DSおよびCECは、一部、助成金AI053531（NIAID、NIH）によって支持された。 SSおよびPSCは、補助金N00014-14-1-0792（ONR）によってサポートされていました。

著者は何も開示することはない。

各PIP変異体は、低濃度ではあるが、それらは独特の物理的組成およびオルガネラ膜1の機能的特異性の確立に寄与する特定の細胞小器官の細胞質表面に存在します。 PIPの最も重要な用途の一つは、特定の細胞内局在および/または活性化6,7を必要とするタンパク質の多数のための特定のドッキングプラットフォームとしてあります。細胞生理学および疾患におけるそれらの役割のために、生理学的に関連する状況において、 インビトロでタンパク質-PIP相互作用を研究する能力が重要である。本明細書に記載されたアッセイフォーマットは、極性脂質の混合物の存在下、極性頭部基および天然長の脂肪アシル鎖の正常な提示と、流体脂質二重層との関連でタンパク質-PIP相互作用を考慮することを可能にする。 このアッセイは、組み合わせてpHシステムを検出システムとして使用し、SLBをマイクロ流体プラットフォームにセットされたモデル膜システムとして使用することは、他の膜結合技術と比較して独特の利点を提供する。まず第一に、マイクロ流体プラットフォームは、使用されるタンパク質および脂質（40nLの全チャネル容積、1.0mm 2の SLB表面積）の両方について、容積要件が低いために材料を節約する。また依然として二次元膜流動性を維持しながら、生理学的に関連する脂質組成物を使用することができる（≥1.0ミクロン2 / S）28、38。この検出システムは、タンパク質 - 膜相互作用だけでなく、イオン、小分子、ペプチド - 膜相互作用を試験することを可能にする、散逸（QCM-D）モニタリングを伴うITC、SPR、および水晶振動子マイクロバランスと比較して、ウェル19、20、39、 </40歳 。また、pH感受性蛍光プローブは非常に安定であり、19、20、41試験の実験条件下で光退色しません。このプラットフォームの別の利点は、膜表面を視覚的に観察する能力である。ある種の相互作用は、脂質ミクロドメインの形成を誘発し、および/または光漂白（FRAP）後の蛍光回復を介して直接視覚化および/または試験することができる膜流動性に影響を与え得る42 。ここに記載されたアッセイは、蛍光顕微鏡を超える高価な機器を必要としない。最後に、最も重要なことに、リガンド/レセプター標識の非存在下で膜相互作用を評価することにより、PIP-on-a-chipアッセイが従来のアッセイよりも好ましい方法となる。 PIP-on-a-chipアッセイは強力な技術であるが、末梢膜タンパク質は、カチオン性およびアニオン性残基の全体的な組成および結合部位内/その周りのそれらの分布において一定の問題を生じる。いくつかのタンパク質は多くの塩基性残基からなるPIP結合部位を有するが、他のタンパク質は少数しかない。したがって、結合部位でのH + / OH -比は異なってくるであろうし、結合時の局所pHの変化の大きさも変わるであろう。相互作用の化学量論およびPIP-結合が他の脂質との相互作用によって安定化されるかどうかは、場合をさらに複雑にする。したがって、タンパク質のpI、特に大きなタンパク質のpIは、期待される蛍光変化の唯一の指標ではない可能性がある。いくつかのタンパク質-IPP相互作用は大きな蛍光変化をもたらすが、残りは小さな蛍光変化をもたらし得る。後者の場合、信号対雑音比を高めるために少なくとも2つの処置を取ることができる：1）二重層上のより大きなPIPレベルを使用してタンパク質の数を増加させる。rすなわち 、補充されたOH -イオンの数および急冷されたo SRB-POPE分子の数を増加させる; 2）信号対雑音比を向上させるためO SRB-POPEのレベルを増加させます。 現在のプラットフォームは末梢膜タンパク質の研究に多くの利点を提供するが、膜貫通タンパク質の研究にはいくつかの課題がある。 SLB-ガラス支持近接（水層は、脂質組成に応じて約1~2 nmである）に、膜貫通タンパク質、ガラス支持体相互作用は、タンパク質の変性を促進することができる機能の損失につながる、そして固定化34により、43、44、45 。より関与していても、これらの課題を克服するために、ポリマークッションを提供するためのガラス支持体の表面改質またはリポポリームを含む様々なアプローチが開発されている二重層内のRテザー（例えば、PEG化脂質）がSLB-ガラス支持距離34、46、47、48を増加させます。 高品質のSLBを形成することは、PIP-on-a-chipアッセイの最も重要な側面である（ 図8A ）。再現性を保証するには、きれいなカバースリップと新鮮なSUVを使用することをお勧めします。 PI（4,5）P 2のようなアニオン性脂質の存在により、SUVは負に帯電し、SUVの破裂効率を低下させ、膜の流動性に影響を及ぼす（ 図8B ）。したがって、SUV液のpH調整は、（4,5）P 2個のヘッド群リン酸PIをプロトン化し、破裂効率49、50を増加させるためにガラスで静電反発力を低下させるために重要です。アニオン性lを含まないSUVipidsは、pH調整を必要としません。さらに、SUVは、酸素プラズマ処理および結合の直後にチャネルに注入されるべきであり、一方、ガラスカバースリップ表面は、SLB形成に必要な親水性である。 SLBの品質に加えて、塵埃粒子も別の問題です。デバイスの製造プロセス中、チャネル間にトラップされたダスト粒子はチャネル融合を引き起こしますが、チャネル内にトラップされたダスト粒子はSLBを損傷したり、溶液の流速を低下させたりします（ 図8C、 8D ）。作業エリアは定期的に清掃してほこりを除去する必要があります。同様に、チャネルへの気泡の曝露は、いずれのステップでも避けなければならず、さもなければSLBを不可逆的に損傷するであろう（ 図8E ）。 PIP-on-a-chipアッセイを計画する際に考慮すべき別のパラメータは、タンパク質貯蔵バッファーである。高濃度で使用する場合、個々の成分（還元剤、塩、抗菌剤、キレート試薬など ）は、蛍光および/またはSLBの完全性に影響し得る。従って、その効果を試験するために貯蔵緩衝液を滴定する必要がある。効果が観察された場合、蛍光のドリフトを防ぐためにタンパク質を滴定する前に、SLBも保存緩衝液条件に平衡化しなければならない。これがpH調節に基づくアッセイであることを考慮すると、可能であれば、精製されたタンパク質は、緩衝液ミスマッチによって引き起こされる蛍光のドリフトを最小にするために、ランニング緩衝液（この場合20mM HEPES、pH7.0）と同じ緩衝成分をも含有するべきである。 結論として、本発明者らは、pH調節アッセイがタンパク質-PIP相互作用を調べるために首尾よく使用できることを実証した。 PIPに重点を置いていましたが、このプラットフォームは、ホスファチジルセリンなどの他の生理学的に関連する脂質を含むより複雑な膜システムとの相互作用を試験するために使用することができます他の28、39、42、51の間でNE、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、コレステロール、。細胞タンパク質以外にも、このアッセイプラットフォームは、ヒト病原体を研究する人々にとって有益であり得る。例えば、ウイルスおよび細菌によりコードされるタンパク質は、細胞膜とのPIP 52、53、54、55、56と特異的にいくつかと相互作用することが示されています。したがって、PIP-on-a-chipアッセイは、タンパク質-PIP相互作用の小分子阻害剤を発見し、特徴付ける手段を提供することができる。

無数の相互作用および生化学プロセスは、二次元的に流体の膜表面上で起こる。真核細胞における膜封入オルガネラは、生化学プロセスおよびそれらの関連プロテオームだけでなく、それらの脂質組成においてもユニークである。例外的な種類のリン脂質の1つはホスホイノシチド（PIP）である。それらは細胞リピドームのわずか1％を占めるにもかかわらず、それらは他の1、2、3、4間の信号伝達、オートファジー、および膜輸送において重要な役割を演じます。細胞PIPキナーゼによるイノシトール頭部基のダイナミックリン酸化は、7つのPIPモノある頭部基、ビス- 、またはトリス-リン酸化5を生じます。さらに、PIPは、膜の細胞内同一性を規定し、1つまたは複数のホスホイノを含むタンパク質/酵素の特殊な膜ドッキング部位として機能するitide結合ドメイン、例えば、プレクストリン相同性（PH）、PHOX相同性（PX）、及びepsin N末端相同性（ENTH）6、7。最もよく研究PIP結合ドメインの一つは、ホスホリパーゼC（PLC）は、特に高ナノモル、低マイクロモルの範囲の親和8内ホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート（PI（4,5）P 2）と相互作用-δ1PHドメインであります、9、10、11。 種々の定性的および定量的インビトロ法が開発され、これらの相互作用の機構、熱力学および特異性を研究するために使用されている。最も一般的に使用されるPIP結合アッセイは、表面プラズモン共鳴（SPR）、等温熱量測定（ITC）、核磁気共鳴（NMR）分光法、リポソーム浮遊/沈降アッセイ、および脂質ブロット（脂肪 - ブロット/ PIP-ストリップ）12、13。これらは広範囲に利用されていますが、それらには多くの欠点があります。例えば、SPR、ITC、およびNMRは、サンプル、高価な計測機器、および/または訓練された人員12、13を大量に必要としています。そのような抗体ベースの脂質ブロットのようないくつかのアッセイ形式は、のPIPの水溶性形態を利用し、非生理的方法12、14、15、16にそれらを提示します。また、脂質ブロットは確実に定量することができないと、彼らは多くの場合、偽陽性/陰性所見12、17、18をもたらしました。これらの課題を克服し、現在のツールセットを改善するため、サポートされている脂質二重層（SLB）に基づいて新しいラベルフリーの方法が確立されました。<html>これはタンパク質-IPP相互作用の研究に成功裏に適用された（ 図1 ） 19 。 タンパク質-PIP相互作用を検出するために使用される戦略は、pH調節感知に基づく。これには、ホスファチジルエタノールアミン脂質頭部群20に直接コンジュゲートされたオルト -スルホローダミンB（ o SRB）を有するpH感受性色素が関与する。 Oの SRB-POPEのプローブ（ 図2A）は低pHで強い蛍光と7.5モル％のPI（4,5）P 2つの含有のSLB（ 図5B）内を6.7のpKaを有する高pHでクエンチします。ドメインは、PIに向かってその高い特異性タンパク質PIP結合の方法論を検証するために広く使用されてきたPLC-δ1のPH（4,5）P 2（ 図5A）、21、22、「&gt; 23、24、25 .Hence、我々は、PLC-δ1のPHドメインは、そのは、PIPオンチップアッセイを介してPI（4,5）P 2への結合を試験するために使用することができると推論した。PHドメイン構築物をこの研究において正味の正電荷（PI 8.4）を有し、したがってOHを集めて使用-イオン（ 図5C）、PI（4,5）P 2含有のSLBに結合すると、PHドメインはOHをもたらす-にイオンを今度は界面電位を変調してO SRB-POPE（ 図5C）26。PHドメイン濃度の関数として、蛍光が消光される（ 図6A）のプロトン化状態をシフト膜表面は、最後に、正規化されたデータでありますPHドメイン-PI（4,5）P 2相互作用の親和性を決定するために結合等温線に適合させた（ 図6B 、 6C ）/ p&gt; この研究では、マイクロ流体プラットフォーム内のPIP含有SLBへのタンパク質結合を行うための詳細なプロトコールが提供される。このプロトコルは、読者に、マイクロ流体デバイスおよび小胞調製物をSLB形成およびタンパク質結合に組み立てることを要する。さらに、PLC-δ1PHドメイン-PI（4,5）P 2相互作用の親和性情報を抽出するためのデータ分析のための指示が提供される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1638">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Coverslip</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:997px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Coverslips: Rectangles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544B</td>
			<td>22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">7X Cleaning Solution</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>976670</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PYREX Crystallizing Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3140-190</td>
			<td>Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sentry Xpress 2.0</td>
			<td>Paragon Industries</td>
			<td>SC-2</td>
			<td>Kiln</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning&#160;</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PYREX Desiccator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89134-402</td>
			<td>Vacuum Rated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biopsy punch</td>
			<td>Harris</td>
			<td>15110-10</td>
			<td style="width:997px;">Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:997px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma Cleaning System</td>
			<td>PlasmaEtch</td>
			<td>PE25-JW</td>
			<td>2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digital Hot Plate</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>H3760-H</td>
			<td>Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Frosted Micro Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mold</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AutoCAD</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>v.2016</td>
			<td>Drafting software for the photomask design</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silicone Wafers</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>1575</td>
			<td>Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 50</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU-8 Developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Penn State Nanofabrication Facility Property</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SUV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457C</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-&#945;-phosphatidylinositol-4-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840045X</td>
			<td>PI4P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046X</td>
			<td>PI(4,5)P2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757C</td>
			<td>POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L-20</td>
			<td>Required for the synthesis of oSRB-POPE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE)</td>
			<td>In-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Scintillation Vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-065</td>
			<td>20 mL volume capacity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aquasonic 250D</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ultrasonic Water Bath</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclepore Track-Etched Membranes</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CX1054-6</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LIPEX Extruder</td>
			<td>Transferra Nanosciences</td>
			<td>T.001</td>
			<td>LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Viscotek 802 DLS</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Data Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>v.6</td>
			<td>Curve-fitting software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Axiovert 200M Epifluorescence Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioCam MRm Camera</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">X-Cite 120</td>
			<td>Excelitas Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Light Source</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa 568 Filter Set</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ex/Em 576/603 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image Processing Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10034-132</td>
			<td>200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53509-070</td>
			<td>10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Orion Star A321 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA3210</td>
			<td>pH meter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Orion micro pH probe</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8220BNWP</td>
			<td>micro pH probe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N&#39;-(2-Ethanesulfonic Acid)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRB30487</td>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH8014-2.5KGR</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tubing</td>
			<td>Allied Wire &#38; Cable</td>
			<td>TFT-200-24 N</td>
			<td>Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nitrogen Gas - Industrial</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Local Provider</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxygen Gas - Industrial</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Local Provider</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Local Provider</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pip-on-a-chip: a label-free study of protein-phosphoinositide interactions

数多くの細胞タンパク質が膜表面と相互作用して必須の細胞プロセスに影響を与えます。これらの相互作用は、ホスホイノシチド（PIP）の場合のように、特定の細胞内局在および/または活性化を確実にするために、膜内の特定の脂質成分に向けられ得る。 PIPおよび細胞PIP結合ドメインは、細胞生理学におけるそれらの役割をよりよく理解するために広範に研究されている。本発明者らは、タンパク質-IPP相互作用を研究するためのツールとして、支持された脂質二重層（SLB）上にpHモジュレーションアッセイを適用した。これらの研究では、pH感受性オルソ -スルホローダミンB結合ホスファチジルエタノールアミンを用いてタンパク質-PIP相互作用を検出する。タンパク質がPIP含有膜表面に結合すると、界面電位が調節され（ すなわち 、局所pHの変化）、プローブのプロトン化状態がシフトする。 pH調節アッセイの成功した使用の事例研究は、ホスホリパーゼC delta1 Pleckstr相同性（PLC-δ1PH）ドメインおよびホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート（PI（4,5）P 2 ）相互作用を例として示す。この相互作用の見かけの解離定数（ K d、app ）は、他のものによって得られたK d、app値と同様に、0.39±0.05μMであった。以前に観察されたように、PLC-δ1PHドメインはPI（4,5）P 2特異的であり、ホスファチジルイノシトール4-リン酸に対するより弱い結合を示し、純粋なホスファチジルコリンSLBへの結合は示されない。 PIP-on-a-chipアッセイは、従来のPIP結合アッセイよりも有利であるが、これには、限定されるものではないが、サンプル量が少なく、リガンド/レセプターの標識化要件がないこと、小型および低親和性膜相互作用大分子、および改善された信号対雑音比。したがって、PIP-on-a-chipアプローチの使用は、広範囲の膜相互作用のメカニズムの解明を容易にするであろう。さらに、この方法は潜在的にu膜と相互作用するタンパク質の能力を調節する治療薬を同定することには魅力的である。

我々はPIP-on-a-chipマイクロデバイス（ 図1 ）内のPLC-δ1PHドメイン-PI（4,5）P 2相互作用を研究するためにpH調節アッセイを使用した。詳細なプロトコールを通して、マイクロ流体デバイスコンポーネントの準備と組み立て、小型ユニラメラベシクル（SUV）の作成（ 図2 ）、デバイス内でのSLBの作成（ 図3 ）、PIP含有SLBへのタンパク質結合のテスト方法を示しました。典型的なSLB結合実験のフローチャートを図4に示す 。 pH調節アッセイの原理を、例としてPHドメイン-PI（4,5）P 2結合を用いて図5に示す。この研究から得られた結果は、PHドメインがPI（4,5）P 2含有SLBに結合することを示唆した。より具体的には、結合すると、局所pHがより基本的になることが観察された。この<html> SLB内に存在するo SRB-POPE蛍光プローブによって局部的なpH変化を感知し、それに応じてそれをクエンチした（ 図6A 、 6C ）。急冷は濃度依存性で飽和性であったため、データをラングミュア等温線に適合させると、0.39±0.05μMのK d appが得られた（ 図6B 、 6D ）。 PHドメインは、POPC（双性イオン性脂質）に対して結合が観察されず、PI4P含有SLB（ K d、app = 1.02±0.20μM）に対する結合が弱かったので、PI（4,5）P 2に対する選択性を示した（ 図6B ）。蛍光データがどのように処理されるかを示すためのサンプル計算が含まれています（ 図7 ）。 図8では、SLBおよびマイクロチャネルの品質を決定する視覚的手掛かりを提供するために、一連のマイクロチャネル画像が提示されている。 _content &quot;fo：keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55869/55869fig1.jpg" /> 図1：タンパク質-IPP相互作用を研究するためのPIP-on-a-chipマイクロ流体デバイス。 （ A ）マイクロ流体デバイスは、8個のマイクロチャネルを有し、8個のマイクロチャネルおよび8個のマイクロ流体チャネルを有する。色付きの溶液を流し、この画像でチャネルを可視化した。装置の幅（x）は2.0cm、高さ（y）は0.5cm、長さ（z）は3.0cmです。 （ B ）マイクロチャネルの床はガラスであるが、壁および天井はポリジメチルシロキサン（PDMS）で構成される。各マイクロチャネルの幅は100μm、高さは40μm、長さは1cmです。隣接する2つのマイクロチャネル間の間隔は40μmである。支持された脂質二重層（SLB）がガラス表面の上に形成される。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55869/55869fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> </a&gt; <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55869/55869fig2.jpg" /> 図2.小型単層ベシクル（SUV）調製と品質管理試験 （ A ）脂質成分： オルト -スルホローダミンB-POPE（ O -SRB-POPE）、L-α-フォスファチジルイノシトール-4-リン酸（PI4P）、L-α-フォスファチジルイノシトール-4,5-ビスホスフェート（ PI（4,5）P 2 ）、および1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ -3-ホスホコリン（POPC）からなる群から選択される。 （ B ）脂質小胞のタイプ：SUV、大単層小胞（LUV）、巨大単層小胞（GUV）、および多重小胞（MLV）。 SUVはSLBの準備に最も適しています34 。 （ C ）動的光散乱（DLS）に基づいて、小胞後脂質押出（0.1μmフィルターを通して）のサイズを確認した。 53.9nmの流体力学的半径（Rh）は、m<html>小胞のサイズ分布の約100nmである。結果は、PI（4,5）P 2含有SUVからの測定値を表す。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55869/55869fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55869/55869fig3.jpg" /> 図3：ガラス支持体上のSLB形成。 （ A ）所望の脂質組成のベシクルを調製し、マイクロチャネルに流す。ベシクルはガラス表面に吸着して変形する。臨界表面被覆率が達成されると、ベシクルは自発的に破裂してSLBを形成する。参考文献35、36から適応。 （ B ）10X対物レンズ下のデバイス内のSLBが示されています。 Alexa 568フィルターセット（励起/発光576/603 nm）が使用されます。ource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55869/55869fig4.jpg" /> 図4：典型的なSLB結合実験のフローチャート。マイクロ流体デバイスの構成要素、 すなわちパターニングされたPDMSブロックおよび洗浄されたカバースリップは、酸素プラズマで処理されて、両表面を親水性にし、次いで組み立てられる。 SUVは、マイクロチャネルを流れてSLBを形成する。余分な小胞を除去し、ランニング緩衝溶液を流すことによってSLBを実験条件に平衡化する。次に、タンパク質希釈液をマイクロチャネルに流す。最後に、蛍光強度データを分析し、正規化し、タンパク質濃度の関数としてプロットする。正規化されたデータは、見掛けの解離定数（ K d、app ）vaルー<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55869/55869fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55869/55869fig5.jpg" /> 図5：pH変調に基づくセンシングの原理。 （ A ）PI（4,5）P 2頭部イノシトール1,4,5-三リン酸（Ins（1,4,5）P 3 ）との複合体におけるPLC-δ1PHドメインのX線結晶構造（PDB ID：1MAI） 37 。 （B）O SRB-POPEプローブは非常に低pHでの蛍光と7.5モル％のPI pH滴定曲線に示されているようのSLBを含有（4,5）P 2内で6.7のpKaを有する高pHでクエンチします。 （ C ）この研究で用いたPHドメインは等電点（pI）が8.4であるため、実験的pH（7.0）ではタンパク質は正に荷電している。ネット正のcを持つタンパク質はOH -イオンを引きつける。 PHドメインは、PIに（4,5）P 2含有のSLBを結合すると、それはOHをもたらす-膜表面にイオンが、界面電位を順番に入出力 SRB-POPE、その蛍光のプロトン化状態をシフトする変調されPHドメイン濃度依存的にクエンチされる。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55869/55869fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55869/55869fig6v2.jpg" /> 図6：pH調節によってモニタリングされたPLC-δ1PH-膜結合。 （ A ）示された濃度でPHドメインを添加する前後のマイクロチャネルの図。 （ B ）POPC、PI4PおよびPI（4,5）P 2含有SLBに対する親和性の比較。 PHドメイン結合<html> 〜7.5モル％のPI（4,5）P 2含有SLBは、0.39±0.05μMのK d appを生じた。 7.5モル％のPI4P含有SLB（ K d、 1.02±0.20μM）に対してより弱い結合が観察され、純粋なPOPC SLBについては結合が観察されなかった。エラーバーはSEM（n = 3）を示す。両側t検定を使用して、PI4PとPI（4,5）P 2結合（* p = 0.0396）との間の親和性を比較した。 （ C ）POPC、PI4PおよびPI（4,5）P 2結合実験のために、マイクロチャネルを横切るラインスキャンからの蛍光強度をピクセル単位の距離の関数としてプロットする。 （ D ）標準化および平均化されたPOPC、PI4P、およびPI（4,5）P 2結合データをPLC-δ1PHドメイン濃度の関数としてプロットし、次にLangmuir等温線に適合させてK d appを抽出する。詳細は、ステップ8.4の式を参照してください。&quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <img alt="図7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55869/55869fig7.jpg" /> 図7：データ処理の計算例 （ A ）ブランク（タンパク質なし）およびタンパク質チャネルのタンパク質滴定ラインスキャンデータの前（黒色）および後（赤色）。蛍光強度データはピクセル単位の距離の関数として示される。網掛け領域は、計算のためにデータを抽出するために使用された領域を表します。ベースライン蛍光強度データは、各チャネルの直前および直後に抽出される。 （ B ）ブランクおよびタンパク質チャネルについて、タンパク質滴定前後のデータを抽出する。平均は、ベースラインおよびチャネル蛍光データ内で取られる。ベースライン減算の後、蛍光データはブランクチャネルに対して正規化される。詳細は、ステップ8.3の式を参照してください。 <a<html> href = &quot;https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55869/55869fig7large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 <img alt="図8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55869/55869fig8.jpg" /> 図8：SLBとマイクロチャネルの完全性の評価 （ A ）高品質のSLBおよびマイクロチャネルを示す画像。 （ B ）不完全な融合。 （ C ）融合マイクロチャネル。 （ D ）マイクロチャネル内に閉じ込められた粉塵粒子。 （ E ）マイクロチャネル内に閉じ込められた気泡。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55869/55869fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> 補足ファイル1：Pattern_Design.dwgblank &quot;&gt;ここをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

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PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

ここでは、pH調節に基づく無標識法を用いてタンパク質 - ホスホイノシチド相互作用を研究するためのマイクロ流体プラットフォームの文脈で、支持された脂質二重層を提示する。

PIP-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

pip-on-chip-label-free-study-protein-phosphoinositide

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K ビュー.  The Pennsylvania State University. ここでは、pH調節に基づく無標識法を用いてタンパク質 - ホスホイノシチド相互作用を研究するためのマイクロ流体プラットフォームの文脈で、支持された脂質二重層を提示する。 

ビデオ: PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

生物工学

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ラマン分光法を用いた細胞と細胞外マトリックスの非接触、ラベルフリーの監視

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

使用プラ​​センタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定<em&gt; ex vivoで</em&gt;ヒト胎盤灌流モデル

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma membrane1. To regulate neuronal excitability, the biophysical properties of ion channels are modified by signaling proteins and molecules, which often bind to the channels themselves to form a heteromeric channel complex2,3. Traditional assays examining the interaction between channels and regulatory proteins require exogenous labels that can potentially alter the protein&#39;s behavior and decrease the physiological relevance of the target, while providing little information on the time course of interactions in living cells. Optical biosensors, such as the X-BODY Biosciences BIND Scanner system, use a novel label-free technology, resonance wavelength grating (RWG) optical biosensors, to detect changes in resonant reflected light near the biosensor. This assay allows the detection of the relative change in mass within the bottom portion of living cells adherent to the biosensor surface resulting from ligand induced changes in cell adhesion and spreading, toxicity, proliferation, and changes in protein-protein interactions near the plasma membrane. RWG optical biosensors have been used to detect changes in mass near the plasma membrane of cells following activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), receptor tyrosine kinases, and other cell surface receptors. Ligand-induced changes in ion channel-protein interactions can also be studied using this assay. In this paper, we will describe the experimental procedure used to detect the modulation of Slack-B sodium-activated potassium (KNa) channels by GPCRs.

Optical biosensor techniques can detect changes in mass near the plasma membrane in living cells and allow one to follow cellular responses in both individual cells and populations of cells. This protocol will describe detection of the modulation of potassium channels by G-protein coupled receptors in intact cells using this approach.

Gタンパク質共役受容体によるカリウムチャネルの調節を検出するために、ラベルフリー光学バイオセンサの使用

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

単一細胞分泌物の時空間イメージング用ラベルフリー技術

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

マイクロトロイドの光共振器を用いたラベルフリー単一分子検出

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations and development of microstructurally motivated mathematical models for understanding the mechanical properties of human resistance arteries in health and disease have the potential to aid understanding how disease and medical treatments affect the human microcirculation. To develop these mathematical models, it is essential to decipher the relationship between the mechanical and microarchitectural properties of the microvascular wall. In this work, we describe an ex vivo method for passive mechanical testing and simultaneous label-free three-dimensional imaging of the microarchitecture of elastin and collagen in the arterial wall of isolated human resistance arteries. The imaging protocol can be applied to resistance arteries of any species of interest. Image analyses are described for quantifying i) pressure-induced changes in internal elastic lamina branching angles and adventitial collagen straightness using Fiji and ii) collagen and elastin volume densities determined using Ilastik software. Preferably all mechanical and imaging measurements are performed on live, perfused arteries, however, an alternative approach using standard video-microscopy pressure myography in combination with post-fixation imaging of re-pressurized vessels is discussed. This alternative method provides users with different options for analysis approaches. The inclusion of the mechanical and imaging data in mathematical models of the arterial wall mechanics is discussed, and future development and additions to the protocol are proposed.

We describe simultaneous mechanical testing and 3D-imaging of the arterial wall of isolated, live human resistance arteries, and Fiji and Ilastik image analyses for the quantification of elastin and collagen spatial organization and volume densities. We discuss the use of these data in mathematical models of arterial wall mechanics.

ラベル無料蛍光顕微鏡によるライブ、人間の抵抗血管のコラーゲンとエラスチンの圧力依存性アーキテクチャを評価します。

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

PIP-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

要約

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この動画の章

癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面

ラマン分光法を用いた細胞と細胞外マトリックスの非接触、ラベルフリーの監視

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

使用プラセンタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定

Gタンパク質共役受容体によるカリウムチャネルの調節を検出するために、ラベルフリー光学バイオセンサの使用

ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ

単一細胞分泌物の時空間イメージング用ラベルフリー技術

マイクロトロイドの光共振器を用いたラベルフリー単一分子検出

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製

ラベル無料蛍光顕微鏡によるライブ、人間の抵抗血管のコラーゲンとエラスチンの圧力依存性アーキテクチャを評価します。

PIP-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

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癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面

ラマン分光法を用いた細胞と細胞外マトリックスの非接触、ラベルフリーの監視

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

使用プラ​​センタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定

Gタンパク質共役受容体によるカリウムチャネルの調節を検出するために、ラベルフリー光学バイオセンサの使用

ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ

単一細胞分泌物の時空間イメージング用ラベルフリー技術

マイクロトロイドの光共振器を用いたラベルフリー単一分子検出

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製

ラベル無料蛍光顕微鏡によるライブ、人間の抵抗血管のコラーゲンとエラスチンの圧力依存性アーキテクチャを評価します。

使用プラセンタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定