私たちは、米国農務省農業研究庁と国立科学財団（IOS 1025881およびIOS 1361554）からの資金提供を認めたいと思います。私たちはR. Caspersに温室保全とプラントケアに感謝します。イルミナライブラリーの調製と配列決定が行われたミネソタ大学ゲノミクスセンターにも感謝します。私たちはまた、ジャーナル編集者と4人の匿名の査読者からのコメントに感謝して、私たちの原稿をさらに強化しました。我々はまた、OECDに、これらのプロトコルを日本の同僚との共同プロジェクトに統合するためのSKへのフェローシップに感謝する。

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今日まで、ほとんどのオルガネラ配列研究は、特定のDNAを豊富にする伝統的なDC法を中心に研究しています。モス40を含む多様な植物からオルガネラを単離する方法が記載されている。小麦15および小麦11などの単子葉植物;アラビドプシス11 、ヒマワリ17 、ナタネ14などの双子葉植物が挙げられる。ほとんどのプロトコルは、いくつかの種子11を含む組織型の種々のために適合されたもので、葉組織13、14、15、16、17に焦点を当てます。プロトプラストからのオルガネラの単離もまた実証されている41 。しかしながら、これはすべてのシステムに受け入れられず、関心組織が限られている場合には実現可能でもない。これらのオルガの多く生理学的研究のような特定の実験のために無傷の細胞小器官を回収するためのネラール単離法を設計した。これらのプロトコールは面倒であり、典型的には、特定の細胞小器官画分を単離するのに非常に効率的であるが、大きな組織入力を必要とする（ すなわち、 5g以上のキログラムを必要とする、スクロースまたはパーコール勾配のような密度勾配の使用を必要とする。組織タイプ）。しかし、DC法は、スピン速度および密度勾配を変化させることによって、ミトコンドリアまたは葉緑体などの特定の細胞分画を富化するように最適化することができる。対照的に、MFアプローチは出発材料（20mg）をはるかに必要とするが、ミトコンドリアおよびプラスチドのDNAは、DNA抽出に使用される組織中のそれらの相対存在量につき存在するであろう。それにもかかわらず、MFプロトコルは、混合オルガネラDNAを単離するための代替的なアプローチを提供し、少量の組織で開始する場合に特に有益である。 T<html> Oオルガネラ単離後のサンプルの純度を評価するため、これまでのほとんどの研究は、エンドポイントPCRおよびゲル電気泳動11,12を使用します。これは、サンプルの純度の公正な定性的尺度を与える。しかし、低レベルの増幅は、アガロースゲル上で視覚化されないことがある。いくつかの報告にはqPCR 14などの品質管理のより定量的な尺度が含まれています。両方の方法から単離されたDNAサンプル純度の定量的評価のために、qPCRおよびシークエンシングを利用して、サンプル中の核DNAの量ならびにミトコンドリアDNAと葉緑体DNAの相対的比率を決定した。ここで評価した両方の方法は、核DNAを除去するのに有効です。両方の方法は、ミトコンドリアDNAと葉緑体DNAの混合物を異なる比率で産生するが、 暗闇の中で成長する植物（テルモレーション）は、フェノール系物質の減少によるオルガネラの単離を促進すると報告されているしかし、この比較では、光を発したサンプルよりも腐敗した組織での作業には大きな利点は見いだせなかったが、特殊な葉緑体の割合は、光が生育すると高くなると思われるが、葉緑体ゲノムにマッピングされている読みの割合に反映されているが、異なる光条件では変化しないため、異なる組織または異なるストレッサー下でのヘテロプラスミーの評価や発現解析などの下流機能解析では、生理学的に関連する条件下で成長した植物。 短リードシーケンシング技術を用いたアプリケーションでは、ここで比較した両方の技術が十分なDNA量と品質をもたらします。しかし、1分子シークエンシングアプリケーションで20kbを超える長い読み取りを達成するためには、より高品質のDNAがより多く必要です。例えば、理想的には、&gt;1μgの純粋なorga分子量が20 kb以上のネラ小麦DNAは、20 kb挿入ライブラリー調製物のための社内の低入力プロトコールに必要です42 。新規ユーザーが開発した、低入力プロトコルは、DNAの要件（ すなわち、50 ngのにまたは20でもそれ以下）を減らすことができるが、課題は、高品質、ライブラリの準備に入る高分子量のDNAを持っていません。より大きいDNAが&gt; 20kbであることが不可欠である。なぜなら、より小さい断片が優先的にSMRTbellに挿入され、ライブラリー43のサイズ分布を捨てるからである。私たちは、自家製のDNA抽出プロトコールと、DNA抽出のためのいくつかの商業プロトコール（図示せず）を試みた。小麦葉組織について、DNAの量と質との間の最適なバランス、特に長さは、市販のキット27、29を用いて得ました。関心のある植物種および組織に応じて、オルタナティve抽出プロトコルは、同様に適しているか、またはより有益であり得る。それにもかかわらず、MBD2-Fcプルダウンアプローチ28による分画に続いて、&gt; 50kbの高分子量ゲノムDNAの全抽出が、限定された出発物質からの長時間の配列決定に適していると結論する。今後の研究では、ロングインサートライブラリーの調製とそれに続くロングリードシーケンシングの分画に必要な出発物質の限界を試験する必要があります。重要なことに、このアプローチは、全ゲノム増幅を伴わずに、長い読み取り配列に適した単一葉のサブサンプルからDNAを単離する堅牢な方法を提供することができる。我々は、このアプローチが追加の組織タイプに容易に適応可能であり、他の植物種に広く適用可能であると予想している。それは、交差スキームまたはより希少な組織タイプにおける個々の世代での配列決定のような、組織量が制限されている状況において特に有用である。

<html>ゲノム配列決定は、重要な植物形質の根底にある遺伝的根拠を解明するための強力なツールです。ほとんどのゲノムシーケンシング研究は、遺伝子の大部分が核内に位置するため、核ゲノムの内容に焦点を当てています。しかし、（真核生物にわたる）ミトコンドリアと色素体（植物中で、特殊な形式、葉緑体、光合成で動作）を含む細胞小器官のゲノムは、生物の開発、ストレス応答、および全体的なフィットネス1に不可欠な重要な遺伝情報を貢献します。オルガネラゲノムは、通常、核ゲノム配列決定を目的とした全DNA抽出に含まれますが、DNA抽出に先立つオルガネラ数を減らす方法も使用されています2 。多くの研究は、オルガネラゲノムを組み立てるために、総gDNAの抽出からの配列決定結果を使用していた3、4、5、外部参照&quot;&gt; 6、7。しかし、多くの人がしている読み取るための研究の目標は、合計のgDNAは、シーケンシングコストを増大させ使用して、細胞小器官のゲノムに焦点を当てているとき、『特に大きな核ゲノムを有する植物で、核DNA配列に』失われましたまた、による核ゲノム中へのオルガネラ配列の複製、転写および細胞小器官の間に、配列決定の正しいマッピング位置を解決することは、適切なゲノムに読み出しバイオインフォマティクス2,8に挑戦されている。核ゲノムからオルガネラゲノムの精製が1でありますミトコンドリアと葉緑体との間の相同性領域にマッピングされる読み取りを分離するために、さらなるバイオインフォマティクス戦略を使用することができる。 多くの植物種からのオルガネラゲノムが配列決定されているが、オルガネラゲノム多様性の幅についてはほとんど知られていない野生の集団または栽培された繁殖プールで利用可能である。オルガネラゲノムはまた、反復配列間の組換えのために重要な構造的再編成を受ける動的分子であることが知られている9 。さらに、オルガネラゲノムの複数のコピーが各オルガネラ内に含まれ、複数のオルガネラが各細胞内に含まれる。これらのゲノムの全てのコピーが同一であるとは限らず、ヘテロプラスミーとして知られている。 「マスターサークル」の正統図とは対照的に、サブゲノム円、線状染色体、線状コンカテマー、分枝構造など、細胞小器官ゲノム構造のより複雑な画像の証拠が増えています10 。植物オルガネラゲノムの集合は、それらの比較的大きなサイズおよび実質的な逆方向反復および直接反復によってさらに複雑になる。 オルガネラ単離、DNA精製およびその後のゲノムに関する従来のプロトコール<html> E配列は、多くの場合、煩雑であり、いくつかのグラム、組織入力の大容量を必要とするように上方に始点11、12、13、14、15、16、17、必要に応じて、若い葉の組織のグラム数百。これは、組織が限られている場合、細胞小器官のゲノム配列決定が不可能になります。いくつかの状況では、交配によって維持されなければならない雄性不稔性系統または世代別に配列決定する必要がある場合など、種子の量は限られる。このような状況では、細胞小器官のDNAを精製してから全ゲノム増幅を行うことができます。しかしながら、全ゲノム増幅は、構造変化、サブゲノム構造、およびヘテロプラスミーレベルを評価する際に特に問題となる、有意な配列決定バイアスを導入することができる&gt; 18。短リードシーケンシング技術のライブラリ作成における最近の進歩は、全ゲノム増幅を回避するために低入力障壁を克服してきた。例えば、Illumina Nextera XTライブラリー調製キットでは、1 ngのDNAを入力19として使用できます。しかしながら、PacBioまたはOxford Nanopore配列決定技術のような長時間配列決定アプリケーションのための標準ライブラリー調製は、オルガネラゲノム配列決定のための課題を提起することができる比較的多量の入力DNAを依然として必要とする。最近、新しいユーザー作られた、長読みシーケンシングプロトコルは、入力量を低減し、DNAのマイクログラム-量を得ることが21、20困難なサンプルではゲノム配列決定を促進するために開発されてきました。しかしながら、これらのライブラリー調製物に供給するための高分子量の純粋なオルガネラ画分を得ることは、依然として課題である。 私たちは全ゲノム増幅を必要とせずに、NGSに適したオルガネラDNA濃縮および単離法を比較し最適化する。具体的には、葉のサブサンプルなどの限られた出発物質から高分子量細胞小器官DNAを濃縮するためのベストプラクティスを決定することでした。この研究は、（1）市販のDNA CpG-メチル結合ドメインタンパク質プルダウンアプローチの使用に基づく（2）DNA分画プロトコルに対する、改変された伝統的な微分遠心分離プロトコルである細胞小器官DNAを濃縮する方法の比較分析を提示する22は、組織23を植える適用しました。我々は、小麦葉組織からのオルガネラDNAの単離のためのベストプラクティスを推奨しており、これは他の植物および組織タイプに容易に拡張することができる。

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-100ml</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose</td><td>Bio-Rad</td><td>1613108</td><td></td></tr><tr><td>analytical balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td></td></tr><tr><td>balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>PB1502-S</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 mL tubes</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2664</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>ethanol, absolute</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5 M Solution, pH 8.0</td><td>Fisher</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>gel imaging system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gel stain</td><td></td><td></td><td>Such as GelRed or Ethidium Bromide</td></tr><tr><td>grinding pestle, wide tip for 2 mL conical tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanidine-HCl, 8 M solution</td><td>ThermoFisher</td><td>24115</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysing enzymes from Trichoderma harzianum</td><td>Sigma</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>G Bioscience</td><td>24115</td><td></td></tr><tr><td>magnetic rack</td><td>ThermoFisher</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 mL&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge, refrigerated</td><td>Sorvall&amp;nbsp;</td><td>Legend X1R</td><td>Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 mL tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 mL tubes</td></tr><tr><td>microcentrifuge, room temperature</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units</td><td>EMD Millipore</td><td>MRCFOR100</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel</td><td>EMD Millipore</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2612L</td><td></td></tr><tr><td>parafilm</td><td>Parafilm M</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>plastic pots and trays</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>polyvinylpyrrolidone (PVP)</td><td>Fisher</td><td>BP431-100</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703697</td><td></td></tr><tr><td>purification beads, Agencourt AMpureXP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>10223</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Buffer EB (elution buffer)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNA Extraction Buffer Set</td><td>Qiagen</td><td>19060</td><td></td></tr><tr><td>QiaRack</td><td>Qiagen</td><td>19015</td><td></td></tr><tr><td>qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480)</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR plate sealing film</td><td>Roche</td><td>4729757001</td><td></td></tr><tr><td>qPCR plate, 96 well plate</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&amp;nbsp;assay tubes</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Broad Spectrum assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Qubit High Sensitivity assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>RNaseA</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (20 mL) and pipet-aid</td><td>Fisher</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Small funnels, 1 per sample</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>Soft paintbrush, 2 per sample</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer</td><td>SPEX SamplePrep</td><td></td><td>Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Omnipure</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>thermomixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T2819-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>tube rotater</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubes, 50 mL conical polypropylene</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>tubes, 50 mL high-speed polypropylene&amp;nbsp;</td><td>ThermoScientific/Nalgene</td><td>3119-0050</td><td>e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent</td></tr><tr><td>vermiculite</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>water, sterile and certified Nuclease-free&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>1481</td><td></td></tr><tr><td>water, sterile milliQ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optimization and comparative analysis of plant organellar dna enrichment methods suitable for next-generation sequencing

植物オルガネラゲノムは、複雑な構造および/またはサブゲノム断片を形成するために対合または組換えを受ける可能性がある、大きな反復要素を含む。オルガネラゲノムはまた、所与の細胞または組織型（ヘテロプラスミー）内での混合物として存在し、多量のサブタイプは、発達中またはストレス下で変化し得る（化学量論的部分シフト）。オルガネラゲノムの構造と機能をより深く理解するためには、次世代シーケンシング（NGS）技術が必要です。伝統的な配列決定研究は、細胞小器官DNAを得るためにいくつかの方法を使用する：（1）大量の出発組織を使用する場合、それをホモジナイズし、分画遠心分離および/または勾配精製に供する。 （種子、材料、又は空間が限られている場合、すなわち、）（2）組織の少量が使用される場合、同じプロセスが（1）十分なDNAを得るために、全ゲノム増幅に続いてのように行われます。 （3）バイオインフォマティクス分析は、seq総ゲノムDNAを調べ、オルガネラの読みを解析する。これらの方法にはすべて固有の課題とトレードオフがあります。 （1）では、そのような多量の出発組織を得ることは困難であり得る。 （2）において、全ゲノム増幅は配列決定バイアスを導入し得る; （3）において、核ゲノムとオルガネラゲノムとの間の相同性が、アセンブリおよび分析を妨害する可能性がある。大きな核ゲノムを有する植物では、オルガネラDNAを濃縮して、バイオインフォマティクス分析の配列決定コストおよび配列複雑性を低減することが有利である。ここでは、伝統的な微分遠心分離法を第4の方法、適合したCpG-メチルプルダウン法と比較して、全ゲノムDNAを核および細胞小器官画分に分離する。いずれの方法も、ミトコンドリアおよび葉緑体において異なる比率であるにもかかわらず、細胞小器官配列に対して高度に濃縮されたNGS、すなわちDNAに対して十分なDNAを生じる。我々は、小麦の葉組織のためのこれらの方法の最適化を提示し、主要な利点およびdサンプル入力、プロトコルの容易性、および下流のアプリケーションの文脈における各アプローチの長所である。

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Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

2つの植物細胞小器官DNA濃縮方法の比較および最適化が提示される：従来の分画遠心分離およびメチル化状態に基づく全gDNAの分画。得られたDNAの量と品質を評価し、短期間の次世代シーケンシングでの性能を実証し、長時間読み取り単一分子シークエンシングで使用する可能性について検討します。

次世代シークエンシングに適した植物オルガネラDNA濃縮法の最適化と比較分析

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

optimization-comparative-analysis-plant-organellar-dna-enrichment

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

12.8K ビュー.  United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service.  2つの植物細胞小器官DNA濃縮方法の比較および最適化が提示される：従来の分画遠心分離およびメチル化状態に基づく全gDNAの分画。得られたDNAの量と品質を評価し、短期間の次世代シーケンシングでの性能を実証し、長時間読み取り単一分子シークエンシングで使用する可能性について検討します。 

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Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

ロングリード配列決定のためのうどんこ病から高分子量のゲノムDNAの精製

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

遺伝学

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The technique is highly efficient with millions of sequencing reads being produced in a short time span and at relatively low cost. Specifically, targeted NGS is able to focus investigations to genomic regions of particular interest based on the disease of study. Not only does this further reduce costs and increase the speed of the process, but it lessens the computational burden that often accompanies NGS. Although targeted NGS is restricted to certain regions of the genome, preventing identification of potential novel loci of interest, it can be an excellent technique when faced with a phenotypically and genetically heterogeneous disease, for which there are previously known genetic associations. Because of the complex nature of the sequencing technique, it is important to closely adhere to protocols and methodologies in order to achieve sequencing reads of high coverage and quality. Further, once sequencing reads are obtained, a sophisticated bioinformatics workflow is utilized to accurately map reads to a reference genome, to call variants, and to ensure the variants pass quality metrics. Variants must also be annotated and curated based on their clinical significance, which can be standardized by applying the American College of Medical Genetics and Genomics Pathogenicity Guidelines. The methods presented herein will display the steps involved in generating and analyzing NGS data from a targeted sequencing panel, using the ONDRISeq neurodegenerative disease panel as a model, to identify variants that may be of clinical significance.

Targeted next-generation sequencing is a time- and cost-efficient approach that is becoming increasingly popular in both disease research and clinical diagnostics. The protocol described here presents the complex workflow required for sequencing and the bioinformatics process used to identify genetic variants that contribute to disease.

対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクス パイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding of the basis of various diseases as well as resistance and/or susceptibility mechanisms. However, FFPE tissues, which represent the most common method for preserving tissue morphology in clinical specimens, are not the best sources for gene expression profiling analysis. The RNA obtained from such samples is often degraded, fragmented, and chemically modified, which leads to suboptimal sequencing libraries. In turn, these generate poor quality sequence data that may not be reliable for gene expression analysis and mutation discovery. In order to make the most of FFPE samples and obtain the best possible data from low quality samples, it is important to take certain precautions while planning experimental design, preparing sequencing libraries, and during data analysis. This includes the use of appropriate metrics for precise sample quality control (QC), identifying the best methods for various steps during the sequencing library generation, and careful library QC. In addition, applying correct software tools and parameters for sequence data analysis is critical in order to identify artifacts in RNA-seq data, filter out contamination and low quality reads, assess uniformity of gene coverage, and measure the reproducibility of gene expression profiles among biological replicates. These steps can ensure high accuracy and reproducibility for profiling of very heterogeneous RNA samples. Here we describe the various steps for sample QC, library preparation and QC, sequencing, and data analysis that can help to increase the amount of useful data obtained from low quality RNA, such as that obtained from FFPE-RNA tissues.

This method describes the steps to improve the quality and quantity of sequence data that can be obtained from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) RNA samples. We describe the methodology to more accurately assess the quality of FFPE-RNA samples, prepare sequencing libraries, and analyze the data from FFPE-RNA samples.

分解されたFFPE-RNAサンプルのシーケンシングと分析の最適化

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

<meta charset="utf8"></head><body>薬用植物のDNAバーコード化:同定と系統解析

Application of DNA Barcoding to Identify Medicinal Plants

Medicinal plants are valuable resources globally and are used worldwide to maintain health and treat disease; however, the presence of adulteration obstructs their development. DNA barcoding, a technique for species identification by standard DNA regions, facilitates prompt and accurate identification of traditional medicinal plants. The process of DNA barcoding entails six basic steps: 1) processing the medicinal plants, 2) extracting high-quality total DNA from the medicinal plants using centrifugal column method, 3) amplifying target DNA region internal transcribed spacer 2 (ITS2) with universal primers of plants and performing Sanger sequencing, 4) splicing and aligning sequence to obtain the target sequence, 5) matching the barcode sequence against the barcode library for identification, 6) aligning sequence, comparing intraspecific and interspecific variation, constructing phylogenetic neighbor-joining tree. As shown in the results, the universal primer can amplify the target region. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) demonstrates the percentage identified was 100%, and the neighbor-joining tree demonstrates that the splicing sequences were clustered with the A. sinensis OR879715.1 clade, and the clade support value is 100. This protocol provides a reference for applying DNA barcoding technology as an effective method to identify medicinal plants and adulterants.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:DNAバーコード技術を活用して薬用植物同定の効率を高める

The present protocol describes the use of DNA barcoding technology to authenticate plant-based medicinal materials, and the medicinal plant Angelica sinensis (Oliv.) Diels was identified as an example.

薬用植物同定のためのDNAバーコードの応用

Medicinal plants are valuable resources globally and are used worldwide to maintain health and treat disease; however, the presence of adulteration ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

次世代シーケンシングのための収集と唾液DNAの抽出

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

医学

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

次世代シークエンシングに適した植物オルガネラDNA濃縮法の最適化と比較分析

要約

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ロングリード配列決定のためのうどんこ病から高分子量のゲノムDNAの精製

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループットシーケンスライブラリーの構築

対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクスパイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

探索ルートマイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

分解されたFFPE-RNAサンプルのシーケンシングと分析の最適化

薬用植物同定のためのDNAバーコードの応用

薬用植物同定のためのDNAバーコードの応用

薬用植物同定のためのDNAバーコードの応用

次世代シーケンシングのための収集と唾液DNAの抽出

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

次世代シークエンシングに適した植物オルガネラDNA濃縮法の最適化と比較分析

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ロングリード配列決定のためのうどんこ病から高分子量のゲノムDNAの精製

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクス パイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

分解されたFFPE-RNAサンプルのシーケンシングと分析の最適化

薬用植物同定のためのDNAバーコードの応用

薬用植物同定のためのDNAバーコードの応用

薬用植物同定のためのDNAバーコードの応用

次世代シーケンシングのための収集と唾液DNAの抽出

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループットシーケンスライブラリーの構築

対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクスパイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

探索ルートマイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出