我々は、走査型電子顕微鏡サンプルを処理する彼女の技術的支援のために、メリーランド大学医学部の電子顕微鏡検査施設からのHsia Ru-ching博士に感謝します。

倫理声明：動物の取り扱いに関するプロトコールは、メリーランド大学の機関動物管理および使用委員会（IACUC）（プロトコールナンバー0416009）によって承認され、AAALAC国際規格に従って実施された。 1.外科手術<ol><li> 麻酔技術 <ol><li>生存手術に使用されたすべての器具を121℃で30分間蒸気滅菌して滅菌する。 </li><li>精密気化器を介して送達された100％O 2および2.5％イソフルランを有する誘導タンクを介して麻酔を誘導する。誘導後、イソフルランを中止し、チャンバをO 2でフラッシュする。フェイスマスクを介して1.5-2％のイソフルランおよび吸入により 1L /分のO 2で麻酔を維持する。 </li><li>人員を保護するために、誘導チャンバとフェイスマスクの両方を排ガス吸着用の木炭スカベンジャーに取り付けます。デモで適切な麻酔面を確保する有害な刺激（トウピンチ）に対する反応がないことを前提としている。 </li><li>手術中に熱的サポートを提供するために等温パッドを備えた外科用トレイからなる手術野を作成する。追加の等温パッドは、回復ケージ内の動物に熱的な支持を提供する。 </li></ol></li><li> 動物の準備 <ol><li> 10〜12週齢の雄C57BL / 6マウスについて以下の調査を行う。 </li><li>動物の腹部の腹面の毛を胸骨から鼠径部に脱毛剤または40番刃の電気クリッパーで除去する。 <ol><li>除毛剤の場合、この化合物を外科領域に2〜3分間塗布し、次いでそれを綿で取り除く。市販の水酸化カルシウムと水酸化ナトリウムの化合物を使用します。 </li></ol></li><li> 70％のアルコールで肩の上の領域を準備し、25ゲージまたはより小さい穴の針を用いてcarprofen（5mg / kg）を皮下注射する。この治療は動物の術後鎮痛を提供する。 </li><li>動物を手術野に移し、背臥位に置く。 </li><li>清潔な綿アプリケータまたは綿のガーゼで8-12％のプロビドン - ヨウ素を擦って手術部位を準備する。その後、70％アルコールで皮膚を2回すすいでください。 </li><li>角膜乾燥の発生を減少させるために眼の潤滑剤を両眼に置く。手術部位を滅菌ドレープで覆う。 </li></ol></li><li> 手術技法 <ol><li>剣状突起をすぐに尾側から骨盤に向かって伸びるようにして、メスを長さ約2〜2.5cmの中央腹部開腹切開にする。 </li><li>小腸と十二指腸を動員し、横方向に右に反射する。滅菌した綿のストリップを巻き上げ、注射のために滅菌生理食塩水を浸して、臓器を包み込み、暴露を改善する。 </li><li>小腸の右側に動員された小腸腹部を切開し、後腹膜を露出させ、左腎静脈から大動脈分岐部に腹部大動脈を露出させる（ 図1 ）。 </li><li>滅菌済みのコットンチップ付きアプリケータでは、5秒間に30回の連続破砕を行います。 </li><li>パッキングを取り外し、内臓が元の位置に戻るようにします。 </li><li>実行中の4-0吸収性モノフィラメント縫合糸（ポリジオキサノン）で筋膜を閉鎖する。皮膚は、実行中の6-0非吸収性モノフィラメント縫合糸（ナイロン）で閉鎖される。 </li></ol></li><li> 回復および手技後のケア <ol><li>処置の後、等温パッド上に清潔な寝具を備えた回復ケージに動物を入れ、動物が正常に歩行できるようになるまで熱的支持を継続する。胸骨の臥位を維持する能力を証明するまで動物を放置しないでください。 </li><li>手術後最初の4時間は毎時動物を監視する。一旦動物が普通に戻ってくると、<html>割り当てられた畜舎に割り当てます。それが完全に回復するまで、動物は別の動物の会社に収容されません。 </li><li>手術後最初の72時間、その後は週に少なくとも3回、動物を毎日2回監視する。監視には、週に3回動物の体重を測定することが含まれます。 </li><li>手術後最初の72時間、carpofen（5mg / kg）を1日2回皮下投与する。 </li></ol></li></ol> 2.組織の調達<ol><li> 安楽死の方法 <ol><li>所定の時点で動物を安楽死させる。 </li><li>精密気化器を介して送達された100％O 2および2.5％イソフルランを有する誘導タンクを介して麻酔を誘導する。 <ol><li>内皮の完全性を研究するために、エバンスブルー染料を動物に投与する。 注：エバンスブルーは、アルブミンに対して高い結合親和性を有する負に帯電したアゾ染料であり、無傷の内皮の不存在下でのみ血管を染色することができるs = &quot;xref&quot;&gt; 6。 </li><li>内皮完全性試験のために、安楽死の時点で、5mLの0.3％エバンスブルー染料で5mLのPBS、続いて5mLのPBSを生理的圧力で5分間灌流する。動物は、灌流処置の間に、麻酔の外科手術平面内に維持される。 </li></ol></li><li>深い麻酔の面を達成した後、胸骨切開術で胸を開きます。右心房からの血液の排出を可能にするために右心房に裂傷を作り、左心室にアクセスし、21G針でアクセスし、右心房からの流出液が透明になるまでリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を注入する。 </li><li> PBSで灌流した後、正中線切開により腹部に入れます。 </li><li>もう一度、小腸を動かして腹部大動脈を露出させる腹部の右側に、隣接する組織から大動脈を鋭く切開し、左腎静脈から大動脈分岐部まで切除する。 </li><li>切除された大動脈を4％パラホルムアルデヒド組織処理が起こるまでの間、 <ol><li>内皮完全性試験のために、大動脈を縦に開き、管腔表面全体を露出させるワックスシートにピン止めする。エバンスブルー染料6による染色の程度によって、内皮の完全性の定性的評価を行う。 </li><li>他の組織学的検査では、大動脈を横断し、使用する組織学的方法によって決定されるように最適切断温度（OCT）化合物に埋め込む。7 。 </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis+and+arteriogenesis.">Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis.</a> Nat Med. 6 (4), 389-395 (2000).</li><li>Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+angiogenesis,+arterial+stenosis,+atherosclerosis+and+hemostasis.">Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis.</a> Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).</li><li>Baker, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparanase+Alters+Arterial+Structure,+Mechanics,+and+Repair+Following+Endovascular+Stenting+in+Mice.">Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice.</a> Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).</li><li>Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+regulating+vascular+smooth+muscle+cell+differentiation.">Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation.</a> Vascular. 17, S15-S20 (2009).</li><li>Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+disruption+and+matrix+metalloproteinase-9+expression+during+reperfusion+injury:+mechanical+versus+embolic+focal+ischemia+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats.</a> Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MARCKS+Signaling+Differentially+Regulates+Vascular+Smooth+Muscle+and+Endothelial+Cell+Proliferation+through+a+KIS-,+p27kip1-+Dependent+Mechanism.">MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism.</a> PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).</li><li>Banai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+ear+model+of+injury-induced+arterial+smooth-muscle+cell-proliferation+-+kinetics,+reproducibility,+and+implications.">Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation - kinetics, reproducibility, and implications.</a> Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).</li></ol>

この作品は退役軍人病キャリア開発賞（1IK2BX001553-01）（TSM）と血管治療EJワイリー奨学金（TSM）によって資金提供されました。

本発明者らは、内側過形成および内皮障壁機能不全を生じるマウス大動脈損傷モデルの効果を特徴付けた。大動脈内膜に沿った部分的なEC剥離は、細胞 - 細胞接触の喪失および細胞突起の増強を伴った。相応して、内皮バリア機能が有意に損なわれ、マイトジェン感受性シグナル伝達経路を刺激し、VSMCの増殖および血管壁の肥厚をもたらした。このモデルの強みは、他の大動脈モデルと比べて技術的に習得して実行することが技術的に容易であり、傷害および内皮機能に対する増殖応答の両方を同時に評価できることです。このプロトコルの重要なステップは、実際の挫傷です。圧挫傷害の程度の変動は、様々な程度の傷害をもたらし、従って、変動する量の平滑筋細胞増殖をもたらす可能性がある。私たちの研究室でこのばらつきを減らす1つのステップは、治療または実験条件が盲目になっている患者さんは、圧傷によるけがをすべて行います。 このモデルの限界は、臨床的に関連するヒト疾患プロセスに対する一般性である。このモデルでは、VSMCの初期の堅牢な増殖応答にもかかわらず、再狭窄の後期事象、すなわち新生内膜が発現しないというモデルをモデル化していない。サイトカインなどの炎症性メディエーターの減少は、このプロセスを調節する可能性がある。この発見は、部分的な損傷からの内皮の迅速な回復に起因する可能性がある。以前に報告されたウサギの血管挫傷損傷モデルと同様に、免疫細胞の浸潤は軽微であった。本研究では、プロファイラアレイを用いて偽動物および大動脈傷害動物の炎症性サイトカインのプロファイルを評価した。しかし、偽動物と傷害動物との間の増殖応答の差異を説明するサイトカインプロファイルには有意な差はなかった（データ図示せず）。本報告書に記載されている傷害は、一時的に限定されている。大動脈瘤形成および大動脈形成術モデルのような内膜過形成の他のモデルが内皮を完全に露出させるのに対して、本モデルは大動脈を部分的にしか露出させない。内皮の完全な露出は、回復するまでにかなりの時間を要し、これらの動物は、より長い期間にわたって損傷の影響を経験する。 このモデルは、1週間で形態学的および生化学的変化の定量化を可能にする損傷に対するVSMCおよびECの迅速な応答を生じる。介入の効果が明らかになるまでに14〜28日かかる他のモデルよりも効率的です。このモデルは、臨床的に関連するヒト血管に近似するネズミ血管であるネズミ大動脈を使用する。他の大動脈モデルと比較したこの技術の重要な利点は、このモデルが習得するのが比較的容易であり、高価または困難なeqを必要としないことである出荷2、3、4、5。結論として、マウス大動脈圧挫傷害モデルは、血管損傷に対するVSMCおよびECの応答を同時に評価するために、技術的に直接的で、安価で効率的なin vivoプラットフォームを提供する。

再狭窄 （バイパス手術、血管形成術、またはステント留置）後のこれらの処置の耐久性を低下させる重大な問題である。すべての血管再生手順は、再狭窄に悩まされている。再狭窄（薬物溶出ステントおよび薬物被覆バルーン）を防止するための現在の戦略は、血管平滑筋細胞（VSMC）および内皮細胞増殖（EC）の両方を阻害する。結果的に、これらの介入は、VSMC媒介性再狭窄を予防するが、内皮の再生も妨げる。損なわれていない内皮がなければ、出血合併症のリスクのある現場血栓症のリスクを低下させるために、患者は強力な抗血小板薬を必要とする。理想的な療法は、内皮の再生を促進しながらVSMCの増殖を阻害するであろう。したがって、 インビボで VSMC増殖および内皮バリア機能を同時に研究する必要がある。 現在、再狭窄のマウスモデル1 。これらのモデルには、頸動脈結紮および大腿動脈ワイヤ損傷2が含まれる 。大動脈モデルは、ステント配置3 、バルーン損傷4 、および大動脈同種移植5を含む 。現在のモデルはすべて制限されています。頸動脈結紮は、フロー媒介新生内膜病変を生じ、内皮傷害を有しない。さらに、頚動脈および大腿動脈の両方は、ヒトの血管よりも数倍少ない細胞層を有し、それらの翻訳値を制限する。直径約1.3mmのマウス大動脈は、臨床的に関連する（冠状動脈）ヒト動脈に近似する唯一の血管である（3）。 マウス大動脈モデルの翻訳能にもかかわらず、現在のモデルには限界があります。これらのモデルには、高度なマイクロサージカルスキルと、血管形成バルーンやステントなどの特殊な機器が必要です。ここでは、VSMC増殖を同時に誘導し、内皮バリア機能を破壊する新規で再現可能な技術である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Ocular lubricant</td>
			<td style="width:160px;">Dechra</td>
			<td style="width:163px;">17033-211-38</td>
			<td style="width:247px;">Pharmaceutical agents</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td>Pharmaceutical agents</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>26357</td>
			<td>Pharmaceutical agents</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Precision vaporizer</td>
			<td>Summit Medical</td>
			<td>10675</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Charcoal scavenger</td>
			<td>Bickford Inc.</td>
			<td>80120</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Isothermal pad</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>50-7053-R</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Sterile cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">4-0 absorbable monofilament suture&#160;</td>
			<td>Ethicon, Inc</td>
			<td>J310</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">5-0 non-absorbable monofilament suture</td>
			<td>Ethicon,Inc</td>
			<td>1666</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">21-gauge x 1 inch needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305165</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25-gauge x 1 inch&#160; needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305125</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry sterilizer</td>
			<td>Cellpoint&#160;</td>
			<td>7770</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>Surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Vannas Spring Scissors 3mm cutting edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td>Surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needle driver</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91201-13</td>
			<td>Surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scalpel handle #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td>Surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scalpel blades #10</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10010-00</td>
			<td>Surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Reagents for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Evans Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td>Reagents for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Reagents for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Modeling wax</td>
			<td>Bego</td>
			<td>40001</td>
			<td>Reagents for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OCT compound</td>
			<td>Tissue-Tek Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Reagents for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mayer&#39;s hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MHS16</td>
			<td>Reagents for immunohistological analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin Y solution alcoholic&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110316</td>
			<td>Reagents for immunohistological analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Elastin stain kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">HT25A</td>
			<td>Reagents for immunohistological analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>Reagents for immunohistological analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Anti-Erk1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4695</td>
			<td>Reagents for immunohistological analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Anti-phospho-Erk1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
			<td>Reagents for immunohistological analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Anti-p27kip1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3698</td>
			<td>Reagents for immunohistological analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9159</td>
			<td>Reagents for immunohistological analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine aortic crush injury: an efficient in vivo model of smooth muscle cell proliferation and endothelial function

血管形成術かバイパス手術かにかかわらず、動脈再構築は、内皮破壊および血管平滑筋細胞（VSMC）増殖を引き起こす医原性外傷を伴う。一般的なマウスモデルは、頸動脈および大腿動脈などの小型血管を研究する。本明細書では、VSMC増殖および内皮バリア機能の両方を大きな血管において同時に評価することができるin vivoシステムを記載する。我々は、C57BL / 6マウスの損傷に対する腎臓下大動脈反応を研究した。大動脈は、左腎静脈から大動脈分岐部に損傷を受け、コットン先端のアプリケータを用いて5秒間30回の経壁破砕を行った。形態学的変化は、従来の組織学を用いて評価した。大動脈壁の厚さを内腔表面から外膜まで測定した。 VSMCの増殖を実証するために、DAPIおよびα-アクチンによるEdUの統合および対比染色を用いた。内膜肥厚形成の既知のモデレーターであるERK1 / 2の活性化が抑制されたウエスタンブロット分析によって採取した。炎症の影響は、B細胞、T細胞、およびマクロファージの免疫組織化学によって決定した。内皮のEnフェイス切片を走査型電子顕微鏡（SEM）で視覚化した。 Evans Blue染色で内皮バリア機能を測定した。経壁損傷により大動脈壁が肥厚した。この損傷はVSMC増殖を誘発し、損傷後3日目に最も顕著であり、ERK1 / 2の早期活性化およびp27 kip1発現の減少を引き起こした。傷害は、B細胞、T細胞、または血管壁におけるマクロファージの浸潤を増加させなかった。傷害は部分的な内皮細胞の脱落および細胞 - 細胞接触の喪失を引き起こした。傷害は、内皮バリア機能の有意な喪失をもたらし、これは7日間後にベースラインに戻った。マウス経壁鈍的大動脈傷害モデルは、大血管におけるVSMC増殖および内皮バリア機能の両方を同時に研究するための効率的なシステムを提供する。

OCTに埋め込まれた横断切片の大動脈を切開し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、次いでVerhoeff-Van Gieson（VVG）染色でカウンター染色し、内外の弾性薄層7を同定した。クラッシュ損傷は、偽手術（開腹術および小腸の動員のみ）で処置した動物の大動脈と比較して、大動脈壁の肥厚を誘導した。外膜から内腔までの距離によって評価した壁の厚さは、損傷の3日後に最大​​であった（42.2±1.7μm対開腹術のみについて22.1±1.1μm）（ 図 2A〜B）。傷害は、より丸みのある外観および内腔表面の不規則な輪郭を有する細胞を生じた（ 図2C ）。 損傷を受けた大動脈の壁の肥厚の増加は、少なくとも部分的には、内側血管平滑筋の増殖の増加によって媒介される細胞を洗浄する。壁肥厚が細胞肥大とは対照的に増殖の増加によるものであることを証明するために、我々はEdU増殖アッセイを使用した。このアッセイでは、チミジン類似体5-エチニル-2&#39;-デオキシウリジン（EdU）を安楽死の24時間前にマウスに静脈内投与する。 EdUは合成中にDNAに組み込まれる。 EdUは、クリック反応（緑色蛍光色素を用いた銅触媒アジド - アルキン付加環化） 8によって検出される。開腹手術のみに曝露された偽マウスは、大動脈のいずれの層においても蛍光が観察されなかった。 Conversley、大動脈傷害を受けたマウスは、大動脈の培地および内膜の両方において蛍光を示した（ 図3 ）。 圧挫損傷後の大動脈壁の肥厚は、ヒトにおける再狭窄に関与する細胞シグナル伝達経路を活性化する。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPキナーゼ）ERK1 / 2は、内膜肥厚形成の主要メディエーターの1つであるマイトジェンからの刺激に応答して、ERK1 / 2はリン酸化され、活性化される9,10 。我々の研究室のデータは、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤p27 kip1が血管壁12の分裂促進刺激に応答して減少することも実証している。大動脈圧挫傷害後1、3、7日、および1ヵ月目にマウスを安楽死させた。腎下部大動脈を単離し、ERK1 / 2、ホスホ-ERK1 / 2（ERK1 / 2の活性化形態）、およびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤p27 kip1のタンパク質発現をウエスタンブロット分析（ 図4A ）によって決定した。経時的なERK1 / 2タンパク質発現の変化は観察されなかった。しかし、損傷の3日後、リン酸化-ERK1 / 2（Pi-ERK1 / 2）発現は、ベースラインPi-ERK1 / 2発現よりも200％以上大きかった。 p27 kip1の発現は早期の時点で減少し、7日後のベースラインの約20％の最低値に達した傷害。 Pi-ERK1 / 2およびp27 kip1の両方の発現は、損傷の1ヶ月後にベースラインレベルに近似した（ 図4B ）。従って、観察された大動脈壁の肥厚は、少なくとも部分的には内方増殖の増加によるものである。 大動脈損傷モデルは、内側平滑筋増殖および内皮バリア機能の両方の同時評価を可能にする。走査型電子顕微鏡（SEM）を使用して、内皮の形態に対する圧挫損傷の効果を特徴付けた。大動脈の内腔表面には、血液由来の細胞と分子の接着を妨げるコンフルエントな内皮が並んでいる（ 図5A 、スケールバー=100μm）。対照的に、圧挫による損傷は、内皮細胞の破壊および内皮の部分脱落をもたらす（ 図5B 、スケールバー=100μm）。より高い倍率で見られるように、内皮の破壊は、接着血小板と大きさおよび形状が一致する粒子の付着。これらの粒子の付着は損傷の全領域に亘って起こり、より低い倍率で観察される肉眼的露出の領域に限定されない（ 図5C 、スケールバー=50μm）。付着した粒子の形態は、より高い倍率で最もよく観察される。これらの粒子は、血小板およびフィブリンと一致する（ 図5D 、スケールバー=10μm）。 内皮形態に加えて、血管損傷のこのモデルを用いて、内皮のバリア機能を評価することができる。アゾ染料エバンスブルーは、ネズミ大動脈の正常で無傷の内皮を透過することができない。内皮のバリア機能への損傷は、エバンスブルーによる基底膜の染色を可能にする。開腹手術単独（偽）に治療したマウスは、内皮のバリア機能を維持し、これらの大動脈は白色であった。クラッシュの負傷により内皮障壁機能のびまん性喪失およびこれらの大動脈は暗青色に染色された。エバンスブルーによる染色の強さは、圧挫による損傷の3日後に減少し、完全なバリア機能は、損傷後1週間で回復した（ 図6A ）。内皮バリア機能は、試料を秤量し、10倍容量の50％トリクロロ酢酸溶液中でホモジナイズすることによって、さらに定量することができる。上清を4倍エタノールで希釈することにより、青木ら（ Aoki et al 。）によって記載されているように、蛍光強度（励起620nmおよび発光680nm）の測定が可能になる。 11 。腎下部大動脈から溶出されたエバンスブルーの量は、開腹術のみに供された大動脈と比較して、損傷直後の大動脈において3倍以上高かった（傷害 - 0日目）。大動脈は、損傷後1日および3日でEvans Blueで染色され続けたが、損傷時よりも集中力が弱く、内皮バリア機能が徐々に回復することが示唆された。 1週間後傷害を受けた大動脈は、開腹術のみで処置した大動脈と同等の染色を有した（ 図6B ）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55201/55201fig1.jpg" /> 図1：左腎腎から大動脈分岐部までの大動脈を大胆に粉砕することにより傷害が生じる。 Yu et al 。、 PLoS One 2015 12の許可を受けた図 。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55201/55201fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55201/55201fig2.jpg" /> 図2：圧迫傷害は大動脈壁の肥厚を誘発する。 （ A ）大臼歯の圧挫による形態的変化が誘発された。代表的な5μmの断面を0でVVGで染色し、損傷の1日後、3日後および7日後に、スケールバー=100μm。 （ B ）壁厚は、損傷後3日で最大で42.2±1.7μmであり、開腹術のみに暴露された偽動物の大動脈よりも有意に大きかった（22.1±1.1μm）。統計学的有意性は、スチューデントの2テールt検定を用いて決定した。 （ C ）クラッシュ損傷は、内側VSMC（α平滑筋アクチンについては緑色で染色）および細胞配向を変化させる丸い外観を誘発した（p &lt;0.05、n = 3）。核はDAPI（青色）で対比染色した。スケールバー=10μm。データは、平均および標準偏差として提示される。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55201/55201fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55201/55201fig3.jpg" /> 図3：クラッシュの傷害は細胞の生命を誘導する大動脈壁の分泌物。マウスを開腹術単独（偽）または大動脈圧挫傷害を伴う開腹術のいずれかに曝露した。チミジン類似体5-エチニル-2&#39;-デオキシウリジン（EdU）を安楽死の24時間前に投与した。 EdUは合成中にDNAに組み込まれる。 EdUは、クリック反応（緑色蛍光色素を用いた銅触媒アジド - アルキン付加環化反応）によって検出される。偽動物の大動脈壁には検出可能なEdU（緑色）は検出されなかった。圧挫傷害を受けた動物では、EdUは大動脈の媒体中で著しく染色され、内膜内では幾分程度は染色された。血管平滑筋細胞を、α平滑筋アクチン抗体（赤色）で染色することによって同定した。この所見は、図2で観察された観察された壁の肥厚が細胞増殖の増加によるものであることを示唆している。スケールバー=10μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55201/55201fig3large.jpg" target="_blank">このfigurのより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください</a>e。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55201/55201fig4.jpg" /> 図4：分裂傷害に応答してマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPキナーゼ）経路が活性化される。 （ A ）MAPキナーゼERK1 / 2は、活性化されるとリン酸化され、内膜肥厚および再狭窄と関連する。大動脈圧挫傷害後1、3、7日、および1ヵ月目にマウスを安楽死させた。ウェスタンブロット分析を用いて、総ERK1 / 2、ホスホ-ERK1 / 2、およびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤p27 kip1のタンパク質発現を評価した。タンパク質発現は開腹術のみで処置した偽動物に対して標準化した。 （ B ）経時的なERK1 / 2タンパク質の総発現に変化は認められなかった。しかし、損傷の3日後、リン酸化-ERK1 / 2（Pi-ERK1 / 2）発現は、ベースラインPi-ERK1 / 2発現よりも200％以上大きかった。 p27 kip1発現は、早い時点で減少し、dは損傷後7日目のベースラインの約20％の最低値に達した。 Pi-ERK1 / 2およびp27 kip1の両方の発現は、損傷の1ヶ月後のベースラインレベルに近似した。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55201/55201fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55201/55201fig5.jpg" /> 図5.圧挫傷害は、大動脈内皮細胞を破壊する。 （ A ）走査型電子顕微鏡（SEM）を使用して、内皮の形態に対する圧挫損傷の効果を特徴づけた。正常大動脈の内腔表面には、血液由来の細胞および分子の接着を防ぐコンフルエントな内皮が並んでいる。 （ B ）圧挫による損傷は、内皮細胞の破壊および内皮の部分的露出をもたらす。 （ C ）より高いmagnificaで見られるように内皮の破壊は、血小板とサイズおよび形状が一致する粒子の接着をもたらす。これらの粒子の付着は、損傷部位全体にわたって起こり、より低い倍率で観察される肉眼的露出の領域に限定されない。 （ D ）より高い倍率では、これらの粒子は血小板およびフィブリンと一致する。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55201/55201fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55201/55201fig6.jpg" /> 図6：鈍的大動脈傷害は、内皮バリア機能の定量化を可能にする。 （ A ）内皮のバリア機能の損傷は、エバンスブルー色素で基底膜を染色することを可能にする。開腹手術単独で処置したマウス（偽）は、内皮のバリア機能を維持し、大動脈は白い。圧挫による傷害は、内皮バリア機能の散漫な喪失をもたらし、これらの大動脈は濃い青色に染色された。エバンスブルーによる染色の強さは、圧挫による損傷の3日後に減少し、完全なバリア機能は損傷後1週間で回復した。 （ B ）エバンスブルーの腎下部大動脈への結合を、検体からのエバンスブルーの溶出および蛍光強度による定量によって定量した。データは、平均および標準偏差として提示される。ほとんどのエバンスブルーは圧挫傷害の直後に大動脈から溶出した。傷害の時点で、大動脈は開腹手術単独にかけられた大動脈よりも3倍以上のエバンスブルーに拘束された。大動脈が回復するにつれて、損傷後1〜3日で拘束力が弱くなった。傷害の1週間後、大動脈はエバンスブルーと同量の腹水を、開腹手術単独で施行された大動脈と結合した。統計学的有意性は、スチューデントの2テールt検定を用いて決定した。 * deノートp &lt;0.05、n = 3、NSは有意でないことを示す。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55201/55201fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

心血管手術（バイパス手術、血管形成術、またはステント留置）後の再狭窄は、これらの処置の耐久性を低下させる重大な問題である。理想的な療法は、平滑筋細胞（VSMC）の増殖を阻害し、内皮の再生を促進する。インビボでのVSMC増殖および内皮機能の同時評価のためのモデルを記載する。

ネズミ大動脈挫傷：効率的<em&gt;インビボ</em&gt;平滑筋細胞の増殖と内皮機​​能のモデル

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

8.3K ビュー.  Baltimore Veterans Affairs Medical Center. 心血管手術（バイパス手術、血管形成術、またはステント留置）後の再狭窄は、これらの処置の耐久性を低下させる重大な問題である。理想的な療法は、平滑筋細胞（VSMC）の増殖を阻害し、内皮の再生を促進する。インビボでのVSMC増殖および内皮機能の同時評価のためのモデルを記載する。 

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Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

焦点のCa 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

生物学

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

パッチクランプ電気生理学および圧力筋運動記録法を用いた動脈平滑筋KV7カリウムチャネル機能を探る

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

長指伸筋の筋機能の評価<em&gt;エクスビボ</em&gt;と前脛骨筋<em&gt;その場</em&gt;マウスの

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

薬理研究に単離された組織のバース·アプリケーションにおける平滑筋機能の測定

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

細胞内カルシウムの二光子イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;取扱い及び内皮における一酸化窒素産生および単離されたラット大動脈の平滑筋細胞

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

マウス冠動脈血管平滑筋細胞の単離

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

クリック化学を用いた血管平滑筋細胞の増殖測定

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

In vivo Measurement of Knee Extensor Muscle Function in Mice

Skeletal muscle plasticity in response to countless conditions and stimuli mediates concurrent functional adaptation, both negative and positive. In the clinic and the research laboratory, maximal muscular strength is widely measured longitudinally in humans, with knee extensor musculature the most reported functional outcome. Pathology of the knee extensor muscle complex is well documented in aging, orthopedic injury, disease, and disuse; knee extensor strength is closely related to functional capacity and injury risk, underscoring the importance of reliable measurement of knee extensor strength. Repeatable, in vivo assessment of knee extensor strength in pre-clinical rodent studies offers valuable functional endpoints for studies exploring osteoarthritis or knee injury. We report an in vivo and non-invasive protocol to repeatedly measure isometric peak tetanic torque of the knee extensors in mice across time. We demonstrate consistency using this novel method to measure knee extensor strength with repeated assessment in multiple mice producing similar results.

Quantification of knee extensor maximal strength is imperative to understand functional adaptations to aging, disease, injury, and rehabilitation. We present a novel method to repeatedly measure in vivo knee extension isometric peak tetanic torque.

マウスにおける膝伸張筋機能のインビボ測定

Skeletal muscle plasticity in response to countless conditions and stimuli mediates concurrent functional adaptation, both negative and positive. In the ...

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in the aorta and regulates vasoconstriction and vasodilation. Mutations in genes encoding for the SMC contractile apparatus proteins are associated with aortic diseases, such as thoracic aortic aneurysms. Measuring SMC contraction in vitro is challenging, especially in a high-throughput manner, which is essential for screening patient material. Currently available methods are not suitable for this purpose. This paper presents a novel method based on electric cell-substrate impedance sensing (ECIS). First, an explant protocol is described to isolate patient-specific human primary SMCs from aortic biopsies and patient-specific human primary dermal fibroblasts for the study of aortic aneurysms. Next, a detailed description of a new contraction method is given to measure the contractile response of these cells, including the subsequent analysis and suggestion for comparing different groups. This method can be used to study the contraction of adherent cells in the context of translational (cardiovascular) studies and patient and drug screening studies.

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

This paper describes an explant culture-based method for the isolation and culturing of primary, patient-specific human aortic smooth muscle cells and dermal fibroblasts. Furthermore, a novel method is presented for measuring cell contraction and subsequent analysis, which can be used to study patient-specific differences in these cells.

原発性患者特異的大動脈平滑筋細胞の単離とインビトロでの半定量的リアルタイム収縮測定

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...