This material is based on work supported by the National Institutes of Health (1R03-CA182052, 1R15-CA202662), the National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (G.G., DGE-1450079), the Arkansas Biosciences Institute, and the University of Arkansas Doctoral Academy Fellowship. Any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the authors and do not necessarily reflect the views of the acknowledged funding agencies.

<ol>
	<li>Muldoon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy.">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt Express. 15, 16413-16423 (2007).</li><li>Rajaram, N., Reichenberg, J. S., Migden, M. R., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+clinical+study+for+quantitative+spectral+diagnosis+of+non-melanoma+skin+cancer.">Pilot clinical study for quantitative spectral diagnosis of non-melanoma skin cancer.</a> Lasers Surg Med. 42, 716-727 (2010).</li><li>Louie, J. S., Richards-Kortum, R., Anandasabapathy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+advancements+in+the+use+of+high-resolution+microendoscopy+for+detection+of+gastrointestinal+neoplasia.">Applications and advancements in the use of high-resolution microendoscopy for detection of gastrointestinal neoplasia.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 1789-1792 (2014).</li><li>Chang, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+microendoscopy+for+classification+of+colorectal+polyps.">High resolution microendoscopy for classification of colorectal polyps.</a> Endoscopy. 45, 553-559 (2013).</li><li>Muldoon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+oral+neoplasia+with+a+high-resolution+fiber-optic+microendoscope.">Noninvasive imaging of oral neoplasia with a high-resolution fiber-optic microendoscope.</a> Head Neck. 34, 305-312 (2011).</li><li>Muldoon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+image+analysis+criteria+for+the+high-resolution+microendoscopic+detection+of+neoplasia+in+Barrett's+esophagus.">Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus.</a> J Biomed Opt. 15, 026027 (2010).</li><li>Prieto, S. P., Powless, A. J., Boice, J. W., Sharma, S. G., Muldoon, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proflavine+Hemisulfate+as+a+Fluorescent+Contrast+Agent+for+Point-of-Care+Cytology.">Proflavine Hemisulfate as a Fluorescent Contrast Agent for Point-of-Care Cytology.</a> PLoS One. 10, e0125598 (2015).</li><li>Parikh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+diagnostic+accuracy+of+high+resolution+microendoscopy+in+differentiating+neoplastic+from+non-neoplastic+colorectal+polyps:+a+prospective+study.">In vivo diagnostic accuracy of high resolution microendoscopy in differentiating neoplastic from non-neoplastic colorectal polyps: a prospective study.</a> Am J Gastroenterol. 109, 68-75 (2014).</li><li>Shin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+high-resolution+microendoscopic+images+for+diagnosis+of+esophageal+squamous+cell+carcinoma.">Quantitative analysis of high-resolution microendoscopic images for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 13, 272-279 (2015).</li><li>Prieto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+comparison+of+colonic+microendoscopy+image+features+to+histopathology.">Qualitative and quantitative comparison of colonic microendoscopy image features to histopathology.</a> Proc SPIE Int Soc Opt Eng. 9328, (2015).</li><li>Greening, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-bundle+microendoscopy+with+sub-diffuse+reflectance+spectroscopy+and+intensity+mapping+for+multimodal+optical+biopsy+of+stratified+epithelium.">Fiber-bundle microendoscopy with sub-diffuse reflectance spectroscopy and intensity mapping for multimodal optical biopsy of stratified epithelium.</a> Biomed Opt Express. 6, 4934-4950 (2015).</li><li>Rajaram, N., Gopal, A., Zhang, X., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+the+effects+of+microvasculature+pigment+packaging+on+in+vivo+diffuse+reflectance+spectroscopy.">Experimental validation of the effects of microvasculature pigment packaging on in vivo diffuse reflectance spectroscopy.</a> Lasers Surg Med. 42, 680-688 (2010).</li><li>Spliethoff, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+tumor+response+to+cisplatin+using+optical+spectroscopy.">Monitoring of tumor response to cisplatin using optical spectroscopy.</a> Transl Oncol. 7, 230-239 (2014).</li><li>Chang, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+physiology+of+the+precancerous+cervix+in+vivo+through+optical+spectroscopy.">Quantitative physiology of the precancerous cervix in vivo through optical spectroscopy.</a> Neoplasia. 11, 325-332 (2009).</li><li>Yu, B., Shah, A., Nagarajan, V. K., Ferris, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+reflectance+spectroscopy+of+epithelial+tissue+with+a+smart+fiber-optic+probe.">Diffuse reflectance spectroscopy of epithelial tissue with a smart fiber-optic probe.</a> Biomed Opt Express. 5, 675-689 (2014).</li><li>Hennessy, R., Goth, W., Sharma, M., Markey, M. K., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+probe+geometry+and+optical+properties+on+the+sampling+depth+for+diffuse+reflectance+spectroscopy.">Effect of probe geometry and optical properties on the sampling depth for diffuse reflectance spectroscopy.</a> J Biomedical Opt. 19, 107002 (2014).</li><li>Ghassemi, P., Travis, T. E., Moffatt, L. T., Shupp, J. W., Ramella-Roman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polarized+multispectral+imaging+system+for+quantitative+assessment+of+hypertrophic+scars.">A polarized multispectral imaging system for quantitative assessment of hypertrophic scars.</a> Biomed Opt Express. 5, 3337-3354 (2014).</li><li>Vasefi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization-sensitive+hyperspectral+imaging+in+vivo:+a+multimode+dermoscope+for+skin+analysis.">Polarization-sensitive hyperspectral imaging in vivo: a multimode dermoscope for skin analysis.</a> Sci Rep. 4, (2014).</li><li>Winkler, A. M., Rice, P. F. S., Drezek, R. A., Barton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+tool+for+rapid+disease+mapping+using+optical+coherence+tomography+images+of+azoxymethane-treated+mouse+colon.">Quantitative tool for rapid disease mapping using optical coherence tomography images of azoxymethane-treated mouse colon.</a> J Biomedl Opt. 15, 041512 (2010).</li><li>Bish, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handheld+Diffuse+Reflectance+Spectral+Imaging+(DRSi)+for+in-vivo+characterization+of+skin.">Handheld Diffuse Reflectance Spectral Imaging (DRSi) for in-vivo characterization of skin.</a> Biomed Opt Express. 5, 573-586 (2014).</li><li>Prahl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Absorption of Hemoglobin. , (1999).</li><li>Rajaram, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+clinical+instrument+for+spectral+diagnosis+of+cutaneous+malignancy.">Design and validation of a clinical instrument for spectral diagnosis of cutaneous malignancy.</a> Appl Opt. 49, 142-152 (2010).</li><li>Hennessy, R., Markey, M. K., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+one-layer+assumption+on+diffuse+reflectance+spectroscopy+of+skin.">Impact of one-layer assumption on diffuse reflectance spectroscopy of skin.</a> J Biomed Opt. 20, 27001 (2015).</li><li>Rajaram, N., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lookup+table-based+inverse+model+for+determining+optical+properties+of+turbid+media.">Lookup table-based inverse model for determining optical properties of turbid media.</a> J Biomed Opt. 13, 050501 (2008).</li><li>Nichols, B. S., Rajaram, N., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+lookup+table-based+approach+for+measuring+tissue+optical+properties+with+diffuse+optical+spectroscopy.">Performance of a lookup table-based approach for measuring tissue optical properties with diffuse optical spectroscopy.</a> J Biomed Opt. 17, 057001 (2012).</li><li>Greening, G. J., James, H. M., Muldoon, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Phantoms: Diffuse and Sub-diffuse Imaging and Spectroscopy Validation. , 1-37 (2015).</li><li>Karsten, A. E., Smit, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+verification+of+melanin+concentration+on+human+skin+type.">Modeling and verification of melanin concentration on human skin type.</a> Photochem Photobiol. 88, 469-474 (2012).</li><li>Glennie, D. L., Hayward, J. E., Farrell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+changes+in+the+hemoglobin+concentration+of+skin+with+total+diffuse+reflectance+spectroscopy.">Modeling changes in the hemoglobin concentration of skin with total diffuse reflectance spectroscopy.</a> J Biomed Opt. 20, 035002 (2015).</li><li>Lim, L., Nichols, B., Rajaram, N., Tunnell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probe+pressure+effects+on+human+skin+diffuse+reflectance+and+fluorescence+spectroscopy+measurements.">Probe pressure effects on human skin diffuse reflectance and fluorescence spectroscopy measurements.</a> J Biomed Opt. 16, 011012 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

<html>ここで報告マルチモーダル高解像度画像とサブ拡散反射分光法繊維束microendoscopeは、ヒトまたは動物の研究のための内視鏡またはハンドヘルドの使用を含む種々の用途のために研究者によって最適化して使用することができます。従って、ヘモグロビン濃度、メラニン濃度、および2つの異なる組織の深さからの組織酸素飽和度の測定値と一緒に、インビボ頂端組織のマイクロアーキテクチャで可視化する柔軟な方法を提供します。この記事では、蛍光造影剤として、ピラニンインクを用いて、高解像度の撮像システムとサブ拡散反射画像化システムを組み立てるためのプロトコルの概説、およびインビボでのヒト組織におけるその適用を示し、光ファイバープローブの仕様を説明し組織の可視化。プロフラビンまたはフルオレセインなどの他のインクは、適切な承認を得て代わりにピラニンインクを用いることができる。4-7,11 &quot;&gt;任意のプローブの機能は、この設計から変更されてもよい。高分解能蛍光microendoscopyモダリティの場合、直径1mmのイメージファイバは、4.5μmでの一定のサブセルラー空間分解能が得られ、4.5μmの間隔で50,000個々のコア繊維から成り0.14と1.40ミリメートル。50ミリメートルの焦点距離チューブレンズの間の直径で容易に入手可能なこれらのイメージファイバーを見つけることができます小さいまたは大きい視野を得るために、異なるサイズのイメージファイバを望む。研究者は、CMOSセンサは、そのように選択しました。イメージファイバから完全な、1mmの視野を捕獲した。チューブレンズの焦点距離を拡大し、サンプリング周波数を増加させるが、視野を減少さ増加、一定の対物レンズを保持する場合。11したがって、の倍率対物レンズ、結像レンズの焦点距離、撮像素子の大きさ、およびイメージファイバ缶の大きさ及び必要に応じて最適化されるべきである。最後に、フィルタ及び励起光光源は、蛍光色素の励起/発光スペクトルに応じて変更することができる。4-7プローブ及び高分解能蛍光microendoscopy計測を変更することに加えて、サブ拡散反射分光計測を修正することができます。 サブ拡散反射分光法様式のために、異なる大きさのマルチモードファイバは、各SDSで使用することができます。より小さな直径のマルチモードファイバを提供し、より小さな領域にわたって光を集めることができるようになりますが、繊維径が200μm未満が使用された場合、信号対雑音を増加させるために同一の間隔をあけファイバのアレイを使用することをお勧めします。皮膚または口腔組織を分析する研究者は、研究者らは、プローブサイズに関する追加された制約に直面するだろう、視野および信号対雑音が、このような食道や胃腸管のような狭い発光器官で増加する全体的に大きいプローブから利益を得ることができます特に修道院の生検ポートとの互換性のためにional内視鏡。8その他の分光コンポーネント修正することができる広帯域光源と電動式光スイッチが含まれます。タングステン-ハロゲンランプは、他の光源にすることができるが、この場合、選択された、信号対雑音を増加させ、下側の積分時間よいキセノンアークランプおよびLEDを含む、他の研究で使用されてきた。2,15,20電動式光スイッチは、ここで紹介するカスタム3のSDSまで対応できるように設計されていますが、多かれ少なかれ入力を含むように修飾することができます。電動光スイッチは、信号対雑音比を低下させる、広帯域光源と分光器との間に追加の光学部品を追加しないことに留意すべきです。スイッチは、同時にデータを取得し、複数の分光器と研究者のために必要であるが、光スイッチの部品を含めて最終的にSDSあたりおよそ$ 3,000 USDによって計装コストを削減しないことがあります。 計装の構築（ <stroNG&gt; 2及び図3）は非常に簡単です。このプロトコルの中で最も重要なステップは、サブ拡散反射分光法モダリティ（ 図4）のキャリブレーションです。キャリブレーションは、スペクトルデータ収集の直前に完了しなければなりません。キャリブレーションが完了すると、器具のない片が遮断されていないか、再校正が必要であり得ることを確認します。適切なキャリブレーションは、正確な反射スペクトルを得るために必要であるため、下地のメラニン濃度、ヘモグロビン濃度、および未知のサンプルからの組織酸素飽和度の正確な値を得ます。便利なことに、ほとんどの研究者は、十分に記載されている同様の較正技術を使用しています。光学パラメータに反射スペクトルを変換するためのソフトウェア要件に関する2,11,12,25の情報が他の場所で見つけることができます。11,24,26 トラブルシューティングに関しては、スペクトルは貧しいフィットの結果（平均生データとあてはめたデータとの間の10％を超えるパーセント誤差）は（[ヘモグロビン]、[メル]、およびSAO 2）ここで提示3組織の生理学的パラメータの信頼性の低い値が得られます。貧しいフィットは、最も可能性の高いデータ収集時のプローブと皮膚のサイト間の移動、後処理コードの狭い境界条件、または信頼性の低い[ヘモグロビン]の先験的な値と[メル]のいずれかの結果である。11,21,24、これらの3つの一般的なエラーの発生における26の改善は、サブ拡散反射スペクトルの正確なフィッティングを固定する必要があります。したがって、データ収集は、スペクトル内の運動アーチファクトを低減するために分光計の積分時間を減少させることによって改善することができます。さらに、境界条件、後処理下記[ヘモグロビン]、[メル]、およびSAO 2の可能な計算の出力値の範囲を表します。これらの研究では、境界条件は、[ヘモグロビン]のために0-10 mg / mlで、SAO 2 [メル]のための21,22 0-40 mg / mlで、27,28および0から100パーセントでした<sup&gt;以前の研究からの値に基づいている29。21,22,27-29メラニンのない組織を測定する場合は、[メル]の下限と上限は、単に0 mg / mlとに設定することができます両方。最後に、。21プラールらによって発表されたヘモグロビンとメラニンのために確立された先験的吸光度の値を使用することをお勧めしますこれらの単純な改善は、サブ拡散反射スペクトルの正確なフィッティングを修正する必要があり、と疑問が残っている場合、スペクトルはとファントムで検証することができます既知の光学特性（縮小散乱及び吸収係数）。 このマルチモーダルイメージングと分光繊維束microendoscopyプラットフォームへの主要な制限は、広視野撮像モダリティの欠如です。高分解能蛍光microendoscopyモダリティは急速な組織の大きな領域を走査することが難しく、直径1mmの円形視野を有します。この制限を克服するための一つの計算方法は、画像MOSAありますIckingのは、使用される技術は、単一の、より大きな画像マップに隣接するマイクロスケール画像を積層して、より広い視野を提供する。10このような画像モザイクは、以前プリエトらによって実証された。結腸の画像特徴を調査するために10をアンこの制限を克服するための計器の変更は、このようなパリキらによって提示されたプローブとして、従来の内視鏡の生検ポートを有するプローブの互換性作ることになります。結腸直腸新生物を調査する。8この機能は、広視野の利点を組み合わせました高分解能蛍光microendoscopyのマイクロスケール画像と図8 全体として、この技術は、in vivoでヒトの皮膚に示し、下層のメラニン濃度、ヘモグロビン濃度、および組織酸素飽和度との同時登録高解像度の組織のマイクロアーキテクチャ画像（ 図5）の値を示しました。このTECHNiQueには、 生体内で構造的および機能的組織異常の間のリンクを調査することを望む、または観察可能な構造変化の非存在下での組織機能の変化を分析する研究者によって使用することができます。今後の研究では、様々な上皮疾患状態におけるこの技術の実現可能性を調査します。

繊維束microendoscopy技術は、典型的には、イメージング技術または分光技術の組み合わせのいずれかを用いて、インビボ組織に分析する。小サブセルラー解像度で1-3一つのそのようなイメージング技術、高分解能蛍光microendoscopy、缶画像頂端組織のマイクロアーキテクチャ、マイクロスケール視野、プロフラビン、フルオレセイン、またはピラニンインクなどの局所造影剤を使用して。1,3-11このイメージングモダリティは、質的に低いとリアルタイムに罹患し、健康な上皮組織を分化における有望な臨床成績を示しています観察者間変動。8時には、研究者らは、細胞や核の大きさや腺領域として定量的な特徴を抽出するために、高解像度蛍光顕微鏡データを使用しますが、これは組織形態を可視化をターゲットに、主に定性的な手法のまま。1,3,8-一方10、分光技術は、このような拡散反射分光法のような機能的な組織情報を提供し、定量的に、複数の臓器に癌病変を識別する際に臨床成績を約束を示しているに向かって標的化される。2,12-15 したがって、潜在的にモダリティの両方のタイプを組み込んだデバイスが必要であり、さらに、観察者間の変動を減少させる、組織のマイクロアーキテクチャのリアルタイム可視化を維持し、組織の健康状態のより完全な分析を提供します。この目標を達成するために、マルチモーダルプローブベースの機器は、単一の光ファイバープローブ内の2つのモダリティ組み合わせた構築した。高分解能蛍光microendoscopyサブ拡散反射分光法を頂端の定性的な高解像度画像11このメソッド共レジスタ地元のヘモグロビン濃度を含む二つの異なる組織の深さから定量的なスペクトル情報（機能的特性）との組織形態（構造特性）（[HB]）、メラニン濃度（[メル]）、および酸素飽和度（SAO 2）。11,12,16は、この特定のサブ拡散反射分光法様式は、提供するために2つのユニークな組織深度をサンプリングするために2つの光源-検出器の分離（のSDS）を使用し基底膜と下にある組織間質にダウンサンプリングすることで組織の健康のより包括的な画像。11 ファイバープローブは、約50,000 4.5μmの直径の繊維要素、1.1ミリメートルと1.2ミリメートルの全体的なコーティング直径のクラッド径を有する中央1ミリメートル径のイメージファイバで構成されています。イメージファイバは、220ミクロンのクラッド直径が5 200ミクロンの直径の繊維に囲まれています。各200μmのマルチモード光ファイバは、離れてイメージファイバの中心から864ミクロンの中心間距離に位置しています。 200μmのマルチモードファイバの各々が25°離れています。 「ソース」繊維として左端200μmのマルチモードファイバを使用して、追加目μmの「コレクション」繊維として200μmのマルチモードファイバをreeが、この形状は、必ずしも374ミクロンの3中心のSDSを作成し、730ミクロン、1051ミクロン、および1323。ファイバー先端は、一定の繊維間の距離を保つ筒状の金属ケース内に封入されています。円筒状の金属ケースの直径は3mmです。光ファイバープローブの先端部（光ファイバープローブ先端に向かって）は2フィートの長さです。プローブを4フィート全長のために、さらに2フィートである（計装向かって）近位端部6のそれぞれの個々の繊維に分離する。 図1は、光ファイバープローブの表現を示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54564/54564fig1.jpg" /> 図1：光ファイバープローブ設計光ファイバープローブは、1 1ミリメートル径のイメージファイバと4200μmのマルチモードファイバで構成されています。このこの図は、左端の200ミクロンのマルチモードファイバ（スケールバー≈1ミリメートル）に対する374ののSDSを得るために、プローブ先端で繊維の形状を制約する（a）は、金属製エンドキャップの表現、730、および1051ミクロンを示しています（b）は、繊維が、金属キャップ内に拘束され、ファイバコア、ファイバクラッディング、およびファイバ被覆（スケールバー≈1mm）で示し、（c）は 、繊維の周りに保護ポリアミドシース（スケールバー≈1 mm）と、（D ）金属フィンガーグリップと全ての繊維を含む単一の黒いケーブル（スケールバー≈4ミリメートル）、および（e）プローブ（スケールバー≈4ミリメートルの遠位先端の絵）を有するプローブの完成遠位先端部、。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54564/54564fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> このマルチモーダル機器および関連するテクニック他の複合構造/機能の技術はそれが異なるモダリティを組み合わせる存在しないが、QUEは、単一のプローブ内のこれらの様式の第一の組み合わせです。例えば、ハイパースペクトルイメージングは定量的なヘモグロビンおよびメラニン特性を有する広視野イメージングを組み合わせた、17,18、および他の技術は、いくつか例を挙げると19、組織のタンパク質発現の分析を光コヒーレンストモグラフィー（OCT）を組み合わせたものが開発されています。下部消化管および食道内または口腔内で使用するためのハンドヘルドプローブとして、内視鏡の使用など、様々な目的のために最適化することができ、一般的な光ファイバープローブを使用し、コンパクトで簡単に実装する計装セットアップでこの記事を報告そして、外部の皮膚の配置。11,20 この計測器のハードウェアは、拡散反射スペクトルを取得した後、得られたvolumを抽出するために、カスタム・データ収集および後処理コードの両方を必要とします[Hbの]、[メル]、およびSAO 2を含む電子平均組織の生理的パラメータ。カスタムデータ取得コードは、（高分解能蛍光顕微鏡用）カメラから同時に取得し、（拡散反射分光法）分光計を可能にするように構築されました。ドライバは、多くの場合、さまざまなプログラミング言語との統合を可能にするために、メーカーのウェブサイトから入手可能です。カスタム後処理コードがin vivoでの先験的吸収値をインポートする[ヘモグロビン]と[メル] 21、その後スペクトルの近似曲線を作成し、以前に開発された非線形最適化フィッティング処理を採用しています。22近似曲線を最小化することにより構築されています自身と生のスペクトルとの間のχ2値が近似曲線から、最低χ2値。22コードを用いて組織の生理的パラメータ（[ヘモグロビン]、[メル]、およびSAO 2）を決定すること含むように修正することができますそのようなここで使用される外因性のピラニンインクとしてだけでなく、他の発色団から吸収するので、そのターゲットの生理的パラメータは影響を受けません。 このような【のHb]、[メル]、およびSAO 2などの組織の健康の生理学的指標は、治療に対する腫瘍応答の報告として、または局所血管新生および血管形成の指標として用いることができる。高分解能蛍光microendoscopyモダリティ含める14,23ガイドプローブの配置を助け、上皮組織の構造と機能の関係の全体像と研究者を提供します。この記事では、マルチモーダルmicroendoscopeの構築と応用が記載されている。11

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1143">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">CM1-DCH</td>
			<td style="width:427px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter)</td>
			<td style="width:175px;">Chroma Corporation</td>
			<td style="width:171px;">T470lpxr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Cage Assembly Rod, 1.5&#34;, 4-Pack</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">ER1.5-P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Cage Assembly Rod, 3.0&#34;, 4-Pack</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">ER3-P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Cage Assembly Rod, 2.0&#34;, 4-Pack</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">ER2-P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">SM1-Threaded 30 mm Cage Plate</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">CP02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">SM1 Series Stress-Free Retaining Ring</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">SM1PRR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">SM1 Lens Tube, 1.00&#34; Thread Depth</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">SM1L10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Right-Angle Kinematic Mirror Mount</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">KCB1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">1&#34; UV Enhanced Aluminum Mirror</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">PF10-03-F01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Z-Axis Translation Mount</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">SM1Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">10X Olympus Plan Achromatic Objective</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">RMS10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">XY Translating Lens Mount</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">SM1SMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">SM1 Lens Tube, 0.50&#34; Thread Depth</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">SM1L05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">440/40 Bandpass Filter (Excitation)</td>
			<td style="width:175px;">Chroma Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ET440/40x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">525/36 Bandpass Filter (Emission)</td>
			<td style="width:175px;">Chroma Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ET525/36m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Quick Set Epoxy</td>
			<td style="width:175px;">Loctite</td>
			<td style="width:171px;">1395391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">455 nm LED Light Housing Kit - 3-Watt</td>
			<td style="width:175px;">LED Supply</td>
			<td style="width:171px;">ALK-LH-3W-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">1&#34; Achromatic Doublet, f=50mm</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">AC254-050-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Flea 3 USB Monochrome Camera</td>
			<td style="width:175px;">Point Grey, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">FL3-U3-32S2M-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">0.5&#34; Post Holder, L = 1.5&#34;</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">PH1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">0.5&#34; Optical Post, L = 4.0&#34;</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">TR4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Mounting Base, 1&#34; x 2.3&#34; x 3/8&#34;</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">BA1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR)</td>
			<td style="width:175px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:171px;">HL-2000-LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">20X Olympus Plan Objective</td>
			<td style="width:175px;">Edmund Optics, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">PLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Custom-Built Aluminum Motor Arm</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:171px;">N/A</td>
			<td>Custom designed and built</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:171px;">N/A</td>
			<td>Custom designed and built</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Custom-Built Aluminum Motor Housing</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:171px;">N/A</td>
			<td>Custom designed and built</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Stepper Motor - 400 steps/revolution</td>
			<td style="width:175px;">SparkFun Electronics</td>
			<td style="width:171px;">ROB-10846</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:171px;">N/A</td>
			<td>Custom designed and built</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:171px;">N/A</td>
			<td>Custom designed and built</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Arduino Uno - R3</td>
			<td style="width:175px;">SparkFun Electronics</td>
			<td style="width:171px;">DEV-11021</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Electronic Breadboard - Self-Adhesive</td>
			<td style="width:175px;">SparkFun Electronics</td>
			<td style="width:171px;">PRT-12002</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">EasyDriver - Stepper Motor Driver</td>
			<td style="width:175px;">Sparkfun Electronics</td>
			<td style="width:171px;">ROB-12779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">12V, 229 mA Power Supply</td>
			<td style="width:175px;">Phihong</td>
			<td style="width:171px;">PSM03A</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR)</td>
			<td style="width:175px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:171px;">USB2000+VIS-NIR-ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">550 &#181;m, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">M37L01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Custom-Built Fiber-Optic Probe</td>
			<td style="width:175px;">Myriad Fiber Imaging</td>
			<td style="width:171px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard</td>
			<td style="width:175px;">Labsphere, Inc.</td>
			<td style="width:171px;">SRS-20-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:373px;">Standard Yellow Highlighter</td>
			<td style="width:175px;">Sharpie</td>
			<td style="width:171px;">25005</td>
			<td>Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal imaging and spectroscopy fiber-bundle microendoscopy platform for non-invasive, in vivo tissue analysis

最近の繊維束microendoscopy技術は、イメージング技術または分光技術の組み合わせのいずれかを用いてインビボで組織の非侵襲的な分析を可能にします。単一の光プローブにイメージングと分光技術を組み合わせることにより、組織の健康状態のより完全な分析を提供することができます。この記事では、2つの異なる様式は、単一の光プローブに、高解像度蛍光microendoscopy画像と拡散反射分光法を組み合わせています。高分解能蛍光microendoscopyイメージングは​​、頂端組織のマイクロアーキテクチャを視覚化し、主に質的な技術がために使用される技術である腫瘍性および非腫瘍性組織との間の効果的なリアルタイムの分化を示しました。拡散反射分光法は、局所ヘモグロビン濃度、メラニン濃度、および酸素飽和度を含む組織の生理学的パラメータを抽出することができる技術です。この記事では、仕様rを説明しますインスツルメンテーションを構築し、その後、in vivoでヒトの皮膚上の技術を実証する方法を、光ファイバープローブを構築するためにequired。この作品は、具体的には、頂端皮膚ケラチノサイトは、その関連する生理学的パラメータと同時登録することができ、組織のマイクロアーキテクチャことを明らかにしました。ここで紹介する計測機器や繊維束プローブは、器官系の様々な使用のためのハンドヘルドまたは内視鏡と互換性のあるデバイスのいずれかとして最適化することができます。追加の臨床研究は、異なる上皮疾患状態のためのこの技術の実行可能性をテストするために必要とされます。

このプロトコルに続いて、研究者は、全視野（ 図5）を用いて組織部位の合焦点高解像度の画像を取得します。標準的な黄色の蛍光ペンからピラニンインクで染色した場合、このようなプロフラビンなどの染料で染色された場合は、個々の細胞核を見ることができるのに対し、細胞の概要を、見ることができます。スペクトルの取得に続いて、後処理ソフトウェアは、サブ拡散反射スペクトルに適合し、[ヘモグロビン]、[メルための値を決定するためにインビボでヘモグロビン濃度（[Hbの]）及びメラニン濃度（[メル]）21の先験的な知識を使用して]、及び組織酸素飽和度（SAO 2） 図5に示すように、後処理ソフトウェアは、広い生理的境界を使用する（[ヘモグロビン] = 0〜150 mg / mlで、[メル] = 0〜30 mg / mlであり、SAO 2較正されたスペクトルに合わせて= 0~100％）。21 <imgのALT = &quot;図5&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54564 / 54564fig5.jpg&quot; /&gt; 図5： 共同登録 in vivoで ヒト正常皮膚および良性メラノサイト母斑 から定性的および定量的なデータを高解像度の蛍光画像は、（標準的な黄色の蛍光ペンから）ピラニン-inkから取得した良性のメラノサイト母斑および隣接する正常な皮膚を染色150ミリ秒の露光時間で組織。ケラチノサイトの概要を明らかに両方の画像に表示されますすることができます。正常な皮膚組織部位とメラノサイト母斑は、99％の同様の酸素飽和度を用いて、それぞれ、0.78および10.20 mg / mlでの1.63および0.86 mg / mlで、メラニン濃度のヘモグロビン濃度を有していました。この図は、同時登録定性的構造的および定量的機能情報の利点を実証している。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54564/54564fig5large.jpg" target="_blank">より大きな輸出自主規制を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図のイオン。

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Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

マルチモーダルイメージングおよび非侵襲のための分光繊維束Microendoscopyプラットフォーム、<em&gt;インビボ</em&gt;組織分析

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

multimodal-imaging-spectroscopy-fiber-bundle-microendoscopy-platform

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

7.8K ビュー.  University of Arkansas. The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

生物工学

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

ビデオレートでスキャニング共焦点顕微鏡とMicroendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ラマン分光法を用いた細胞と細胞外マトリックスの非接触、ラベルフリーの監視

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

のためのウイルス粒子<emインビボ&gt;</em&gt;腫瘍イメージング

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3次元細胞培養のための自己申告足場

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

細胞および組織メカノでのアプリケーションのためのプラットフォームをストレッチ小説

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

マルチモーダル分子イメージングアプリケーションのためのBiofunctionalizedプルシアンブルーナノ粒子

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

手持ちの臨床音響小動物の非侵襲的な実時間イメージングによる画像計測

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...