MHZに与えられた、とUTサウスウェスタン医療センター、がん予防テキサスの研究所（RP160169 CPRIT）;この作業は、クローン病とアメリカの大腸炎財団、（3711 CCFA）からの資金によってサポートされていました

ここで説明する全ての実験は、動物資源センター（ARC）、サウスウエスタン大学医療センターの特定病原体不在（SPF）施設で維持さ6〜8週齢の雄の野生型（C57BL6 / J）マウスを用いて行きました。すべての研究では、施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたとIACUCガイドラインおよび実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って行いました。 1.収集とコロンの調製<ol><li>頸椎脱臼に続いてCO 2窒息でマウスを安楽死させます。 </li><li> 70％エタノールをマウスにスプレーし、ボード上のダウンマウスの背側を維持ピニングボードに手足をピン。 </li><li>予め滅菌解剖ハサミとピンセットを用いて、腹部の腹膜に中線切開を行います。鉗子で腹膜を折り畳むことにより、腹部を開きます。 </li><li>腹腔のwiから腸を削除します鉗子とはさみを解剖番目。盲腸の底部と直腸にもう一方の端に切断することにより、小腸からコロンを区切ります。 </li><li>氷冷PBSを含む滅菌ペトリ皿にコロンを置きます。コロンのルーメン内の便が完全に除去されるまで20 G針または経口胃管栄養針を保持する20 mLの注射器を使用して氷冷PBSで、大腸の内腔の内容をフラッシュします。 </li><li>縦にハサミでコロンをカット。滅菌ペトリ皿に氷冷PBS中で激しく振とうすることにより、大腸を洗浄します。 </li><li>約1cmの長滅菌メスやハサミを使用して小片に結腸組織をカット。 </li><li>結腸片の重量を記録します。 注：第1節のすべてのステップは、内部または生物学的安全キャビネットの外側のいずれかを行うことができます。コロンは、培養のための準備ができたら、すべてのステップは、無菌性を維持するために、生物学的安全キャビネット内で実行する必要があります。 </li></ol> 2.大腸組織文化<ol><li> 6ウェル細胞培養プレート上の細胞ストレーナー（100μm）を置きます。セルストレーナーに1匹のマウスから採取した結腸作品のすべてを転送します。 </li><li> 5％FBS、ペニシリン - ストレプトマイシン（1×）、およびゲンタマイシン（20μg/ ml）を含有する5mlのDMEM / F12培地を追加します。完全にメディアと大腸の部分をカバーしています。 </li><li> 5％CO 2、95％空気インキュベーター中で37℃で2時間インキュベートします。 </li><li>セルストレーナーを持ち上げて、メディアを吸引除去します。 </li><li>バックも上のセルストレーナーを配置し、任意の抗生物質を含まない5ミリリットルに新鮮な培地を追加します。セルストレーナーを持ち上げて、メディアを吸引除去します。 </li><li>残留抗生物質のすべてを除去するために、上記の洗浄工程（ステップ2.5）を2回以上（合計3回）繰り返します。 </li><li>滅菌12ウェル細胞培養プレートの単一のウェルに、単一のセルストレーナーからコロン片を転送します。 </li><li> （任意の抗生物質を含まない）は、5％FBSを含むDMEM / F12培地を追加します。 weigでメディアの音量を調整します結腸片のHT、 例えば 、100mgの組織のための1ミリリットル培地。 5％CO 2および95％空気を注入し、インキュベーター中で37℃で12時間インキュベートします。 </li><li>無菌の1.5mlチューブに培養上清を収集します。 </li><li> 5分間、4℃、12,000×gで遠心分離します。アッセイおよび/または他の免疫アッセイを殺す細菌中での使用のための新たな1.5 mLチューブに上清を分離します。上清を分析まで-80℃で保存することができます。 </li><li> RNA単離のためのチューブでコロン片を収集します。 </li></ol>アッセイキリング3. 大腸菌 <ol><li> 15mlチューブに5mLのルリア-ベルターニ（LB）ブロス中で大腸菌を接種し、一晩200 rpmで振盪しながら37℃でインキュベートします。少しゆるめ培養管のキャップを保管してください。 </li><li> 4℃で10分間、1200×gで遠心分離細菌の培養管。上清を除去し、5mlの氷冷PBSに細菌ペレットを再懸濁します。 </li><li> BACTの移転を1mL600 nmでのキュベットとメジャーODにerialサスペンション。ブランクとしてPBSを使用してください。 </li><li>所定の標準曲線を用いて、コロニー形成単位（CFU）を計算します。ここでは、（約）1 OD = 2×10 9 CFU / mlのことを想定しています。 </li><li>ストック懸濁液1×10 5 CFU / mLのを作るために細菌懸濁液を希釈します。 </li><li> 24ウェル細胞培養プレートの複製ウェルに2.10に収集結腸器官培養上清を転送する（500μL/ウェル）。 </li><li> 1つのウェルを含む500μL大腸器官培養上清中に10μLの大腸菌培養液（千CFU）を追加します。大腸器官培養上清は、任意の汚染が含まれていないことを確認するために、任意の大腸菌接種せずに他のままにしておきます。 </li><li>コントロールとして任意の抗生物質を含まない培地（DMEM / F12 + 5％FBS）中の細菌の数が同じ（千CFU）をインキュベートします。 </li><li> 1時間37℃でインキュベートします。 </li><li>各サンプルドロップのwiの50μLを配置SEマッコンキー寒天プレート上。 37℃で一晩マッコンキー寒天プレートをインキュベートします。 </li><li>コロニーの数をカウントし、CFU / mlで計算します。 </li></ol> 4.結腸抗菌宿主防御応答に対する外因性および内因性因子の影響注：ここで説明したように、抗菌性殺傷アッセイ、器官培養上清の殺菌活性の病原体関連分子パターン（のPAMPs）およびサイトカインの効果を調べるために採用することができます。 IL-1βおよびIL-18を使用して、このような実験例について説明します。 <ol><li>第1節で説明したようにマウスの大腸を収集します。 </li><li>滅菌ペーパータオル上でコロンを置きます。はさみを使用して、3つの部分（ 図2）へ縦方向にコロンをカット。 </li><li>第1節で説明したように、氷冷PBS中で、結腸の各部分を洗います。 </li><li>小片に結腸の各部分をカットし、無菌的に重量を量ります。各パーツの部分を転送します6ウェル細胞培養プレートの3つのウェル（ 図2）上に配置された3つの別々のセルストレーナー（100ミクロン）に結腸。 </li><li> 5％FBS、ペニシリン - ストレプトマイシン（1×）、およびゲンタマイシン（20μg/ ml）を含有する2ミリリットルのDMEM / F12培地を追加します。 </li><li> 5％CO 2および95％空気を注入し、インキュベーター中、37℃で2時間インキュベートします。 </li><li> 2.4から2.6に記載されているように、コロンの部分を洗います。滅菌12ウェル細胞培養プレートの単一のウェルに、単一のセルストレーナーのコロンの部分を転送します。単一のマウスからの結腸の3部を含む3つのウェルは、未処理のIL-1β、およびIL-18（ 図2）として指定する必要があります。 </li><li> （任意の抗生物質を含まない）は、5％FBSを含むDMEM / F12培地を追加します。結腸片の重量、 例えば 、100mgの組織のために1 mLの培地で培地の音量を調整します。 </li><li> 12時間IL-1β（20 ngの/ ml）またはIL-18（20 ngの/ mL）で大腸器官培養を刺激します。未処理のコロン<html>器官培養は、コントロールとして機能します。 </li><li> 5％CO 2および95％空気を注入し、インキュベーター中で37℃で12時間インキュベートした後、滅菌した1.5 mLチューブに培養上清を収集します。 </li><li> 24ウェルプレートの複製ウェルに500μLの培養上清を移します。 </li><li>各条件については、項3に記載のように単一のウェルに大腸菌を接種し、大腸器官培養上清中の大腸菌 （千CFU）を接種します。ウェル大腸菌なしで同一の器官培養上清を含む他の細菌汚染の対照として役立ちます。 </li><li>コントロールとして、任意の抗生物質を含まない培地中で細菌の同量をインキュベートします。 </li><li> 1時間37℃でインキュベートします。 </li><li>滴下マッコンキー寒天プレート上の各サンプルの50μLを置きます。 37℃で一晩のためにマッコンキー寒天プレートをインキュベートします。 </li><li>コロニーの数を数え、CFU / mLの（ 図4）を計算します。 </li></ol>e_title &quot;&gt; 5。抗菌遺伝子の発現の測定<ol><li>セクション2および4に記載されているように結腸器官培養物の一晩のインキュベーション（12時間）後、2 mlの氷冷PBS（2×）で結腸片を洗浄します。 </li><li> 2 mlのRNase / DNaseを無料でスクリューキャップチューブにコロン片を収集します。氷の上にチューブを入れます。 </li><li> 1ミリリットルを商業Trizol試薬を加え、チューブにマトリックスビーズを溶解。 </li><li>溶解自​​動組織ホモジナイザーを用いて組織。 </li><li>新しいマイクロチューブに組織溶解液を収集します。 </li><li>標準プロトコルを用いてRNAを分離します。 </li><li> RNA濃度を測定します。 </li><li>脱イオン水で適切にRNAを希釈し、cDNAを合成するために500 ngのRNAを使用します。 </li><li>標的抗菌遺伝子、サイトカイン、ケモカイン、および目的の他の遺伝子のリアルタイムRT-PCR分析のためのcDNAを使用します。 </li></ol>

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	<li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease.">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li><li>Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+directly+sense+gut+commensals+and+maintain+homeostasis+at+the+intestinal+host-microbial+interface.">Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).</li><li>Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pathogens+and+pathobionts+by+the+gut+microbiota.">Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota.</a> Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).</li><li>Wu, H. J., Wu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+gut+microbiota+in+immune+homeostasis+and+autoimmunity.">The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity.</a> Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).</li><li>Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors+in+mucosal+homeostasis+at+the+intestinal+epithelial+barrier+in+inflammatory+bowel+disease.">Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease.</a> Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).</li><li>Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+disease.">Innate immunity in disease.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).</li><li>Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells+in+vitro.">Intestinal epithelial cells in vitro.</a> Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).</li><li>Autrup, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+human+colon.">Explant culture of human colon.</a> Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).</li><li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+gut+microbial+gene+catalogue+established+by+metagenomic+sequencing.">A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing.</a> Nature. 464, 59-65 (2010).</li><li>Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+advance+in+ex+vivo+intestinal+organ+culture.">A major advance in ex vivo intestinal organ culture.</a> Gut. 61, 961-962 (2012).</li><li>Leushacke, M., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+the+intestinal+epithelium:+strategies+and+applications.">Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications.</a> Gut. 63, 1345-1354 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease:+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model.">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61, 1007-1015 (2012).</li><li>Haque, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+interactions+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+human+small+intestinal+epithelial+explants.">Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants.</a> Gut. 53, 1424-1430 (2004).</li><li>Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+enteroaggregative+Escherichia+coli+to+pediatric+intestinal+mucosa+in+vitro.">Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro.</a> Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).</li><li>Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+adhesion+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli+to+human+intestinal+epithelial+cells+from+mucosal+biopsies.">In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies.</a> Infect Immun. 44, 514-518 (1984).</li><li>Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+regeneration+in+adult+human+colonic+mucosa+during+prolonged+organ+culture.">Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture.</a> J Anat. 134, 459-469 (1982).</li><li>Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+distribution+of+EspG2,+a+type+III+secretion+system+effector+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).</li><li>Bareiss, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+tissue+cultures+from+adult+murine+colon+as+an+in+vitro+model+of+intestinal+mucosa.">Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa.</a> Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).</li><li>Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+culture+and+polarized+stimulation+of+human+intestinal+mucosa+explants.">A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants.</a> J Vis Exp. , e4368 (2013).</li><li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+Sensor+AIM2+Maintains+Intestinal+Homeostasis+via+Regulation+of+Epithelial+Antimicrobial+Host+Defense.">The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense.</a> Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).</li><li>Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ-culture+method+for+human+colorectal+mucosa+using+serum-free+medium.">An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium.</a> J Pathol. 180, 102-105 (1996).</li><li>Dame, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+tissue+in+organ+culture:+preservation+of+normal+and+neoplastic+characteristics.">Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).</li><li>Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+organ+culture+model+using+human+gastro-intestinal+tissue+and+Campylobacter+jejuni.">Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni.</a> FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

腸上皮細胞は、それらの増殖要件の点で非常に敏感で培養することが困難です。 EDTA処理により単離された上皮細胞は、DMEM 8のような従来の細胞培養培地中で生存しません。そのため、孤立した陰窩または一次上皮細胞を用いて、宿主 - 病原体相互作用の研究は非常に困難です。最近、佐藤ら。腸の病態生理13に関連した研究のための非常に有望かつ有用である陰窩オルガノイド培養系を説明しました。オルガノイドは腸陰窩の多くの特徴を示しているが、無菌環境で栽培されているオルガノイド細胞の免疫応答は、 生体内で腸上皮細胞の応答を再現するかどうかの懸念があります。上皮幹細胞とオルガノイドの文化のための高価な試薬の要件の単離および培養のために必要とされる正確な技術はミリアンペアを防ぎますこのシステムを利用することからNY研究所。 ex vivoでの器官培養の使用がオルガノイド文化に代わるものではありませんが、このシステムは、腸上皮の抗菌応答を研究するための簡単で安価な方法を提供しています。 この手法の主な利点は、皿で培養しながら、腸の組織構造が維持されることです。我々は、大腸組織が彼らの文化の後、少なくとも24時間、生理活性であることを観察しました。サイトカインおよび抗菌ペプチドの発現により測定されるようなコロンの培養の間、結腸上皮細胞は、外因性刺激に応答します。無傷の組織の上皮細胞の生存能力は、さらに、培養培地中で適切な成長因子と細胞死の阻害剤を添加することによって向上させることができます。以前の報告は数日間8のためにex vivoでの正常ヒト結腸組織の器官を維持することができたことを示唆しています</SUP&gt;、23、24。 マウス結腸器官のex vivo培養のためのプロトコルは、腸上皮の抗菌免疫応答に関連した研究で多くのアプリケーションを有することができます。病原体およびそれらのPAMPは、Toll様受容体（TLR）および上皮細胞および免疫細胞に存在するNOD様受容体（NLRs）などのPRRによって認識されています。多くのTLRとNLRsの欠陥発現および機能は、IBDへの感受性、結腸直腸腫瘍形成、および細菌感染に関連しています。不死化上皮細胞株は、腸のニッチのすべての機能を表すものではありませんので、ex vivoで結腸器官培養は、非常に有用な実験ツールです。このシステムを使用して、我々は、腸管上皮細胞における抗菌エフェクター分子の誘導に対する様々なのPAMPまたは刺激の効果を調べることができます。代表的な実験では、サイトカインが好きなことを示しましたIL-1βおよびIL-18のトリガー抗菌ペプチドの発現（ 図3）。我々はまた、結腸組織によって生成される抗菌ペプチドが効果的に大腸菌 （ 図4）を殺すことができることをここに示します。これらの技術は、ムラミルジペプチド（MDP）、リポ多糖（LPS）、ペプチドグリカン（PGN）の影響をテストするために適用され、そして腸における抗菌宿主防御応答の他のPAMPできます。 私たちは、少し以前に12、16、20、25説明したように、コロンの器官培養プロトコルを変更しました。我々は2つのフェーズでコロンを培養しました。最初に、私たちは2時間、培地を含む抗生物質での結腸組織をインキュベートしました。私たちは、その後、抗生物質を含まない培地で培養した結腸片の繰り返し洗浄と抗生物質を除去しました。したがって、培養上清を一晩培養物から得られました大腸展示大腸菌とインキュベートし、分泌抗菌ペプチドの効果のみ。このアプローチは、目的の任意の細菌に対して結腸または腸由来の抗菌ペプチドの殺菌効果を確認するために利用することができます。適切な選択寒天培地は、細菌を培養するために使用されるべきです。 ほとんどの技術と同様に、 エキソビボ器官培養系の限界があります。まず、細胞培養またはオルガノイド文化とは異なり、臓器が成長し、増殖するため、拡張することはできませんしないでください。第二に、腸上皮細胞は非常に敏感であり、彼らは陰窩オルガノイド培養に使用される追加の増殖因子およびアポトーシス阻害剤、なしで比較的早く死にます。第三に、器官培養から見た免疫応答は、細胞集団の異なる種類の集合的応答です。したがって、抗菌性およびエフェクター遺伝子の発現の個々の細胞タイプの役割を評価することはできません。 Additionally、細胞株およびオルガノイド文化とは異なり、コロンで抗菌ペプチドおよび他のエフェクター分子の発現は、マウスから同じ遺伝的背景のマウスに異なる場合があります。 要約すると、我々はここで、腸の抗菌免疫応答を研究するために非常に有用であるex vivoで結腸の器官培養のための単純なプロトコルを記述します。このアプローチは、目的の遺伝子変異マウスから結腸を培養することにより、抗菌ペプチドの発現の多様な自然免疫の遺伝子の役割を試験するために使用することができます。さらに、このプロトコルは、結腸生検サンプルの器官培養を行うことにより、IBD患者の腸の抗菌応答を調べるために臨床試験での使用に適合させることができます。

腸は、共生微生物、病原体の侵入と戦うための障壁として作用する動的システムを表し、及び微生物組成物1を調節します 。腸上皮細胞は、腸細胞、杯細胞、パネート細胞および腸内分泌細胞からなる、腸内微生物叢に対する宿主防御反応を提供する主要な細胞集団です。杯細胞は、上皮層2の上に非武装地帯を作成するムチンを産生します。パネート細胞および腸細胞は、抗菌性ペプチド、サイトカイン、および抗菌宿主防御応答を構成し、腸内微生物組成物3、4整形に寄与し、反応性酸素及び窒素種を生成します。上皮細胞に加えて、マクロファージを含む免疫細胞、樹状細胞、好中球、ナチュラルキラー細胞、リンパ球、およびインナ<html> 7 -粘膜固有層および粘膜下組織のTEリンパ球様細胞は、サイトカイン、ケモカイン、および他のメディエーター5を生成することによって、腸抗菌宿主防御応答に重要な役割を果たしています。粘膜免疫系は、微生物叢を調節し、微生物感染に対する保護を提供する方法を理解するためには、消化管の不均一な細胞集団の複雑な相互作用を考慮することが重要です。しかし、腸の機能をすべて網羅in vitroモデルは使用できません。したがって、腸における宿主 - 病原体相互作用に関する分子研究は非常に挑戦的です。 過去数年にわたり、腸粘膜の側面を模倣するいくつかのモデル系は、炎症性腸疾患（IBD）および他の胃腸障害8に関わる病態生理学的プロセスを研究するために開発されています-= &quot;外部参照&quot;&gt; 14。不死化された腸上皮細胞系は、しばしば、上皮細胞特異的応答を研究するために使用されます。しかし、不死化細胞における示差的遺伝子発現および機能の、これらの細胞を使用することから得られたデータは、多くの場合、in vivo試験で観察されたものと一致していません。最近、種々の刺激13への腸管上皮の応答を評価するための潜在的なツールとして浮上してきたオルガノイド文化腸陰窩。このシステムでは、陰窩の幹細胞が増殖し、3Dオルガノイド構造を開発することが許可されています。オルガノイド培養システムは、腸管上皮の多くの側面を研究するために非常に有用であるが、それは、免疫細胞、上皮細胞および微生物産物の複雑な相互作用を模倣しません。腸組織のex vivo培養は、in vivo宿主防御応答のよりよい表現を提供しています。この方法では、腸の一部が細胞培養プレートウィットで培養します腸内の細胞集団の異なるタイプが、少なくとも48時間、代謝的に活性であることを可能にする時間の適切な媒体。このように、臓器のエクスビボ培養物は、抗菌性の遺伝子の発現と特定の刺激に対する腸の宿主防御応答を測定するために使用することができます。 21 -研究者は、腸15内の微生物感染に対する宿主防御応答を研究するためのex vivoでの器官培養系を使用してきました。我々は最近、マウスのコロン22における抗菌宿主防御応答におけるインフラマソームの役割を研究するために器官培養系を採用しました。インフラマソームが成熟IL-1βおよびIL-18の産生のために必要とされるカスパーゼ1の活性化のための分子プラットフォームです。我々は、IL-1βおよびIL-18が効果的に大腸菌など共生pathobiontsを殺す抗菌ペプチドを誘発することが示されました</em&gt;。この観察は、インフラマソーム欠陥マウス結腸22で増加した大腸菌負担と一致しました。このシステムは、したがって、パターン認識受容体（PRR）および腸抗菌宿主防御応答の他の先天性免疫の分子の役割だけでなく、そのような炎症性腸疾患（IBD）および結腸直腸癌（CRC）のような腸疾患の病因を研究するために使用することができます。そこに200以上のIBD感受性遺伝子であり、これらの遺伝子の多くの突然変異は、腸内で改変された微生物組成物に関連しています。これは、IBD感受性遺伝子が腸内細菌叢を調節するを通じて正確なメカニズムを決定するために偉大な臨床的意義のあります。この方法の全体的な目標は、ex vivoで結腸器官培養の基本的なプロトコルを導入し、この培養方法は、腸の抗菌宿主防御応答を研究するために使用することができる方法を示すことです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/ F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride &#38; Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, heat inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-1b recombinan</td>
			<td>Reprokine</td>
			<td>RKP10749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-18 recombinant</td>
			<td>Reprokine</td>
			<td>RKP70380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Luria-Bertani Broth&#160;</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0075-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Uded to measure RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>DU 530</td>
			<td>Used to determine E. coli count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript RT Supermix, 100 rxns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Univer SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix S (1/8&#34;), 2 mL Tube</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td>Used to homgenize colon organ for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>5687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>5085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 micron cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>5698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST40R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Scientific orbital shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the ex vivo colon organ culture and its use in antimicrobial host defense studies

腸上皮細胞の異なるタイプ、ラミナの免疫細胞を含むpropia、及び間質からなる反復陰窩構造のアーキテクチャを表示します。これらの異種の細胞のすべてが腸の恒常性に貢献し、抗菌宿主防御に参加しています。したがって、 インビトロの設定で免疫応答および腸の抗菌活性を研究するための代用モデルを特定することは極めて困難です。 インビトロ研究は、不死化腸上皮細胞株または正常な腸とその微小環境の正確な生理機能を表すものではありませんオルガノイド培養しても、プライマリのcryptを使用。ここでは、培養皿とどのようにこのex vivoの器官培養系抗菌宿主防御応答に関連した研究で実装することが可能で、マウスの結腸組織を培養する方法を議論します。代表的な実験では、器官培養内のコロンがRESPにおける抗菌ペプチドを発現することを示しました外因性IL-1βおよびIL-18にオンセ。さらに、器官培養における大腸組織によって生成された抗菌エフェクター分子を効率的にin vitroで大腸菌を殺します。このアプローチは、従って、腸の自然免疫応答および抗菌宿主防御応答の調節における病原体及び危険関連分子パターンとその細胞受容体の役割を分析するために利用することができます。

器官培養における結腸の代表的な画像は、 図1に示されています。文化の中でコロン片は、代謝および生理活性のまま。彼らは、培養培地に添加外因性の刺激に効率的に対応します。 ex vivoで培養し、外因性刺激による刺激、 例えば、IL-1βおよびIL-18結腸組織の調製の概略的な作業の流れは、 図2に示されています。器官培養中のコロンは、IL-1βおよびIL-18に応答して、このようなβデフェンシン2（BD2）、Reg3γ、S100A8、S100A9、およびiNOSなどの抗菌ペプチドを発現図3ショーで代表的なデータ。 結腸インプラントによって放出メディエーターは、器官培養上清とともにインキュベートした大腸菌 （有意に減少増殖によって示されるように抗菌死滅効果を示します<st栄&gt;）4Aおよび4B図。 大腸菌殺傷活性はさらに、IL-1βおよびIL-18（ 図4Aおよび4B）の刺激によって増強されます。 大腸菌なしでインキュベートした結腸器官培養上清をマッコンキー寒天培地（ 図4Cおよび4D）で培養後ない細菌の増殖を示しません。これらの結果はさらにソームは、腸抗菌宿主防御に重要な役割を果たしていることを示唆しています。 全体的に、ここに示されたデータは、ex vivoで結腸の器官培養は、in vitroで腸抗菌免疫応答を研究するための非常に有用な技術であることを示唆しています。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> GAPDH_F </td><td> TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC </td></tr><tr><td> GAPDH_R </td><td> AAGATGGTGATGGGCTTCCCG </td></tr><tr><td> βデフェンシン2（BD2）_F </td><td> TGACCACTGCCACACCAATG </td></tr><tr><td> βデフェンシン2（BD2）_R </td><td> CCTGGCAGAAGGAGGACAAA </td></tr><tr><td> Reg3γ_F </td><td> CAAGGTGAAGTTGCCAAGAA </td></tr><tr><td> Reg3γ_R </td><td> CCTCTGTTGGGTTCATAGCC </td></tr><tr><td> S100a8_F </td><td> TGTCCTCAGTTTGTGCAGAATATAAA </td></tr><tr><td> S100a8_R </td><td> TCACCATCGCAAGGAACTCC </td></tr><tr><td> S100a9_F </td><td> GGTGGAAGCACAGTTGGCA </td></tr><tr><td> S100a9_R </td><td> GTGTCCAGGTCCTCCATGATG </td></tr><tr><td> iNOS_F </td><td> TGTGACACACAGCGCTACAACA </td></tr><tr><td> iNOS_R </td><td> GAAACTATGGAGCACAGCCACAT </td></tr></tbody></table> 表1：リアルタイムPCR用のマウスプライマーの一覧。 図1：培養中のマウス結腸片の代表的な画像。 （A）6ウェルプレート上に置かれ、セルストレーナー（100ミクロン）の結腸片のインキュベーション。結腸片を、抗生物質を補充した2mLの培地中に浸漬されています。 2時間のインキュベーションの後（B）は 、結腸の部分は、抗生物質を含まない培地を含む新たな12ウェル細胞培養プレートのウェルに移します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55347/55347fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55347/55347fig2.jpg" /> 図2：大腸組織を調製するための手順の概略プレゼンテーションおよびIL-1βおよびIL-18とのex vivoで刺激。 1マウスのコロンはlongiです<html> tudinally三つの部分に解剖しました。各部分は、小片に切断し、秤量しました。結腸の各セクションからの結腸片を2mlのDMEM / F12培地+ 5％FBSおよび抗生物質を含有する6ウェルプレートのウェル上に配置されたセルストレーナーに転写されます。 2時間のインキュベーションに続いて、単一の細胞ストレーナーから結腸片を12ウェル細胞培養プレートの単一のウェルに移します。 DMEM / F12 + 5％FBSを（抗生物質なし）を各ウェルに添加し、培地の容積は、組織（100mgの組織のための1mLの培地）の重量に応じて調整されます。結腸組織を12時間IL-1β（20ng / ml）およびIL-18（20 ngの/ ml）で刺激します。培養上清を遠心分離し、 大腸菌死滅アッセイおよび/または他の免疫アッセイに使用されます。結腸組織をRNA単離およびリアルタイムPCRによる抗菌性遺伝子発現のその後の分析のために商業的トリプシン試薬に収集されます。.jpgの「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55347/55347fig3.jpg" /> 図3：マウスの大腸組織は、ex vivo培養中のIL-1βまたはIL-18に応答してサイトカインおよび抗菌ペプチドを発現します。結腸の器官培養物を12時間、IL-1β（20 ngの/ ml）またはIL-18（20 ngの/ ml）で刺激しました。 BD2、Reg3γ、S100A8、S100A9、およびiNOSの発現は、リアルタイムRT-PCR（ 表1）で測定しました。データは、平均±SDを表します。 * P &lt;0.05、** P &lt;0.01。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55347/55347fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55347/55347fig4.jpg" /> 図4：マウス大腸臓器カルトの上清UREは、殺菌活性を示します。結腸片を12時間IL-1β（20 ngの/ ml）またはIL-18（20 ngの/ ml）の存在下または非存在下でエクスビボで培養しました。培養上清500μlを37℃で1時間、大腸菌 （千CFU）と共にインキュベートしました。 大腸菌なし結腸器官培養上清を対照としてインキュベートしました。 1時間のインキュベーション後、各試料の50μLをマッコンキー寒天プレートに滴下して入れ、37℃で一晩インキュベートしました。大腸器官培養の抗菌活性を示す寒天マッコンキー上の大腸菌コロニーの（A）の画像。 （B） 大腸菌数は、IL-1β-およびIL-18で処理した結腸器官培養上清の効率を殺す示します。 （C） 大腸菌なしでインキュベートした大腸器官培養には細菌の増殖を示さないマッコンキー寒天プレートの写真。 （D）無大腸菌コロニーは、結腸器官Cにおいて同定されましたultureは、試料中の任意の汚染細菌の非存在を示す、 大腸菌なしでインキュベートしました。データは、平均±SDを表します。 ** P &lt;0.01、*** P &lt;0.001。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55347/55347fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.

ザ<em&gt; ex vivoで</em&gt;コロン器官培養および抗菌生体防御研究におけるその使用

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

the-ex-vivo-colon-organ-culture-its-use-antimicrobial-host-defense

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

13.9K ビュー.  UT Southwestern Medical Center. The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine. 

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

ライブホストのトランスジェニックリーシュマニア原虫のin vivoイメージング

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

免疫・感染学

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ザ<em&gt; ex vivoで</emマウス腸オルガノイドの&gt;文化とパターン認識受容体刺激

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

母体・胎児のインターフェイスでの感染症を研究するためにヒト胎盤および脱落膜器官培養

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの病原性を研究するためのEx Vivo鶏ファブリキウス嚢細胞培養モデル

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Optimization of the Cuff Technique for Murine Heart Transplantation

Murine cardiac transplantation has been performed for more than 40 years. With advancements in microsurgery, certain new techniques have been used to improve surgical efficiency. In our lab, we have optimized the cuff technique with two major steps. First, we used the inner tube technique to insert a temporary inner tube into the external jugular vein and carotid artery blood vessel to facilitate eversion of the vessel over the cuff. Second, we performed complete heterotopic cardiac transplantation through the collaboration of two experienced surgeons. These modifications effectively reduced the operation time to 25 minutes, with a success rate of 95%. In this report, we describe these procedures in detail and provide a supplemental video. We believe that this report on the improved cuff technique will offer practical guidance for murine heterotopic heart transplantation and will enhance the utility of this mouse model for basic research.

We introduce an inner tube approach to the cuff technique for mouse cervical heterotopic heart transplantation to help evert the vessel over the cuff. We found that cooperation between two experienced surgeons markedly shortens the operation time.

マウスの心臓移植のためのカフ技術の最適化

Murine cardiac transplantation has been performed for more than 40 years. With advancements in microsurgery, certain new techniques have been used to ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to animal infections in vivo. The existing in vitro tests typically overestimate antimicrobial efficacy as the presence of host tissue as a diffusion barrier is not accounted for. To overcome this bottleneck, we have developed an ex vivo porcine corneal model of bacterial keratitis using Pseudomonas aeruginosa as a prototypic organism. This article describes the preparation of the porcine cornea and protocol for establishment of the infection. Bespoke glass molds enable straightforward setup of the cornea for infection studies. The model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue. Establishment of infection is verified as an increase in the number of colony forming units assessed via viable plate counts. The results demonstrate that infection can be established in a highly reproducible fashion in the ex vivo corneas using the method described here. The model can be extended in the future to mimic keratitis caused by microorganisms other than P. aeruginosa. The ultimate aim of the model is to investigate the effect of antimicrobial chemotherapy on the progress of bacterial infection in a scenario more representative of in vivo infections. In so doing, the model described here will reduce the use of animals for testing, improve success rates in clinical trials and ultimately enable rapid translation of novel antimicrobials to the clinic.

This article describes a step-by-step protocol to set up an ex vivo porcine model of bacterial keratitis. Pseudomonas aeruginosa is used as a prototypic organism. This innovative model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue.

細菌性角膜炎に対する薬物治療を研究するためのブタEx Vivoコルネアモデルの確立

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

胃腸管における カンジダ・アルビカンス ・ヒphphal形態形成を研究するエクスビボアッセイ

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a poor correlation between antibiotic susceptibility testing (AST) results using standard diagnostic methods (e.g., broth microdilution, disk diffusion, or Etest) and clinical outcomes after antibiotic treatment. Attempts to improve AST by the use of off-the-shelf biofilm growth platforms show little improvement in results. The limited ability of in vitro biofilm systems to mimic the physicochemical environment of the CF lung and, therefore bacterial physiology and biofilm architecture, also acts as a brake on the discovery of novel therapies for CF infection. Here, we present a protocol to perform AST of CF pathogens grown as mature, in vivo-like biofilms in an ex vivo CF lung model comprised of pig bronchiolar tissue and synthetic CF sputum (ex vivo&#160;pig lung, EVPL).
Several in vitro&#160;assays exist for biofilm susceptibility testing, using either standard laboratory medium or various formulations of synthetic CF sputum in microtiter plates. Both growth medium and biofilm substrate (polystyrene plate vs. bronchiolar tissue) are likely to affect biofilm antibiotic tolerance. We show enhanced tolerance of clinical Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus isolates in the ex vivo model; the effects of antibiotic treatment of biofilms is not correlated with the minimum inhibitory concentration (MIC) in standard microdilution assays or a sensitive/resistant classification in disk diffusion assays.
The ex vivo platform could be used for bespoke biofilm AST of patient samples and as an enhanced testing platform for potential antibiofilm agents during pharmaceutical research and development. Improving the prescription or acceleration of antibiofilm drug discovery through the use of more in vivo-like testing platforms could drastically improve health outcomes for individuals with CF, as well as reduce the costs of clinical treatment and discovery research.

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

This workflow can be used to perform antibiotic susceptibility testing using an established&#160;ex vivo model of bacterial biofilm in the lungs of individuals with cystic fibrosis. Use of this model could enhance the clinical validity of MBEC (minimal biofilm eradication concentration) assays.

嚢胞性線維症肺における 緑膿菌 および 黄色ブドウ球 菌バイオフィルムのEx生体モデルにおける抗生物質有効性試験

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a ...