え手法で発生した主な問題は一般的に、最適化によって克服します。確かに、これらの条件はモデル システム/抗体の組み合わせごとに固有であり、したがって各の新しいアッセイの経験的決定する必要があります。この記事で私たちは 3 つの一般的な最適化の手順に焦点を当てる: 露光時間、ライセート滴定および一次抗体希釈。測定可能な結果を生成する能力は、いつルミノール基板はない急速に減らされて、信号の損失で基板の枯渇の結果として露光時間の解析に依存します。ライセートの滴定は、同じ蛋白質ターゲットのための異なった抗体と同様に、別のモデル システムと異なることがそれぞれのアッセイの線形ダイナミック レンジを決定します。抗体希釈濃度を飽和状態に近い選択は無料抗体の不足によって、利用できる蛋白質ターゲット エピトープの異なる量によってのみ、信号の変化は影響しないを確認します。抗体培養時間とスタッキング/サンプル読み込み時間最適化プロセス中にその他の考慮事項があります。ほとんどの場合は、楽器の既定の設定は、解像度と感度の最適なバランスを提供しています。ただし、いくつかの場合、貧しい人々 の解像度や感度を改善できますこれらのパラメーターを調整することによって。
キャピラリー電気泳動を用いた免疫測定法は、高速で効率的、かつ再現性のある蛋白質測定を提供します。一方、これらのメソッドは、研究・開発の設定で主に利用されている、これらの技術の一貫性は、規制と臨床アプリケーションの潜在的なユーティリティと。たとえば、病気の進行と環境毒性や患者に影響を受けやすい集団の同定は、血液、尿、唾液などのアクセス可能な行列の測定蛋白質バイオ マーカーに基づくことが。試薬と操作コスト ドロップ数のサンプルと同時に評価の増加をすることができますターゲットと多分キャピラリー電気泳動を用いたイムノアッセイ法アプリケーションのこれらの種類の使用を見る。

キャピラリー電気泳動イムノアッセイ サイズまたは電荷分離システムを使用してセル lysates の蛋白質の表現を測定し、従来免疫上のいくつかの利点を提供します。たとえば、ゲル、転送デバイス、必要西部のしみと比較して、自動キャピラリー ベースのプロシージャがなくなり、マニュアルを洗います。さらに、必要なタンパク質の絶対量が約 10 倍小さくなりますので毛細血管系稀または限られたサンプル1,2での使用に最適。結果は自動システムを使用して 3 時間ほどで得られるし、以前より定量的で従来の西部よりも再現性が示されている手順3,4、5のしみ。サイズに基づく試金のためのプロセスはドデシル硫酸ナトリウム (SDS) ジチオトレイトール (DTT) のサンプルをロードで構成され、分子量マーカーをスタッキングと分離行列を含むキャピラリーカラムに蛍光ラベルします。毛細血管への電圧はサイズにより試料中のタンパク質を分離し、UV 光が毛細血管壁に分けられた蛋白質を固定化します。毛細血管は、ターゲット固有一次抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) に免疫をプローブ-共役二次抗体。ルミノール及び過酸化物触媒化学発光の光生成電荷結合素子 (CCD) カメラによる測定は、蛋白質を量的に分析をします。
相対的な容易さ、自動キャピラリーを用いた電気泳動イムノアッセイ プラットフォームの速度にもかかわらず、蛋白濃度、抗体の希釈、露光時間など測定条件の最適化は、正確で再現性を得るため重要結果。一般に、これらのシステムの分析を最適化するために次の手順を実行する必要があります。
1) 画面を実行して、評価し信号の蛋白質ターゲットに特異的抗体を選択ください。の特異性を評価する場合は、浄化された蛋白質またはターゲット エピトープを使用できますただし、総蛋白質モデル システムから供給の潜在的な非固有の信号を評価することが重要です。
2) 次に、測定のダイナミック レンジを決定する必要があります。理想的な状況で、サンプル濃度を倍増; として観察は信号倍増 (ピーク領域を使用して測定される)ただし、実習では、予測可能な方法を (例えば、線形フィット) で入力信号に比例して変化はプロテインの定量のために十分。さらに、この最適化はタンパク質濃度高信号ですがまだ実験的モデルの線形の範囲内を定義します。
3) 固定タンパク質濃度の最適化手順 2 で選択したを使用して最適な抗体濃度を決定します。抗体の濃度が増えると、それは彩度で高原まで信号が増加します。この飽和レベルに近い抗体濃度のタンパク質濃度の正確な測定に必要です。
ベアス-2B、気管支変形 SV 40 人間から分離された全細胞抽出物を用いたタンパク質濃度、抗体希釈液、自動キャピラリーによるサイズ測定6露出時間を最適化するために使用するプロセスを示す上皮細胞線。細胞や組織の抽出物からの蛋白質の隔離公開プロトコル7,8,9の数を使用して実行することができます、ここでは説明しません。最適化された条件を使用して実験の結果は合計の報告、リン酸化 1.2 にドキソルビシン (10細胞アポトーシスを誘導する一般的な化学療法剤) に公開される文化 (セリン 15、セリン 20) p53、1.8 と収穫前に h 4 の 2.4 μ g/mL メディア。P53 のピーク面積は、ɑ-チューブリン、ローディング コントロールとして使用する正規化されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wes instrument</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td>004-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P53 DO-1 primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-tubulin primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873</td>
			<td>used as a loading control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass Software</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td></td>
			<td>provided with the Wes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-230 kDa Master kit</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)&#160;</td>
			<td>PS MK02 (since replaced by a new kit #)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</td>
			<td>INCLUDES PART NO: 
			Wash Buffer (60 mL) 042-202 
			10X Sample Buffer (440 &#956;L) 042-195 
			Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 
			Capillary Cartridges (8) PS-CC01 
			Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 
			Luminol-S (1.5 mL) 042-233 
			Peroxide (1.5 mL) 042-234 
			Streptavidin-HRP (132 &#956;L) 042-414 
			Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 
			Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 
			or 
			Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte growth medium, KGM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192152</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte basal medium, KBM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192151</td>
			<td>serum free medium for chemical dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue Bradford Assays</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>23200</td>
			<td>for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Extract kit</td>
			<td>Active Motif (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D1515</td>
			<td>used to prepare whole cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>INCLUDES:</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lysis Buffer AM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M dithiothreitol (DTT)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X PBS&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method

キャピラリーを用いたイムノアッセイを活用する新しい技術は、伝統的なイムノアッセイと比較してより速くより定量的なタンパク質評価をお約束します。他の抗体を用いた蛋白質の試金と同様に、タンパク質濃度、抗体希釈露光時間などの毛細血管に基づく免疫パラメーターの最適化は、意味のある、信頼性の高いの世代に重要な前提条件データ。測定は、信号の変化、溶解濃度の変化に直接比例アッセイの線形の範囲内でなければなりません。ひと気管支上皮細胞ライン、ベアス-2B の適切な溶解液濃度、抗体希釈液と露光時間の選択のプロセスは、ここに示されています。アッセイの直線性は、p53 および α-チューブリン抗体と全細胞抽出タンパク濃度の範囲で表示されます。信号燃え尽き症候群の例が長い露光時間で最高濃度に見え、彩度を示す α-チューブリン抗体希釈曲線が表示されます。さらに、実験結果の例は、ドキソルビシン治療細胞最適化されたパラメーターを使用して報告されます。

露光時間-決定信号バーンアウト
信号燃え尽き症候群は、ルミノール及び過酸化基質がなくなるとすぐに発生します。これは、異なる化学発光の露光時間でデータを調べることによって決定できます。解析ソフトウェアで「編集-&#62;-&#62; 画像解析」に行きます。露光範囲は 480 に 5 s。レーザービームの y 軸は、それぞれの露出からのデータと同様の信号/時間係数を持つ必要がありますので信号/時間を報告します。この係数が小さくなる順に長い露光でルミノールを使い尽くすと場合、p53 は 1 抗体 (図 2) で見る。基質の枯渇のためこのアッセイを 5-30 の露出でのみ 0.2 μ g/μ L の濃度まで測定可能で検討できます。したがって、この例では、15 で s は p53 の最適なデータ解析露光時間を決定しました。
ライセートの滴定-線形動的な範囲を決定します。
測定はピーク面積で測定された信号の変化がサンプルの蛋白質の量の変化に比例して各アッセイの線形ダイナミック レンジ内で撮影することが重要です。15 s の選択の最適な露出時間を使用して前のセクションで p53 と ɑ チューブリンのアッセイの直線性を実演上濃度 (図 3) の 15-fold の範囲を超える。我々 の経験の R2値で &#62;、線形回帰の 0.9 と見なされます許容既知量 (場合の試金は絶対定量) またはサンプルの精製タンパク質の希釈範囲の不明なターゲット蛋白ライセート (場合アッセイ相対定量測定は、)。
抗体希釈の最適化
飽和濃度で抗体を使用する測定信号の変化が蛋白量の変化だけによるものであることを確認できます。例として 2 つと 2 b セルライン全細胞抽出 (アッセイに読み込まれる 0.2 μ g/μ L 総蛋白) は希釈した ɑ チューブリン抗体濃度が 1:25 - 1:800 (図 4) に至るプローブされました。化学発光信号 (ここでは、ピーク面積として測定) 抗体希釈に対してプロットしました。彩度は、1:50 近く観察された希釈曲線が顕著な高原を開始します。
実験的試み - ベアス 2 b 細胞におけるドキソルビシンの治療
ベアス 2 b 細胞培養はドキソルビシンの 3 つの異なる濃度の扱われた最適化されたアッセイ条件を使用して、(1.2、1.8 と 2.4 μ g/mL) 4 時間 (図 5、表 1)。翻訳後修飾による p53 の活性化は、細胞周期の停止、老化、アポトーシス12など、いくつかの細胞応答を仲介します。具体的には、15 のセリンのリン酸化は、ドキソルビシン治療13後アポトーシスの結果、p53 の転写活性化に起因しています。このデモでは、ɑ チューブリンはピーク領域は、コントロールの倍として表示を正規化します。興味深いことに、3.5 p53 リン酸化セリンで 4 倍増にドキソルビシンに 4 時間暴露後 20 セリンのリン酸化 p53 のレベル 15 と 2 倍増加がみ。これらの結果を示す p53 の活性化しかし、用量-反応は見られなかった選択濃度 (逆に、低用量のテストでは、最高の応答が誘発される)。総 p53 このモデル システムでは、明確な治療に対する反応を示さなかった。我々 は以前14亜鉛処理と 2 b の細胞で p53 がない場合は同様の条件で総 p53 の増加レベルのリン酸化の活性化を観察しました。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3.jpg"> 
図 2.露出画像比較信号バーンアウトを検出します。レーン表示 1: 500 希釈で p53 は 1 抗体プローブ ベアス 2 b 溶解液のタンパク質濃度を減少します。化学発光信号係数、計測器ソフトウェアのピーク高さとして報告を重畳しています。ピーク高さとは異なりビジュアル バンド強度が自動的に生成され、バンドとは別に 1 つのパネルから匹敵するの表示を支援する装置によって調整します。信号と消失しつつある (スプリット ピーク) 基質の枯渇を示す 2 つの長い露出で露出時間が増加し、化学発光シグナルの低下を注意してください。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3.jpg"> 
図 3.ライセートの滴定がレーンのビューを表示します。車線を示す溶解液の滴定は、ベアス-2 b 1: 500 p53 は 1 または 1:50 ɑ-チューブリン プローブされるときライセートの(A)を表示します。ピーク面積の値とは異なりビジュアル バンド強度が自動的に生成され、バンドとは別に 1 つのパネルから匹敵するの表示を支援する装置によって調整します。線形回帰分析 (B) は、アッセイは、テスト、0.20 μ g/μ L と 0.025 から 0.40 μ g/μ L, R2値 0.999 の 0.985、0.01 からそれぞれ全範囲にわたって線形を確認します。線形範囲の真ん中に総蛋白濃度は、どちらの方向 (例えばα-チューブリンの 0.2 μ g/μ L) の潜在的なターゲット蛋白質バリエーションに合わせて選ばれました。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig4.jpg"> 
図 4.2 lysates の別ベアス 2 b タンパク質とベースライン正規化なしの α-チューブリン抗体希釈曲線します。明確な発車直線性からトゥーレは、1:50 (0.02) で見られて希釈、彩度を示します。1:50 したがって、この抗体の希釈として選ばれました。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55911/55911fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig5.jpg"> 
図 5。セリンに 4 h ドキソルビシン (DXN) 治療の効果は、ベアス 2 b 細胞の p53 蛋白発現をリン酸化します。ピーク面積は α-チューブリンに正規化され、コントロール (CTL) の倍としてプロットします。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55911/55911fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55911/55911tbl1.jpg"> 
テーブル 1。セリンに 4 h ドキソルビシン (DXN) 治療の効果は、ベアス 2 b 細胞の p53 蛋白発現をリン酸化します。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55911/55911tbl1large.jpg" target="_blank">この表の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

総蛋白製剤からの薬物の標的タンパク質を測定する商用プラットフォームを用いたキャピラリーを用いた免疫測定法が示されています。さらに、露光時間、タンパク質濃度と抗体希釈アッセイ パラメーターは、細胞培養モデル系に最適です。

プロシージャおよび自動キャピラリー電気泳動を用いた免疫測定法のためのキーの最適化戦略

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K ビュー.  U.S. Environmental Protection Agency. 総蛋白製剤からの薬物の標的タンパク質を測定する商用プラットフォームを用いたキャピラリーを用いた免疫測定法が示されています。さらに、露光時間、タンパク質濃度と抗体希釈アッセイ パラメーターは、細胞培養モデル系に最適です。

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Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

パラレル合成と自動液体ハンドリングを使用してUgi反応の最適化

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

生物学

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of microbiology was transformed with the advent of Anton van Leeuwenhoek&#39;s microscope, which allowed scientists to visualize prokaryotes for the first time. The development of the polymerase chain reaction (PCR) is one of those innovations that changed the course of molecular science with its impact spanning countless subdisciplines in biology. The theoretical process was outlined by Keppe and coworkers in 1971; however, it was another 14 years until the complete PCR procedure was described and experimentally applied by Kary Mullis while at Cetus Corporation in 1985. Automation and refinement of this technique progressed with the introduction of a thermal stable DNA polymerase from the bacterium Thermus aquaticus, consequently the name Taq DNA polymerase.
PCR is a powerful amplification technique that can generate an ample supply of a specific segment of DNA (i.e., an amplicon) from only a small amount of starting material (i.e., DNA template or target sequence). While straightforward and generally trouble-free, there are pitfalls that complicate the reaction producing spurious results. When PCR fails it can lead to many non-specific DNA products of varying sizes that appear as a ladder or smear of bands on agarose gels. Sometimes no products form at all. Another potential problem occurs when mutations are unintentionally introduced in the amplicons, resulting in a heterogeneous population of PCR products. PCR failures can become frustrating unless patience and careful troubleshooting are employed to sort out and solve the problem(s). This protocol outlines the basic principles of PCR, provides a methodology that will result in amplification of most target sequences, and presents strategies for optimizing a reaction. By following this PCR guide, students should be able to: 
 
&#9679; Set up reactions and thermal cycling conditions for a conventional PCR experiment 
&#9679; Understand the function of various reaction components and their overall effect on a PCR experiment 
&#9679; Design and optimize a PCR experiment for any DNA template 
&#9679; Troubleshoot failed PCR experiments

PCR has emerged as a common technique in many molecular biology laboratories. Provided here is a quick guide to several conventional PCR protocols. Because each reaction is a unique experiment, optimal conditions required to generate a product vary. Understanding the variables in a reaction will greatly enhance troubleshooting efficiency, thereby increasing the chance to obtain the desired result.

ポリメラーゼ連鎖反応：基本的なプロトコルプラスのトラブルシューティングと最適化戦略

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

Spatial Multiobjective Optimization of Agricultural Conservation Practices using a SWAT Model and an Evolutionary Algorithm

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals across the landscape is of primary importance in watershed management. Traditional economics methods of finding the lowest-cost solution in the watershed context (e.g.,5,12,20) assume that off-site impacts can be accurately described as a proportion of on-site pollution generated. Such approaches are unlikely to be representative of the actual pollution process in a watershed, where the impacts of polluting sources are often determined by complex biophysical processes. The use of modern physically-based, spatially distributed hydrologic simulation models allows for a greater degree of realism in terms of process representation but requires a development of a simulation-optimization framework where the model becomes an integral part of optimization.
Evolutionary algorithms appear to be a particularly useful optimization tool, able to deal with the combinatorial nature of a watershed simulation-optimization problem and allowing the use of the full water quality model. Evolutionary algorithms treat a particular spatial allocation of conservation practices in a watershed as a candidate solution and utilize sets (populations) of candidate solutions iteratively applying stochastic operators of selection, recombination, and mutation to find improvements with respect to the optimization objectives. The optimization objectives in this case are to minimize nonpoint-source pollution in the watershed, simultaneously minimizing the cost of conservation practices. A recent and expanding set of research is attempting to use similar methods and integrates water quality models with broadly defined evolutionary optimization methods3,4,9,10,13-15,17-19,22,23,25. In this application, we demonstrate a program which follows Rabotyagov et al.'s approach and integrates a modern and commonly used SWAT water quality model7 with a multiobjective evolutionary algorithm SPEA226, and user-specified set of conservation practices and their costs to search for the complete tradeoff frontiers between costs of conservation practices and user-specified water quality objectives. The frontiers quantify the tradeoffs faced by the watershed managers by presenting the full range of costs associated with various water quality improvement goals. The program allows for a selection of watershed configurations achieving specified water quality improvement goals and a production of maps of optimized placement of conservation practices.

This work demonstrates an integration of a water quality model with an optimization component utilizing evolutionary algorithms to solve for optimal (lowest-cost) placement of agricultural conservation practices for a specified set of water quality improvement objectives. The solutions are generated using a multi-objective approach, allowing for explicit quantification of tradeoffs.

SWATモデルを用いた農業保全の実践の空間的な多目的最適化と進化的アルゴリズム

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ：半自動化された葉の形状計測のためのImageJのプラグイン

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

電気化学発光免疫測定法により血清心臓ミオシン結合タンパク質-Cの定量のための高感度で特異的な定量法

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

エキソソームの定量化とサイズの測定のための革新的方法

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

新しいロボットシステム、スポティトンを用いた時間分解研究のためのクライオ電子微視的グリッドの準備

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

極低温電子断層撮影の最適化戦略

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

化学発光アッセイによるイネの免疫応答における活性酸素種産生のリアルタイム検出

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

小型節足動物からの血リンパの採取

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus transmission. Hemolymph collection is the basic technology for studying virus-vector interactions. Here, we describe a novel and simple method for the quantitative collection of hemolymph from small arthropods using Laodelphax striatellus (the small brown planthopper, SBPH) as a research model, as this arthropod is the main vector of rice stripe virus (RSV). In this protocol, the process begins by gently pinching off one leg of the frozen arthropod with fine-tipped tweezers and pressing the hemolymph out of the wound. Then, a simple micropipette consisting of a capillary and a pipette bulb is used to collect the transudative hemolymph from the wound according to the principle of capillary forces. Finally, the collected hemolymph can be dissolved into a specific buffer for further study. This new method for collecting hemolymph from small arthropods is a useful and efficient tool for further research on arboviruses and vector-virus interactions.

著者スポットライト:小型節足動物から血リンパを採取するための正確で定量化可能な方法  

We describe a method to collect quantifiable hemolymph efficiently from small arthropods for subsequent analysis.