Nina Nagel is gratefully acknowledged for technical assistance during the video shoot and experimental preparation. We thank Eva-Maria Weiss for help with the intracellular FOXP3 staining protocol and Elisabeth Suri-Payer and Nina Oberle for establishing the nTreg isolation protocol. Matilda Eriksson and Peri Noori are acknowledged for laboratory management. 
Funding: A.S. was supported by a Marie Curie Intra European Fellowship within the 7th European Community Framework Programme, the Dr. &#197;ke Olsson Foundation and KI research foundations; A.S. and J.T. were supported by a CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease) grant, J.T. was supported by Vetenskapsr&#229;det Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Torsten S&#246;derberg Foundation, FP7 STATegra, AFA Insurance and Stockholm County Council.

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The authors have nothing to disclose.

記載されているプロトコルは、人間のナイーブCD4 + T細胞からのヒトCD4 + FOXP3 + iTregsの堅牢な誘導を可能にします。それは我々が優れたin vitroでの抑制機能22とiTregsの誘導のために、TGF-β、ATRA及びラパマイシンの組み合わせを使用して、最近記載新しいプロトコルが含まれています。他の公表されたプロトコルに比べ、他の利点は、単独で、IL-2の存在下で活性化されたコントロール細胞と一緒に、特定のiTreg誘導因子の効果の直接比較を可能にする、異なるプロトコルによって並列に異なるiTreg集団の誘導であります。記載されているプロトコルは、低ドナー変動とFOXP3の再現可能な誘導を可能にします。このプロトコルでのナイーブCD4 + T細胞を、磁気活性化細胞選別により単離したが、蛍光活性化細胞選別も可能であるしています。このプロトコルにナイーブCD4 + T細胞の予想収量は、典型的には5〜10％の間であります<html>しかし、強くドナー（年齢）に依存し、赤血球の高い画分が存在する場合にも、下に表示されます。推定値が必要な場合は、PBMCを単球枯渇工程の間（ステップ1.4参照）を染色することができます。典型的には、ナイーブCD4 + T細胞の収量は、PBMCの染色における「リンパ球ゲートのパーセンテージナイーブCD4 + T細胞」の約半分です。このプロトコルは、CD25-高（nTreg）のセル29を得るために、CD25ビーズの限られた量を使用しています。しかし、これらは、純粋のTregはないが、これらは単に正の対照として使用するためのTregに富んでいます。純粋のTregが必要な場合は、他のキットは、（例えばCD4濃縮およびCD127-枯渇と組み合わせるように）使用されるべきであるか、あるいは、CD25 +細胞は、10 7個の細胞当たり8μlのCD25ビーズで事前に富むと染色し、蛍光活性化細胞によってソート厳しいCD4 + CD25 ++ゲーティングで並べ替え。また、そのようなCD127の除外などの他のマーカーの包含は、考慮すべきです。 _contentは&quot;&gt; FOXP3を考慮することが重要であるiTregsは、特定の局面を研究するために使用することができるが。Tregのアイデンティティ30を付与するのに十分必要ではなく、例えば、FOXP3調節は、それがiTregsがnTregs異なることに留意することが重要ですnTregsとiTregsとの差をnTregとiTregトランスクリプトームの一部のみの重なりが例示されるいくつかの側面で。それは比較のために、全てのアッセイでiTregsに平行に（理想的には同じドナー由来）培養nTregsすることが重要である。中で測定しましたマウスiTregs 31。FOXP3に加えて他のTregシグネチャー遺伝子は、この理由のために測定されるべきであり、ヒト細胞における活性化誘導FOXP3発現からの識別を確実にするために、例えば、iTregsはCD25の高い発現を表示する必要があり、CTLA-4およびEOS比較します活性化T細胞に以前に公開されたように、IFN-γおよびSATB1の発現は、ここに記載されているプロトコルによって誘発されるnTregsとiTregsに低くあるべきである一方で<suP&gt; 22。 nTregsとiTregs間のもう一つの重要な大きな違いは、最も可能性の高いiTregs 13におけるFOXP3遺伝子座にTSDR領域のメチル化に対応iTregsで安定FOXP3発現の欠如、です。また、ゲノムワイドスケールで、それはネズミiTregsにおけるDNAメチル化とヒストン修飾のエピジェネティックなパターンがnTregs 30で見つかったパターンを反映していないことを説明しました。我々は以前nTregsとは対照的に、ここに記載されたプロトコルによって誘導されiTregsは、TSDR脱メチル化を示さなかったことを説明しました。したがって、iTregsは再刺激したときにFOXP3を失ったが、IL-2の再刺激22なしの存在下でさらに培養Foxp3発現を維持しました。興味深いことに、M2マクロファージ上清を用いて、代替プロトコルによって誘発されるiTregsはTSDR脱メチル化の欠如およびFoxp3誘発27のためのTGF-βであることの原因にもかかわらず、強化されたFOXP3安定性を示しました。 iTregの変更テン-11転座（TET）メチルジオキシゲナーゼ酵素に影響を与える（例えばビタミンCや硫化水素など）の化合物を添加することによってプロトコルを-inducing、ごく最近32記載されているように- 34を 、DNAメチル化に影響を与えることによってFOXP3の安定化を追加することができます。また、刺激強度およびタイミングは、FOXP3発現および安定性35に影響を与えます。これらの線に沿って、代わりに、プレートに結合した抗体のビーズ結合CD3 / CD28抗体の使用は、TSDR脱メチル化36の独立したにもかかわらず、マウスiTreg インビボ抑制機能および安定性を増加させることが示されました。変動の潜在的な供給源として考慮される必要がある別の要因も、ウシ供給源からヒト細胞と100％の交差反応性であるTGF-βを含む未定義の因子を含有する血清の使用です。また、IL-2の供給源と活性が大幅にFOXP3誘導の結果に影響を与えることができます。 重要なFTregのeatureは、このプロトコルで生成iTregsに続いてテストする必要がありますそれらの抑制能力、です。 iTregsと抑制アッセイは些細なことではないことに留意すべきであるとiTregsの抑制能力に関する文献は議論の余地があります。このようなカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）の希釈などのフローサイトメトリーの読み出しに基づいてin vitroでの増殖アッセイは、最も一般的に使用されると、41 -人間のTregの抑制機能を評価するためのいくつかの方法およびプロトコルは、他の場所22,37を発表されています。洗浄および抑制アッセイで使用する前にiTregsを置くことが重要であり、それはiTregsは、nTregsとは対照的に、アネルギー性ではないかもしれないが、抑制アッセイの間に自分自身を増殖することを考慮する必要があります。我々は、CTLA-4の発現、IL-2は消耗品を通るように（それが `mock&#39;を使用することが非常に重要な非特異的抑制の程度を識別するために、制御サプレッサー細胞としてT細胞を刺激した検討します活性化T細胞によるptionおよび培養の異常増殖）FOXP3 + Treg細胞特異的効果とは無関係であり、この制御の頻繁な欠如は文献にいくつかの論争に寄与することができます。このコントロールを使用して、我々は唯一のTGF-β/ ATRA /ラパ誘発性iTregsがインビトロ 22 で抑制活性を示すことを定義しました。したがって、我々は（FOXP3 +細胞のない最高の端数はあるが）そのに関する抑制活性を締結、TGF-β/ ATRA /ラパはiTregsを誘導する記載されているプロトコルの要因の最適な組み合わせです。それにもかかわらず、in vitroでの抑制活性は、必ずしもin vivoでの抑制活性を反映していない、と確かに我々は、これらのプロトコルによって生成された人間iTregsは少なくとも22を試験した条件の下での異種移植片対 -host疾患モデルでは抑制されなかったと判断しました。これはTSDR脱メチル化22の欠如と一致して、再刺激の際にiTregsで失われた不安定Foxp3発現に関連している可能性があり</SUP&gt;。 これはiTregの機能の側面に応じて（FOXP3 +細胞の割合が高い、優れた抑制活性、FOXP3安定性）は、特定の研究課題のために最も重要であり、異なるプロトコルは、それが困難な一般的に「ベストを定義するには、レンダリング、これらの質問を勉強するのが最も適切ですTregの誘導のための」プロトコル。また、いくつかの上記の微妙な実験の違いが結果に影響を与えることができ、さらにはiTreg世代42のため、明らかに同様のプロトコルを使用したレポートの間に表示されるTGF-βによって誘導されるiTregsの表現型と抑制機能に関して論争に寄与することができます。例えば、一つでも実験室の中、我々はで生成TGF-β/ IL-2誘導iTregsながら、血清を含むRPMI培地中でTGF-βおよびIL-2で誘導iTregsは、いくつかの抑制活性は、細胞27を制御するために比較表示することが観察され定義された、無血清のT細胞培養培地D、22なかったですFOXP3の同様のレベルをespite。 これらのプロトコルに基づいて将来のアプリケーションは、さらに、サイトカイン産生エフェクターT細胞と最適な抑制活性に変換することなく、安定したFoxp3発現、TSDR脱メチル化、安定した表現型と表現型を達成するためのTregの誘導条件を最適化するために努力すべきです。 iTreg誘導プロトコルのさらなる開発は、養子移入のために有用である可能性のTreg転送による治療は、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療の可能性のために非常に有望である、将来的に近づきます。

CD4 + CD25 + FOXP3 +調節性T細胞（Tregは）他の免疫細胞を抑制し、末梢寛容の重要なメディエーターであり、自己免疫及び過度の炎症1を防止します 。 Tregの重要性は、重度の全身性の自己免疫疾患につながるTregの損失による `master&#39;のTreg転写因子フォークヘッドボックスP3における変異にヒトの疾患immunodysregulationの多発性内分泌腺の腸のX連鎖症候群（IPEX）、（FOXP3）が例示されます早い年齢で致死。しかし、Tregは、彼らはまた、特定の設定2での抗腫瘍免疫を妨げることができますように免疫系における両刃の剣として作用します。 Treg細胞の数および機能の治療的操作は、したがって、多数の臨床研究の対象です。癌では、Tregの枯渇が望ましい可能性があると臨床的アプローチのいくつかの成功は、さらなる研究3を奨励しています。自己免疫および炎症性疾患において、セベにおけるTregの治療効果に加えてRALマウス疾患モデル、-host病（GVHD）4 対移植片を防ぐために、養子のTreg転送の最近の最初の人の試験- 7と1型糖尿病8は非常に有望な結果を示した治療の安全性を評価すること。 11 -当然のTreg（nTregs）を発生することは健康に9を維持する上で非冗長本質的な機能で、胸腺由来tTregsおよび末梢誘導さpTregsを備えます。しかし、nTreg番号は、ナイーブT細胞前駆体12からのin vitroで誘導したTreg（iTregs）の補完的なアプローチを奨励し、限られています。まだiTregsの安定性は、おそらくFOXP3遺伝子座13におけるいわゆるTreg細胞に特異的脱メチル化領域（TSDR）における脱メチル化の欠如のため、懸念のままであり、いくつかの研究は、 生体内でのTregを誘導することを示している14以上の安定しています。 現在までに、FOXP3は、最良のタンパク質メートルのままTregのためのarker人間従来のCD4 + CD25-T細胞は一過性の活性化15,16時FOXP3の中間レベルで発現するので、それは絶対に固有のものではありません。重要な進歩は、FOXP3発現の調節を明らかにしたが、多くは、特にヒト細胞におけるFOXP3の誘導、安定性及び機能に関する発見されていません。 nTregsの違いにもかかわらず、in vitroでの FOXP3誘導さ+ CD4 + T細胞はFoxp3誘発の分子機構を研究するためのモデル系として使用することができ、 中に、より類似しているiTregsの生成を可能にする将来のプロトコルを開発するための出発点として将来的に養子移入戦略の適用可能性が生成されたTregを、 生体内 。 そこに人間iTregsを誘導する全く`金standard&#39;プロトコルはなく、現在のプロトコルは、 生体内でのTreg誘導条件を模倣することに基づいて開発されている：2（IL-2、インターロイキン）およびトランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）シグナル伝達は、 インビボ 17 における Foxp3誘発のために重要であり、全トランスレチノイン酸（ATRA） -腸管関連樹状細胞によってインビボで産生される-頻繁Foxp3誘発を増強するために使用されます21 - 試験管 18インチ我々は、酪酸22、最近マウスのTreg誘導23,24を増強することが示された腸内細菌叢由来の短鎖脂肪酸を使用して、追加のヒトTregの誘導プロトコールを開発しました。我々はまた、最近、それが促進することが知られている阻害剤、後者はラパマイシン（mTORの）の臨床的に承認された哺乳類の対象となる、TGF-β、ATRAの組み合わせを使用し、22ラパマイシン することにより、in vitroでの優れた抑制機能付きiTregsの世代のための新しいプロトコルを確立しました人間のTreg拡張25,26の間にFOXP3のメンテナンス。 この方法は、再現性の中での説明しますFOXP3の発現のプロトコル固有のパターンや、その他のTreg署名分子を明らかにするために、フローサイトメトリーおよび定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）により、異なる条件のセット、およびその後続の表現型を用いて、ヒトCD4 + FOXP3 + iTregsのインビトロでの生成CD25、CTLA-4、EOS、ならびにIFN-γおよびSATB1 式 22の抑制など。生成された細胞集団は、一般的なFOXP3レギュレータに関するあるいは酪酸またはラパマイシンなどの特定の化合物に特有の効果を研究するか、抑制活性に関する機能アッセイまたは分子的研究のために使用することができます。 Treg細胞の分化を駆動する分子メカニズムのさらなる理解は、具体的Treg細胞の発生と機能に関与する分子を標的とする自己免疫または癌における今後の治療的アプローチのために非常に関連性があります。

<table><tbody><tr><td>All-trans retinoic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50MG&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD25 microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD28 antibody, LEAF Purified&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RA, FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RO PE clone UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743</td><td></td></tr><tr><td>anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k</td><td>eBioscience</td><td>11-7319-81&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>Density centrifugation medium: Ficoll-Paque</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 99.7%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, heat inactivated</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye, eFluor 780&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14 or 65-0865-18&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 Staining Buffer Set</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Caution: contains paraformaldehyde. Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set</td></tr><tr><td>GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>human naive CD4 T cell isolation kit II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>Human serum albumin 50 g/L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin from Streptomyces conglobatus &gt;98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS-columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr><tr><td>mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 &amp;#956;g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet plastic, individually packed</td><td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>EMD (Merck)</td><td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-2, CF</td><td>R&amp;amp;D</td><td>202-IL-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TGF-beta 1, CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>72400-054&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium butyrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887-250MG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182; assay ID: Hs01085834_m1</td><td>Caution: contains paraformaldehyde</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351370; assay ID: Hs04194366_g1&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Caution: contains paraformaldehyde</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369514</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro differentiation of human cd4+foxp3+ induced regulatory t cells (itregs) from na&#239;ve cd4+ t cells using a tgf-&#946;-containing protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

図1は、実験のスキームを示します。 図2は、磁気的に分離されたナイーブCD4 + T細胞およびnTregsのための代表的な純度制御染色を示します。 Fのigure 3Aはゲート戦略フローサイトメトリーを示し、 図3Bは 、代表FOXP3及びCD25が示さiTregまたは制御条件下での培養6日目に染色フローサイトメトリーを示しています。 in vitroでの刺激を受けると、ほとんどの細胞は、ラパマイシンの存在下で還元されたCD25をアップレギュレートします。唯一のiTreg誘導因子の添加下で、FOXP3 +細胞の明確な集団はまた、iTregの条件の下でCD25 +細胞内に濃縮されている、明らかになります。 図3Cは、暗いクラスタとして見られる増殖細胞と顕微鏡でiTreg培養物の表現型の外観を示しています。各I<html> Tregの条件は、細胞増殖の特異的かつ再現可能なパターンを示している：これらの培養条件下では、TGF-βは、わずかに増殖を増加させ、ATRAはさらなる増殖を増加させます。同時に、ラパマイシンによる増殖の阻害が著しく減少クラスタサイズによって明らかです。増殖力の微視的な外観はまた、全細胞数に相当する（データは含まれません）。 定量RT-PCRの図4のディスプレイ代表的な結果は、iTreg（およびコントロール）におけるFOXP3 mRNA誘導の異なる時点での文化の分析します。 FOXP3タンパク質としては、FOXP3 mRNA発現はラパマイシン処置iTregsが他iTregsに比べて相対的に低いレベルを有すると、刺激された細胞をコントロールと比較して、すべてのiTregsが高いです。 nTregsにおけるFOXP3 mRNAはiTregsに比べて高くなっています。 エス/ ftp_upload / 55015 / 55015fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：実験iTreg誘導のためのスキーム、nTreg分離、およびTregの分析。ヒトナイーブCD4 + T細胞をバフィーコートから単離し、抗CD3および抗CD28抗体を加えた100 U / mlのIL-2のための6日まで、いずれかの非存在下での（ `モック対照細胞を無血清培地中で刺激しました&#39;）または異なるTregの誘導因子の存在を示すように（ `iTreg&#39;）。 nTregsを単離し、並行してアッセイされています。表現型分析をフローサイトメトリー及び定量RT-PCRによって行うことができます。シュミット、A. らから変更。 2016年22。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55015/55015fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55015/55015fig2.jpg" /> 図2：集団を開始する細胞の純度。ナイーブ人間CD<html> 4 + T細胞は、ナイーブCD4 + T細胞単離キットII、人間によって単離しました。上のパネル：ナイーブCD4 + T細胞の純度、CD4、CD45RAおよびCD45ROに基づいて、94〜98％であり、30以上の代表的なドナーのための純度は（ `Tnaïve&#39;）に示されています。 ex vivoでのTreg（ `nTreg&#39;）CD25マイクロビーズの制限された量を用いて単離し、iTreg実験の陽性対照として使用しました。 CD25とCD4に基づいて、代表的なドナーのnTreg純度が示されています。下のパネル：細胞内FOXP3染色は、（ 図3のように行い、生CD4 +細胞上に予めゲーティング）は、上部パネルと同一のドナーからの細胞を用いて、それぞれナイーブCD4 + T細胞およびnTregsのために示されています。シュミット、A. らから変更。 2016年22。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55015/55015fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ntent「FO：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt; <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55015/55015fig3.jpg" /> 図3：iTregsとnTregsの表現型の外観。ヒトナイーブCD4 + T細胞を、示された条件下で、無血清培地中で培養しました。 T細胞を抗CD3および抗CD28抗体を加えた100 U / mlのIL-2（ `Stim.&#39;）で刺激しました。示された場合には、TGF-β1（ `TGF&#39;）、ラパマイシン（` Rapa&#39;）、オールトランスレチノイン酸（ `ATRA&#39;）または酪酸を添加しました。 nTregs（ex vivoで単離された末梢血CD25 ++細胞）は非刺激（ `unstim.&#39;）左及び陽性対照として使用しました。刺激されていないナイーブT細胞を陰性対照として使用しました。 （A）培養の6日目に、細胞を抗CD25及び抗CD4含む表面抗体、次いで固定可能生存性色素で染色し、続いて、固定/透過処理し、抗FOXP3および抗CTLA-4またはアイソタイプにより細胞内染色で染色しました続き<html> ROL抗体。取得及び補償は、サイトメーターシアンADPフローに対して実行し、データをFlowJoソフトソフトウェアで分析しました。ゲーティング戦略は、赤い矢印で示され、図示の例では、TGF + ATRAで誘導iTregのサンプルです。 （B）細胞は（A）のように染色し、異なるプロトコルにより誘発される対照T細胞とiTregsにおけるFOXP3及びCD25の発現を示します。擬似カラープロットは、（A）のようにCD4 +細胞を生き、一人のドナー、一重に事前にゲーティングのための代表的なFOXP3及びCD25染色を示します。アイソタイプ例はiTreg（STIM。+ TGF + ATRA）のサンプルのために示されています。 4日間培養した細胞の個々の96U-プレートウェルの（C）代表顕微鏡画像（40X倍率）。細胞のダーククラスターは、増殖細胞を表します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55015/55015fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ntent「FO：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55015/55015fig4.jpg" /> 図4：iTregの分化のための異なるプロトコルの使用時にFOXP3 mRNA発現。 iTregsを示す条件下で、図3のように生成し、所定の時点で、細胞試料を採取し、RNAを抽出しました。刺激されていないナイーブT細胞、および非刺激nTregsは、0サンプルは、定量RT-PCRによって分析した日に採取し、そしてFOXP3 mRNAの発現は、各サンプルについてRPL13A発現に対して正規化しました。刺激されていないナイーブT細胞におけるFOXP3 mRNA発現を1に設定し、FOXP3 mRNAの変化倍率を算出しました。示した平均値とPCRの範囲の代表的なドナーのための複製ウェルです。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55015/55015fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

このプロトコルは、in vitroでのナイーブCD4 + T細胞から人為的な制御性T細胞（iTregs）の再現性の生成と表現型を説明しています。 Foxp3誘発のための異なるプロトコルは、それぞれのプロトコルを用いて得られた特定のiTregの表現型の研究を可能にします。

TGF-βを含むプロトコルを使用したナイーブCD4 + T細胞からのヒトCD4 + FOXP3 +誘導された調節性T細胞（iTregs）のインビトロ分化における

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

in-vitro-differentiation-human-cd4-foxp3-induced-regulatory-t-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.1K ビュー.  Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory. このプロトコルは、in vitroでのナイーブCD4 + T細胞から人為的な制御性T細胞（iTregs）の再現性の生成と表現型を説明しています。 Foxp3誘発のための異なるプロトコルは、それぞれのプロトコルを用いて得られた特定のiTregの表現型の研究を可能にします。 

ビデオ: In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naïve CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

免疫・感染学

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

HIV-1に感染した個体からの制御性T細胞を増殖するための新しいツール

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

ナイーブCD4のアデノウイルス形質導入Tregの分化を研究するためにT細胞

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly secretes GM-CSF without producing interferon (IFN)&#947; or interleukin (IL)-17 and is found to play an essential role in the autoimmune neuroinflammation. A method of isolation of naive CD4+ T cells from a single-cell suspension of splenocytes and THGM cell generation from naive CD4+ T cells would be a useful technique in the study of T cell-mediated immunity and autoimmune diseases. Here we describe a method that differentiates mouse naive CD4+ T cells into THGM cells promoted by IL-7. The outcome of the differentiation was assessed by the analysis of the cytokines expression using different techniques, including intracellular cytokine staining combined with flow cytometry, a quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR), and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Using the THGM differentiation protocol as described here, about 55% of the cells expressed GM-CSF with a minimal expression of IFN&#945; or IL-17. The predominant expression of GM-CSF by THGM cells was further confirmed by the analysis of the expression of GM-CSF, IFN&#945;, and IL-17 at both mRNA and protein levels. Thus, this method can be used to differentiate naive CD4+ T cells to THGM cells in vitro, which will be useful in the study of THGM cell biology.

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells

Here, we present a protocol to differentiate murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T helper (THGM) cells from naive CD4+ T cells, including isolation of naive CD4+ T cells, differentiation of THGM, and analysis of differentiated THGM cells. This method can be applied to studies of the regulation and function of THGM cells.

体外分化マウス顆粒球マクロファージ ・ コロニー刺激因子 (GM-CSF)-(THGM) ヘルパー T 細胞の生産

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based on the identification of Treg through several activation-dependent cellular surface markers with varying expression levels in different physiologic and pathologic conditions. Populations isolated as &#8220;Treg&#8221; therefore often contain considerable numbers of non-Treg effector cells (i.e., Teff) which hamper the precise phenotypic and functional characterization of these cells, their genomic and proteomic characterization, their reliable enumeration in different states of health and disease, as well as their isolation and expansion for therapeutic purposes. The latter, in particular, remains a major hurdle, as the inadvertent expansion of effector cells homing in Treg-relevant cellular compartments (e.g., CD4+CD25+ T cells) may render Treg-based immunotherapy ineffective, or even harmful. This work presents a method that circumvents the problems associated with population-based isolation and expansion of Treg and shows that the generation of Treg candidate clones with the subsequent selection, culture, and expansion of only carefully vetted, monoclonal cells, enables the generation of an ultrapure Treg cell product that can be kept in culture for many months, enabling downstream investigation of these cells, including for possible therapeutic applications.

This protocol describes the cloning and expansion of human regulatory T cells for the generation of ultra-high purity viable human Treg with stable demethylation at the Treg-specific demethylated region (TSDR) and Treg-specific phenotypic features.

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based ...

<meta charset="utf8"></head><body>フローサイトメトリーを用いたナイーブCD4+ T細胞からのTh17細胞分化

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:サイトカイン濃度調節を用いたTh17細胞の高純度In vitro分化の達成

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

マウスにおけるナイーブCD4+ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

TGF-βを含むプロトコルを使用したナイーブCD4 ⁺ T細胞からのヒトCD4 ⁺ FOXP3 ⁺誘導された調節性T細胞（iTregs）のインビトロ分化における

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ヒトのインビトロ抑制

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

HIV-1に感染した個体からの制御性T細胞を増殖するための新しいツール

ナイーブCD4のアデノウイルス形質導入Tregの分化を研究するためにT細胞

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

マウスナイーブCD4

体外分化マウス顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子 (GM-CSF)-(T_HGM) ヘルパー T 細胞の生産

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

マウスにおけるナイーブCD4⁺ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

マウスにおけるナイーブCD4⁺ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

TGF-βを含むプロトコルを使用したナイーブCD4 + T細胞からのヒトCD4 + FOXP3 +誘導された調節性T細胞（iTregs）のインビトロ分化における

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ヒトのインビトロ抑制

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

HIV-1に感染した個体からの制御性T細胞を増殖するための新しいツール

ナイーブCD4のアデノウイルス形質導入Tregの分化を研究するためにT細胞

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

マウスナイーブCD4

体外分化マウス顆粒球マクロファージ ・ コロニー刺激因子 (GM-CSF)-(THGM) ヘルパー T 細胞の生産

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

マウスにおけるナイーブCD4+ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

マウスにおけるナイーブCD4+ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

TGF-βを含むプロトコルを使用したナイーブCD4 ⁺ T細胞からのヒトCD4 ⁺ FOXP3 ⁺誘導された調節性T細胞（iTregs）のインビトロ分化における

体外分化マウス顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子 (GM-CSF)-(T_HGM) ヘルパー T 細胞の生産

マウスにおけるナイーブCD4⁺ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

マウスにおけるナイーブCD4⁺ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化