Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.

すべての動物研究は、カリフォルニア大学、動物研究に関するサンフランシスコ委員会によって承認され、 実験動物の管理と使用に関する指針 （米国保健社会福祉省、公開番号85から23、1985に準じて行きました）。動物は密接にAAALACの認定を受けUCSF施設内動物管理使用委員会（IACUC）の獣医によってモニターしました。 8日齢のゴミの一つのメスのスプラーグ - ドーリーラット（ごみあたり10匹）を得ました。子犬は10日齢までは母と彼女の子犬は、食料と水を自由に与え、毎日の濃縮と温度および光制御の動物ケア施設に収容され、IACUCプロトコルあたりました。この手順で使用するすべての手術器具は、無菌性を確保するためにオートクレーブしました。楽器のヒントの無菌性は、手術全体を通して維持されます。 1.中大脳動脈閉塞<ol><li>子犬とensurを計量それは、適切な量（19〜21グラム）であり、E。 100％O 2中の3％イソフルランで子犬を麻酔し、足のピンチに応答がないことを確認してください。外科段階下の加熱パッドを用いて、35.5℃から37℃の間の体表面温度を維持します。 </li><li>ショルダー領域にわたるテープで仰臥位で動物を固定します。滅菌綿棒を用いて、計4つのスワブ各溶液間で交互に、二重蒸留水中の70％エタノールのスワブ続いポビドンヨード溶液で前頸部領域をスワブ。 </li><li>ローカル計画切開部位に0.25％ブピバカインに潜入。ステレオスコープを使用して、総頸動脈（CCA）を露出するために5〜7ミリ、前頸部切開を正中線を作ります。オープン露出した動脈空洞を保つために2-4リトラクターを配置します。 </li><li>内頸動脈（ICA）、後頭動脈（OA）、および外頸動脈（ECA）を見つけます。クリアな視界を得るために動脈をグルーミング。車のことeful迷走神経を邪魔しないように。 注：偽手術の仔については、切開部が閉じられた縫合された後、inicisionが開いたままにして、動脈が露出されています。全身麻酔時間は閉塞手術と同等です。 </li><li> 6-0絹編組縫合糸1.5センチカットします。一本鎖を引き出し、縫合糸をUnbraid。単一ストランドが擦り切れきちんとしていないことを確認してください。 注：必要に応じて、滅菌水で一本鎖を浸漬し、鉗子の先端を有するストランドをグルーミングすることによりほつれ端をsmoothe。 </li><li> 45度の鉗子で縫合糸を保持しながら、鉗子先端がICAとOAとの間に出てくるようにICAの下に行くことを掃引円弧運動に鉗子を移動させます。 注：解剖がよく行われている場合は、このステップは比較的容易になります。 ICAとOAが接触している場合は、ICAを隔離するために鉗子を使用しているときの動脈を破裂しないように注意してください。出血が発生した場合は、まで、鉗子で動脈に圧力をかけます出血が停止します。滅菌綿棒で血液を吸収します。 </li><li>鉗子によって保持された縫合糸の終わりをつかみ、最後はアクセスしやすいように、それを引きます。鉗子からストランドを解放し、ステップ1.5（ 図1A）の動きを逆に、ICAの下から鉗子バック。 </li><li>ベース、それはCCAから離れた場所に最も近いでICAの周りに一時的な合字を接続します。 注：があることを確保しつつ、結び目を除去するためにプルされるストランドの端部は、容易に鉗子で把持する（1mm以上、3mm未満）十分な長さであるので、結び目を作ることが重要です後退のための結び目の反対側の縫合糸の適切な量。 </li><li>注意深く横ICAを撤回し、切開部と反対側の腋窩領域付近の過剰皮膚にストランドを固定するためのクリップを使用します。に、この後退ストランドは、次のステップに進む前に、血液の流れを止めるのに十分なピンと張った状態であることを確認してください制御不能な出血のリスクを最小限に抑えます。動脈が平坦淡であることを確認します。 注：それはICAの部分的または完全な涙の原因となりますので、上の後退ではないですか。後退は単にクリップの反対側のストランドを引っ張ることにより、動脈切開を行う前に調整することができます。 </li><li>ステップ1.5のように、ICAの下や周りの他の非編組縫合糸とループ、それを把握するために45°の鉗子を使用してください。位置後退鎖（ 図1B）に横このストランド。 注：このステップはまた、後退する前に行うことができます。後退の品質について不明な場合は、この結び目は非常に緩く、次のステップの前に接続することができます。 </li><li>結ば結紮に近い誤る、結ばと解け結紮の間に0.2ミリメートルの動脈切開を途中で切断します。 注：縛らオフ動脈内に残っている血液は、動脈切開を介して空にすることができるが、5μLを超えるべきではありません。出血が続く場合は、慎重に注意して、後退を高めるために後退鎖を引っ張ります過度の緊張から動脈を損傷無効。 </li><li>メトリック定規を使用して、閉塞縫合糸を測定し、再灌流の間オクルーダの除去2-3ミリの余分な余裕を有する縫合糸を切断します。 45度の鉗子でオクルーダを保持し、MCAに到達するために適切な長さで曲げを作成する直線ピンセットを使用して、前進のための停止点をマークします。 注：曲げに対するシリコーン先端から10mm閉塞長さは、この体重範囲のP10のスプラーグドーリーまたはロングエバンスラット仔のために使用されます。 </li><li> 45°の鉗子を使用して、動脈切開にシリコーンでコーティングされたナイロン閉塞縫合糸を供給し、MCA（ 図1C）に所定の距離をマーク屈曲に縫合糸を進めます。進歩がスムーズに感じていることを確認してください。抵抗が感じられる場合は、直ちに進歩を止めます。前進中、ヘッドに向かって、CC / ECAに平行な方向に縫合糸を目的としています。 注：縫合糸は、高度な背側である場合、に向けて動物の背骨、それは翼口蓋動脈（PTA）に遭遇することがあります。抵抗が前進3〜5ミリメートル後に感じられた場合、縫合糸は、PTA接合を襲っています。シリコーンヘッドが進行方向を調整する前に、動脈切開の近くにあるまで、動脈のうち、閉塞器をバックアップ。完全に動脈から閉塞器を取り外す必要はありません。 </li><li>ステップ1.10（ 図1D）からストランドを使用して、一時的な結紮を結ぶことにより、オクルーダを固定します。 </li><li>リトラクタークリップを取り外します。結び目を取り除くために引っ張られ結び目の鎖がストレートピンセットでつかみやすいですし、結び目を締め引かれるストランドよりも長くなるように、一時的な合字の両方の鎖をトリム。 注：彼らは閉鎖後の空洞にもつれないように、ストランドは十分に短くなければなりません。 </li><li>リトラクターを削除し、3〜4結節縫合を作成するために、6-0編組シルクを使用して空洞を閉じます。 </li><li>から子犬を削除麻酔は、室内の空気中の加熱パッド上に置きます。それは胸骨横臥を維持し、それは完全にダムに戻す前に回復したことを確認するために十分な意識を取り戻したまで子犬を監視します。子犬が35.5°Cと37°Cの間の体表面温度を維持することを確認してください。 </li><li>閉塞時には、イソフルラン麻酔下で拡散強調磁気共鳴画像（DW-MRI）を傷害の適切な誘導を確認するために使用することができます。 図2は、tMCAO 9時のDW-MRIによって検出された現在進行中の虚血性傷害を示しています。 注：拡散強調スピンエコープラナーイメージングは​​、前の再灌流に10〜15分を行っています。脳全体は、以下のパルスシーケンスの設定を使用してシリアル2 mm厚の冠状切片で撮像された：TR / TE = 5000/60ミリ秒、4回の平均、視野の= 35 mmで、データマトリックス= 128×128、拡散勾配時間= 20 MS、分離= 29.7ミリ秒、振幅= 70mT / mであり、B因子= 1,045秒/ mm 2です。このよう脳幹のような皮質の関与または非定型虚血性傷害、性の欠如を示す動物は、除外されています。 </li></ol> 2.再灌流注：閉塞が線条体と皮質を含む傷害の中等度から重度の量を引き起こすために3時間行われます。 <ol><li> MCAの閉塞後約2時間と50分で、100％O 2中の3％イソフルランで子犬を麻酔。外科段階下の加熱パッドを用いて、35.5℃から37℃の間の体表面温度を維持します。 </li><li>ステップ1.16から中断された縫合糸を外し、2合字や閉塞縫合糸の末尾でマークされた接合を、見つけます。 注：偽手術動物を誘発し、閉塞した動物に相当の期間のために麻酔下で残っています。切開は再び開閉縫合します。偽手術動物の場合は、2.11に進みます。 </li><li>慎重にUNTIEほとんどの横結び目は、以前に長い鎖を引いて、ステップ1.14で結ば。 注：結び目をほどくの抵抗がある場合は、結び目の正しい鎖が引かれていることを保証するために停止します。抵抗が続く場合は、より良いビュー倍率を上げます。このステップの間に動脈を損傷することが可能であるとして、ほどくときは注意してください。 </li><li>空洞から縫合糸を外します。 </li><li> MCA閉塞後、正確に3時間で、ゆっくりと動脈の閉塞から縫合糸をバックアップ。何の抵抗はありません。 注：ほとんどの場合、出血はありません。出血の少量が発生した場合、動脈切開サイトでの動脈に圧力をかけます。 </li><li>次のステップは、再灌流のためのICAの血流を復元するように、動脈切開に圧力を適用するために鉗子を使用します。 </li><li>慎重にステップ2.3と同様の方法を使用して、内側結び目をほどきます。 </li><li>身体から縫合糸を外し、出血を止めるために動脈切開に止血剤を適用します。 </LI&gt; <li>出血が止まったことを確認してください。 注：動脈の元の形状と赤色のリターンは、ICAの血流が回復されたことを確認します。 </li><li>開創器を取り外し、6-0編んだシルクの3〜4結節縫合して空洞を閉じます。 </li><li>麻酔から子犬を取り外し、室内空気中の加熱パッド上に置きます。それは胸骨横臥を維持し、ダムに戻す前に、完全な回復を確実にするために十分な意識を取り戻したまでそれを監視します。子犬が35.5°Cと37°Cの間の体表面温度を維持することを確認してください。 </li><li> 5日間毎日子犬を点検。その重みをRecprdし、適切な治癒のために密接に切開部位を検査します。 7-14日後に縫合糸を外します。 9必要に応じて、ポストtMCAOの損傷は、MRIで撮像することができます。 注：動物は、最初の日に体重1グラムまで失うかもしれませんが、一般的に重量を量る介入なしに体重を取り戻すと同様の範囲内となります日4-5によってコントロールにトンの範囲。まれに、子犬は、経口栄養を必要とすると、2〜3日間フィード、過度の重量を失うしないか、難易度の給餌を有することができます。 </li><li> P21で、損傷は確実に、このようなロータロッドやシリンダーの飼育などの感覚行動試験、と評価することができます。認知試験は、早ければ、このような新規物体認識またはモリス水迷路13として評価を用いて生後4〜6週間として行うことができます。 </li><li>脳収穫11、12 Euthasolの腹腔内注射（50ミリグラム/キログラム）によってラットを安楽死させます。 </li><li>介入への損傷ボリュームまたは応答を評価するための組織学的分析は、クレシルバイオレット又はH＆E染色（ 図3）10を用いて行うことができます。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

プロトコル内の重要なステップ両方の未熟および成熟動物における脳損傷の進行の両方に低体温17と温熱療法18の効果が知られているように、まず、完全に回復するまで、麻酔の開始から正常体温を維持することが重要です。動物を確保し、呼吸を監視し、気管が圧迫の自由であることを保証するために切開を、最適な位置を後退させながら、第二に、必要不可欠です。これは、迷走神経刺激による心拍数の変化を引き起こす可能性として第三に、迷走神経を圧迫やストレッチを避けます。 ICAの後退は、動脈切開時の出血を制御する必要があるため、第四に、注意が動脈の損傷を防ぐために、後退時の緊張の度合いに支払わなければなりません。動脈が後退から涙なければ貧しい動脈切開がある場合、または、動物によるリスクに分析から除外されなければなりません出血と貧しい再灌流の。 修正およびトラブルシューティングガイドとしてMRIを使用して、縫合糸の長さは、シリコーンチップが正しく局所虚血を作成するために、MCAを閉塞することを確実にするために最適化されてもよいです。 MRIが利用できない場合、切開は、縫合糸の配置を視覚化するために、子犬は、再灌流の前に安楽死させても良いです。必要に応じて縫合糸の長さを調整します。子犬の重量は非常に閉塞縫合糸長さの要件と相関します。閉塞時間は、傷害の重症度の程度を調整するように変更することができます。 加えて、縫合糸の形状及び長さが重要です。 19〜21グラムの重量を量るP10スプラーグ - ドーリーロングエバンスラットの場合は、10ミリメートルは私たちの経験では、挿入の最適な長さです。閉塞縫合糸の更なる挿入は、MCAの穿孔をもたらし得ます。また、各手術における閉塞フィラメントの形状の一貫性は、損傷pの増加一貫性をもたらすであろうattern 19、20。このような理由から、我々は、この特定の目的のために専門的に製縫合糸を使用してお勧めします。傷害パターンは技術では、一見分違いによる実務家の間で異なる可能性があることに注意することも重要です。 技術の制限事項小さな、開発げっ歯類ではこの手法を実行すると、豊富な経験が必要です。正しく実行した場合、外科医は、異なるサイズの動物間で非常に一貫性の傷害パターンを引き起こし、95％を上回る生存率を達成することができます。さらに、適切な外科的ツールが不可欠です。手術器具はよく、すべての楽器のヒントが正常に近づくことを保証するために維持しなければなりません。 既存または代替方法に関して、この技術の意義低酸素虚血、またはライス・バンヌッチモデルながら2 </SUP&gt;、最も一般的に脳の発達に低酸素性虚血性傷害を研究するために使用される再灌流相に続いて世界的な低酸素のない過渡焦点虚血があるという点で、tMCAOのこのモデルはHIと区別されることに注意することが重要です障害物が除去され、血流が回復されます。これは、より一貫性と再現性の傷害を引き起こし、満期新生児脳卒中で見られるのと同様の損傷パターンを引き起こすことによって、より臨床的な翻訳です。これは、局所損傷パターンや損傷していない組織の代償反応の研究を可能にします。 この技術を習得した後、将来のアプリケーションこのモデルは、人間の新生児における脳卒中の最も一般的な原因、周産期11、21の間に発生する過渡的な閉塞性血栓に似ています。病因は完全には明らかではないが、最も可能性の高い多因子であるが、それはほとんどの場合、トンで推定されますO胎盤11から渡さ塞栓に起因します。後に発作活動や微妙な焦点神経学的検査値異常22としばしば存在すると推測周産期脳卒中また、多くの新生児。これは、傷害の進行および重要な可能な治療戦略のメカニズムを識別するために、一貫性のある、翻訳損傷モデルを使用しています。

新生児期間中の脳卒中は、できるだけ多く2300で1として出生1で発生し、死亡および障害の重要な原因です。これは、変更された中枢神経系の発達につながり、てんかんの発生率の増加、脳性麻痺、精神遅滞、およびモータや認知機能障害の他のタイプを含む、長期罹患率を増加させました。早期の脳卒中の生涯効果は負傷者の脳を保護するために、または修理を強化するための戦略を含めて、この集団に損傷および修復のメカニズムを調べるための翻訳動物モデルが不可欠にします。 別の虚血モデルは、成体動物で脳損傷を研究するために使用されている、と米・バンヌッチ（修正レヴァイン）2手順は、一般的に脳の発達に低酸素性虚血性傷害を研究するために使用されている間、局所虚血-再灌流傷害の明確なメカニズムであります負傷したコアとpenuで、局所損傷の原因となりますmbraと無傷リモート組織。小泉3とロンガ4モデルはそれぞれ、総頸動脈（CCA）と外頚動脈（ECA）を経由して中大脳動脈閉塞を達成するために成体ラットに開発されました。両方のモデルでは、動脈枝の永久結紮および焼灼は、出血を最小限に抑え、また、損傷後の餌にすると重量を得るために、動物の能力に悪影響を引き起こし、外科的処置を、合理化することが重要です。また、未成熟脳における異なる損傷メカニズムと結果として見られる損傷の特定のパターンがあります。 さらに最近では、光血栓脳卒中（ローズ・ベンガル法）5と永久MCA結紮6は、新生児と成人のストロークを研究するために使用されています。光血栓脳卒中やMCAライゲーションの両方がreperfusの欠如につながる脳の血流の永続的な変更を作成しますイオン。再灌流が増加興奮毒性、フリーラジカル形成、及び虚血位相7は異なるシグナル伝達カスケードを伴う遅延細胞死をもたらす一酸化窒素産生と、焦点傷害の発症および進行の重要な成分です。低酸素性虚血はまた、ヒトにおける低酸素性虚血性傷害の原因とは異なり、怪我をコアと半影の研究はより困難作り、一貫性のある局所損傷パターンが発生することはありませんグローバル低酸素状態が続く永久一方的な頸動脈結紮を伴います。 我々は以前に中大脳動脈閉塞（MCAO）8、9、10を使用して未熟ラットにおける非出血性虚血再灌流脳卒中モデルを説明してきました。これは、アクセスして永久ligatiずに内頸動脈を介してMCAを閉塞低侵襲性の方法であります上または焼灼。これは、周産期11、12における脳卒中の最も一般的な原因に似た傷害のモデルを提供します。同側線条体と頭頂側頭皮質への損傷で傷害の結果のこの虚血再灌流モデル。 tMCAOのこのモデルはまた、閉塞の継続時間を変化させることにより、損傷の重症度を制御できます。シグナル伝達経路と、負傷したコアと半影中および無傷の同側および対側の組織における組織学的変化の検討がさらに未熟な脳に損傷および修復のメカニズムを解明することができます。この研究は、脳の発達のために、この重要な損傷モデルのデモンストレーションを行います。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isoflourane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>50033</td>
			<td>anesthetic, at 3%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinocular Surgioscope</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PSMT5N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>000731-500-000</td>
			<td>low to medium setting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Thermometer</td>
			<td>Extech Instruments</td>
			<td>72-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retraction kit for small animals&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18200-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CermaCut Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>112522-00</td>
			<td>2x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>2x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-2 Micro Clamp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00398-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcepts for Clamp Application</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00072-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Vannas Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>2mm cutting edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occlusion Sutures</td>
			<td>Doccol</td>
			<td>602123PK10</td>
			<td>701712PK5Re</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic Agent&#160;</td>
			<td>Avitene</td>
			<td>DVL1010590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>769G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>710101</td>
			<td>0.22 ml/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>100-9249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89097-990</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient middle cerebral artery occlusion model of neonatal stroke in p10 rats

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

tMCAOによって引き起こされる損傷の重症度は、閉塞時間と外科医の経験の両方に大きく依存しています。 3 hは中等度から重度の傷害を生成しながら、90分間の閉塞はしばしば、損傷パターンを軽度から中等度の生成します。損傷の重症度は、MRI、組織学、または短期または長期の行動分析を含む種々の方法によって評価することができます。 図2は、DW-MRIは、同側半球を伴う虚血性傷害を確認し、90分間の閉塞に75分を行った例を示します。拡散強調イメージングは​​、急性虚血性段階中に、反対変更することなく、増加した同側線条体における拡散と同側皮質の大部分を示しています。これは、皮質と深い灰白質の両方を含む長期傷害の適度なレベルに相関します。 MCA結果の閉塞でそれほど重傷のための線条体で始まり、長い閉塞時間とより深刻な怪我のために皮質と海馬の負傷を悪化開発された細胞死。それは閉塞14、15、16の間に適切な縫合糸の配置および浮腫および損傷の進行の視覚化の確認を可能にするように外科技術の最適化中に、そのような糸挿入長さを決定するように、MRIは非常に推奨されています。 MRIが使用できない場合は、H＆Eまたはクレシルバイオレット染色は、傷害の形態を決定するために、シンプルで信頼性の高い組織学的方法であり、tMCAO後の初期および後期の時点の両方で使用することができます。 図3は、同側線条体と皮質における嚢胞形成やボリュームを実証し、3時間閉塞後病理組織学的検査で中等度から重度の損傷パターンを示しています。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"&gt;対側半球体積に対する同側の比率を計算するためにクレシルバイオレット染色切片の不偏立体定量は、同側の虚血 - 再灌流傷害を確認します。具体的には、Euthasolで動物を麻酔した後、脳を4％パラホルムアルデヒドで0.1 M PBSで経心臓灌流によって回収しました。 30％スクロース中で一晩postfixationと平衡化した後、脳全体を50μmの間隔で切断し、そしてすべての第十二の部分は、選択され装着され、クレシルバイオレット10で染色しました。 でも、軽度の損傷と、そのような旋回や片麻痺などの運動の変化は、閉塞期間中に記載されています。より深刻な負傷では、これらの変更は、再灌流後に持続します。追加の行動試験は、ロータロッドやシリンダー感覚機能のテストを飼育し、ためのモリス水迷路を含め、損傷の重症度を評価するために使用することができます認知機能13。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig1.jpg" /> 図1：tMCAO 手順のライブ手術画像。工程1.6で詳述するように、（a）第1の縫合糸は、ICAの周りにループされます。 （B）第1の一時的結紮は結ばれ、ICAを後退させます。工程1.9で詳述したように第2の縫合糸ストランドは、第1の縫合糸ストランドの側方、ICAの周りにループされます。 （C）シリコーンコーティングされた閉塞縫合糸はステップ1.12に詳述されるように、動脈切開部位に供給されます。ステップ1.14に詳述されるように（D）は、第2の一時的結紮は、適所にオクルーダを固定するように結ばれます。スケールバー= 1ミリメートル。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig2.jpg" /> 図2：Occl 中にMRIusionは、適切な一方的傷害を示します。後方に前方、90分間の閉塞時に行わDW-MRIの冠状画像スライスは、急性期に進行中の虚血性損傷と一致している同側半球（矢印）を伴う増加した拡散を示します。ストローク11から許可を得て転載。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54830/54830fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig3.jpg" /> 図3：tMCAO 以下の4週目に線条体と皮質を伴う片側けが。前方の後方、クレシルバイオレット染色冠状脳切片（各50μm）をP38の動物から採取し、かなり深刻な怪我を実証し（矢印は同側の嚢胞形成を示し、皮質減少し、P10で3時間tMCAO以下線条体体積）。左側の丸い穴は反対半球の識別子を表します。スケールバー= 5ミリメートル。病12の神経生物学からの許可を得て転載。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54830/54830fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

P10ラットにおける新生児脳卒中の一過性中大脳動脈閉塞モデル

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

transient-middle-cerebral-artery-occlusion-model-neonatal-stroke-p10

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K ビュー.  University of California, San Francisco. Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

ビデオ: Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

マウスにおけるモデリングのストローク - フィラメントモデルと中大脳動脈閉塞

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

医学

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

中大脳動脈閉塞のマウスモデル

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United States in 20091,2. The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was developed by Koizumi4 in 1986 to simulate this 
impactful human pathology in the rat. A modification of the MCAO method was later presented by Longa3. Both techniques have been widely used to identify 
molecular mechanisms of brain injury resulting from ischemic stroke and potential therapeutic modalities5. This relatively noninvasive method in rats has been 
extended to use in mice to take advantage of transgenic and knockout strains6,7. To model focal cerebral ischemia, an intraluminal suture is advanced via 
the internal carotid artery to occlude the base of the MCA. Retracting the suture after a specified period of time mimics spontaneous reperfusion, but the 
suture can also be permanently retained. This video will be demonstrating the two major approaches for performing intraluminal MCAO procedure in mice in a 
stepwise fashion, as well as providing insights for potential drawbacks and pitfalls. The ischemic brain tissue will subsequently be stained by 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to evaluate the extent of cerebral infarction8.

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is the most frequent used model among experimental ischemic stroke models. Here we will demonstrate the entire model in detail with the guide of Laser Doppler flowmetry, and its representative results.

マウスにおけるレーザードップラー流量計の指針と虚血性脳卒中に対する腔内中大脳動脈閉塞（MCAO）モデル

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

局所脳虚血への早期虚血耐性を誘導するために適切な前処理刺激として二国間の総頚動脈閉塞

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in 20091, 2. Several models of cerebral ischemia have been developed to mimic the human condition of stroke. It has been suggested that up to 80% of all strokes result from ischemic damage in the middle cerebral artery (MCA) area3. In the early 1990s, endothelin-1 (ET-1) 4 was used to induce ischemia by applying it directly adjacent to the surface of the MCA after craniotomy. Later, this model was modified 5 by using a stereotaxic injection of ET-1 adjacent to the MCA to produce focal cerebral ischemia. The main advantages of this model include the ability to perform the procedure quickly, the ability to control artery constriction by altering the dose of ET-1 delivered, no need to manipulate the extracranial vessels supplying blood to the brain as well as gradual reperfusion rates that more closely mimics the reperfusion in humans5-7. On the other hand, the ET-1 model has disadvantages that include the need for a craniotomy, as well as higher variability in stroke volume8. This variability can be reduced with the use of laser Doppler flowmetry (LDF) to verify cerebral ischemia during ET-1 infusion. Factors that affect stroke variability include precision of infusion and the batch of the ET-1 used6. Another important consideration is that although reperfusion is a common occurrence in human stroke, the duration of occlusion for ET-1 induced MCAO may not closely mimic that of human stroke where many patients have partial reperfusion over a period of hours to days following occlusion9, 10. This protocol will describe in detail the ET-1 induced MCAO model for ischemic stroke in rats. It will also draw attention to special considerations and potential drawbacks throughout the procedure.

Several animal models of cerebral ischemia have been developed to simulate the human condition of stroke. This protocol describes the endothelin-1 (ET-1) induced middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke in rats. In addition, important considerations, advantages, and shortcomings of this model are discussed.

ラットにおけるレーザードップラー血流計の指針と虚血性脳卒中のエンドセリン-1誘発性中大脳動脈閉塞モデル

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be performed in many locations overlying the rat cerebrum, but is most easily carried out by creating a craniectomy over the readily accessible frontal or parietal bones. Most frequently, we have used this technique in combination with the endothelin-1 middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke to quantify the changes in middle cerebral artery vessel diameter that occur with injection of endothelin-1 into the brain parenchyma adjacent to the proximal MCA4, 5. In order to visualize the proximal portion of the MCA during endothelin -1 induced MCAO, we use a technique to create a cranial window through the temporal bone on the lateral aspect of the rat skull (Figure 1). Cerebral arteries can be visualized either with the dura intact or with the dura incised and retracted. Most commonly, we leave the dura intact during visualization since endothelin-1 induced MCAO involves delivery of the vasoconstricting peptide into the brain parenchyma. This bypasses the need to incise the dura directly over the visualized vessels for drug delivery. This protocol will describe how to create a cranial window to visualize cerebral arteries in a step-wise fashion, as well as how to avoid many of the potential pitfalls pertaining to this method.

This article describes a method for visualizing rat cerebral arteries through a cranial window using temporal craniectomy in order to view proximal portions of the middle cerebral artery (Figure 1). This versatile method can be combined with various techniques of drug delivery to measure cerebral artery reactivity in vivo.

エンドセリン-1誘発性中大脳動脈閉塞中大脳動脈を可視化するために頭蓋窓を利用

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

腔内中大脳動脈閉塞のラット脳卒中モデルにおける脳血流モニタリングのための最適化されたシステム

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

マウスにおけるモデリングのストローク：遠位中大脳動脈の永久的な凝固

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic stroke. However, the use of tPA is limited by its narrow therapeutic window and by increased risk of hemorrhagic transformation. There is an urgent need to develop suitable stroke models to study new thrombolytic agents and strategies for treatment of ischemic stroke. At present, two major types of ischemic stroke models have been developed in rats and mice: intraluminal suture MCAO and embolic MCAO. Although MCAO models via the intraluminal suture technique have been widely used in mechanism-driven stroke research, these suture models do not mimic the clinical situation and are not suitable for thrombolytic studies. Among these models, the embolic MCAO model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical investigation of thrombolytic therapy. This embolic model was first developed in rats by Overgaard et al.1 in 1992 and further characterized by Zhang et al. in 19972. Although embolic MCAO has gained increasing attention, there are technical problems faced by many laboratories. To meet increasing needs for thrombolytic research, we present a highly reproducible model of embolic MCAO in the rat, which can develop a predictable infarct volume within the MCA territory. In brief, a modified PE-50 tube is gently advanced from the external carotid artery (ECA) into the lumen of the internal carotid artery (ICA) until the tip of the catheter reaches the origin of the MCA. Through the catheter, a single homologous blood clot is placed at the origin of the MCA. To identify the success of MCA occlusion, regional cerebral blood flow was monitored, neurological deficits and infarct volumes were measured. The techniques presented in this paper should help investigators to overcome technical problems for establishing this model for stroke research.

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

ラットにおける同種血血栓による虚血性脳卒中のための塞栓中大脳動脈閉塞（MCAO）

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

マウスにおける反復低酸素プレコンディショニングと過渡中大脳動脈閉塞後に神経血管保護の定量

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...