This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&amp;D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).

本研究では、マウスは、延世大学の延世大学実験動物研究センターの特定病原体フリーの施設で維持しました。全ての動物実験は、延世大学で延世大学実験動物研究センターの国際動物実験委員会によって承認されたプロトコルを使用して、韓国の食品医薬品局（FDA）のガイドラインに従って行いました。 ソリューションの調製<ol><li> 2％RPMI培地は、RPMIで1％まで2％ペニシリン - ストレプトマイシンをウシ胎児血清（FBS）を希釈することにより調製します</li><li>完全RPMI培地を準備します。 RPMIへのメディアは、FBSの10％、ペニシリン - ストレプトマイシン1％、L-グルタミン1％、及び50μMの2-メルカプトエタノールを追加します。 </li><li>蛍光活性化細胞選別（FACS）バッファーを準備します。 FBSの2％そうするために、補助リン酸緩衝生理食塩水（PBS）。 </li><li> T細胞の分離バッファを準備します。これを行うには、FBSの2％および2mMのethylenediaminetetraaでPBSを補いますクジラの酸。 </li></ol>脾臓リンパ球の2の単離<ol><li>前述したように19ナイーブまたはLCMV CL13-感染マウスから脾臓を取り出して、2％RPMI培地の10ミリリットルを含む60ミリメートルX 15ミリメートルペトリ皿の中に置いて。 注：本研究の実験では、5〜6週齢のC57B1L / 6J雌マウスの尾静脈から静脈注射を介してLCMV CL13の2×10 6プラーク形成単位（PFU）を受けました。感染後（16 Dのパイ）25日16時マウスを生け贄に捧げます。同じ日にあったGE-マッチしたナイーブマウスを分析します。 </li><li> 50ミリリットルチューブにセルストレーナーを配置し、2％RPMI培地2mlでそれをすすいでください。 70μmのセルストレーナーに脾臓を置き、シリンジのプランジャーを使用して挽きます。 2％RPMI培地2mlで細胞ストレーナーを洗浄し、50 mlチューブから取り外します。 </li><li> 4℃で5分間、300×gで2％RPMI培地と遠心分離機でチューブを埋めます。上清を捨て、再懸濁ACK溶解緩衝液1ml中の細胞ペレット。 5分間室温（RT）でサンプルをインキュベートします。 注：上記に示したACK溶解緩衝液の容量は、1脾臓のためです。プールされた脾臓サンプルに対して相応のボリュームをスケールアップ。 </li><li> 4℃で10分間300×gで2％RPMI培地と遠心分離機でチューブを埋めます。上清を廃棄し、完全RPMI培地中1×10 7細胞/ mlの密度で細胞を再懸濁します。 注：トリパンブルーで生細胞計数、染色細胞の場合と血球計数器を用いて染色していないだけで生きた細胞を数えます。 </li></ol>脾臓従来のT（TのCONV）細胞およびT reg細胞の3表現型注：T reg細胞の単離の前に、様々な抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーによってそれらを分析することによって、ナイーブまたは感染マウスから単離した脾臓リンパ球の表現型を調べます。 <ol><li> 50μlの細胞を移します新しいU底96ウェルプレートの各ウェルへの全脾臓リンパ球のうち、（5×10 5個の細胞）とは、ウェル当たりのFACS緩衝液150μlを添加します。 4°Cで2分間300×gで遠心分離します。 </li><li>上清を捨てます。細胞ペレットを攪拌し、ウェルあたりFACS緩衝液200μlを追加します。 4°C（2回）で2分間300×gで遠心分離します。 </li><li>以下の抗体および試薬でウェルあたりFACS緩衝液50μlに染色細胞表面マーカーに対する抗体のカクテルを準備します。抗CD4バイオレット染料、抗CD25緑色色素、抗PD-1紫色色素、抗CD8 PerCPを-のCy5.5色素及び細胞生存能力検出試薬、近赤外（IR）、蛍光反応性染料。 注：さらに、活性化T reg細胞の表現型を分析するために、抗CD103 23,25は、細胞表面マーカーの染色のために添加することができます。 </li><li>ウェル当たり抗体カクテル50μlの細胞ペレットを再懸濁します。 4℃の暗所で20分間インキュベートします。で細胞を2回洗浄4°Cで2分間300×gで遠心分離することによってFACSバッファー。 </li><li>最後の洗浄工程の後、上清をデカントし、製造業者のプロトコルに従って調製した固定用緩衝液100μlを用いて4℃で暗所で20分間、細胞を固定。 </li><li> 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによって（製造業者のプロトコルに従って調製した）透過性の洗浄緩衝液で細胞を2回洗浄します。 </li><li>細胞内のFoxp3染色用抗体溶液を準備し、そして抗Foxp3の抗体溶液50μlで細胞ペレットを再懸濁します。 注：さらに、TのCONVとT reg細胞の表現型を分析するために、抗CTLAは、この段階で添加することができます。 </li><li> 4℃の暗所で20分間インキュベートし、ステップ3.6を繰り返します。最後の洗浄工程の後、FACS緩衝液200μl中に細胞ペレットを再懸濁し、25フローサイトメーターによる細胞の表現型を調べます。 </li><li>ゲート生細胞populaる。 CD4 +またはCD8 + T細胞のう ​​ち、PD-1 +細胞- LCMV CL13感染中のT CONV細胞の表現型を分析するために、Foxp3の頻度を調べます。 注：実験の結果に基づいて、のFoxp3の割合は- PD-1 + CD4 +およびLCMV CL13 16次元πにおけるCD8 + T細胞集団の両方で50％以上です。 <ol><li> T reg細胞の頻度と表現型を分析するために、CD4 + T細胞の中でのFoxp3 +またはのFoxp3 + PD-1 +細胞の頻度を調べます。 注：実験の結果に基づいて、のFoxp3 +またはのFoxp3 + PD-1 +細胞の割合は、それぞれ、CD4 + T細胞集団における20％以上です。 </li></ol></li></ol> CD4 + CD25 + T reg細胞の単離4 注：すべての試薬の体積は、以下に示すためのものです1×10 7総脾臓細胞の細胞数を開始します。 <ol><li>ナイーブおよびLCMV慢性的に感染したマウスを用いて、セクション2に記載されているように細胞を準備します。 T細胞単離緩衝液10mlを加えることによって細胞を洗浄します。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。完全に上清を捨て、バッファの40μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>磁気細胞分離システムを使用して、CD4 + T細胞濃縮のために、ビオチン-抗体カクテルを10μl加え、よく混ぜます。 4℃で10分間インキュベートします。 </li><li>緩衝液30μl、非CD4 + T細胞の標識化のための抗ビオチンマイクロビーズを20μlおよびCD25 +細胞の蛍光標識のためのCD25-PE抗体の10μlのを追加します。よく混ぜ、暗所で15分間インキュベートします。 </li><li>バッファの2ミリリットルを追加し、細胞破片を除去し、新しい50ミリリットルチューブに40μmのセルストレーナーを介して細胞を渡します。 4℃で10分間、300×gでの遠心分離によって細胞を洗浄します。完全に上清を捨て、最大で1.25×10 8細胞の密度で500μlの緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>カラム上に細胞を適用し、カラムを通過する非標識細胞を収集します。 4℃で10分間、300×gで遠心分離緩衝液を2mlを加えることにより、カラムを洗浄します。完全に上清を捨て、バッファー90μlの中で孤立したCD4 + T細胞を再懸濁します。 </li><li> CD25 +細胞の磁気標識のために、抗PEマイクロビーズの10μlを添加、よく混ぜ、4℃の暗所で15分間インキュベートします。 </li><li>緩衝液2 mlを加え、4℃で10分間、300×gでの遠心分離によって細胞を洗浄します。完全に上清を捨て、最大で1×10 8個の細胞の密度で緩衝液500μl中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> CD4 + CD25 + T reg細胞を豊かにするために、正の選択のためのカラム上に細胞を適用し、コラムを洗います緩衝液を2mlを添加することにより、N。洗浄を3回繰り返します。 </li><li>列が最後の洗浄工程の後に空になると、カラムに緩衝液1mlを追加し、磁気標識CD4 + CD25 +プランジャーを用いて細胞洗い流します。 </li><li>反復は、単離されたCD4 + CD25 + T reg細胞の純度を高めるために、4.8から4.9までステップ。 4℃で10分間、300×gで遠心分離することによってFACS緩衝液で細胞を洗浄します。上清を廃棄し、完全RPMI培地中2×10 6細胞/ mlの濃度で単離されたCD4 + CD25 + T reg細胞を再懸濁します。 </li><li>孤立CD4 + CD25 + T reg細胞の純度を確認するには、合計孤立CD4 + CD25 + T reg細胞からの2×10 5個の細胞を使用しています。抗CD4 FITC試薬近赤外線蛍光反応性染料を検出する細胞の生存を含有するFACS緩衝液50μlで細胞を染色します。 注：CD25はすでに単離の間にPEで標識しました。 </li><li> 4℃の暗所で20分間インキュベートします。 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによってFACS緩衝液で細胞を洗浄。洗浄後、FACS緩衝液100μlに細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーによって純度を確認してください。 </li><li>ゲート生細胞集団。 T reg細胞の純度を分析するために、CD4 + CD25 +細胞の割合を確認します。 注：実験の結果に基づいて、精製された細胞間のCD4 + CD25 +細胞の割合は、約80％以上です。 </li></ol> CD8 + T細胞およびCD8 + T細胞の標識の5単離注：以下に示す全ての試薬 ​​の体積は、1×10 7総脾臓細胞の出発細胞数のためのものです。 <ol><li>ナイーブマウスを使用して、セクション2に記載されているように細胞を準備します。 T細胞単離バフを10mlを添加することによって細胞を洗浄えー。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。完全に上清を捨て、バッファの40μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>磁気細胞分離システムを用いてCD8 + T細胞の単離のために、非CD8 + T細胞の標識のためのビオチン抗体カクテルを10μl添加し、よく混合します。 4℃で5分間インキュベートします。 </li><li>緩衝液30μlと抗ビオチンマイクロビーズの20μlを添加します。よく混合し、4℃で10分間インキュベートします。 </li><li>カラム上に細胞を適用し、カラムを通過する非標識細胞を収集します。バッファの3回を2ミリリットルを追加することにより、カラムを洗浄。 </li><li> 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。完全に上清を捨て、2mlの緩衝液で単離したCD8 + T細胞を再懸濁します。 </li><li>単離された細胞の純度を確認するには、FACS緩衝液中の抗体溶液50μlを準備します。単離したCD8 + Tセルのうち、2×10 5個の細胞を再懸濁し抗体溶液の50μl中のls。 注：抗CD8 FITC追加し、抗体溶液を調製し、細胞生存率の検出試薬（近IR蛍光反応性染料）FACS緩衝液にします。 </li><li> 4℃の暗所で20分間インキュベートします。 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによってFACS緩衝液で細胞を洗浄。洗浄後、FACS緩衝液100μl中で細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーによって細胞の純度を確認してください。 </li><li>ゲート生細胞集団。 CD8 + T細胞の純度を確認するために、CD8 + T細胞の割合を確認します。 注：実験の結果に基づいて、精製された細胞のう ​​ちCD8 +細胞のパーセンテージは、約90％以上です。 </li><li>単離したCD8 + T細胞にPBSを追加します。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。上清を捨てます。 PBS中の1×10 7細胞/ mlの濃度で単離されたCD8 + T細胞を再懸濁します。 </li><li> CD8 + TのCEを標識するためにインビトロ抑制アッセイのためのLLSは、室温で5μMの濃度を得るために、PBSで細胞増殖追跡バイオレット染料を希釈します。 注：この研究において使用される細胞増殖追跡バイオレット染料のおおよその励起および発光ピークは、それぞれ、405および450nmです。 </li><li> 15mlチューブに細胞増殖追跡バイオレット染料（5μM）と細胞懸濁液（CD8 + T細胞1×10 7細胞/ ml）をウェル等量混合し、37℃で20分間インキュベートします。チューブを10分ごとにボルテックス。 </li><li>冷たい完全RPMI培地でチューブを埋めるし、RTで10分間チューブを残します。 RTで10分間、300×gで遠心分離します。完全に上清を廃棄し、予め温めた完全RPMI培地で2×10 6細胞/ mlの濃度で細胞を再懸濁します。 RTで15分間細胞をインキュベートします。 </li></ol> 6. CD4 + CD25 + Tを用いたin vitroの抑制アッセイを設定します&lt;サブ&gt; REGおよびCD8 + T細胞<ol><li>抗CD3 / CD28でコーティングしたビーズを製造するために、チューブの15ミリリットル（2.5マイクロリットル/ 1×10 5細胞）に磁気ビーズの適切な量を転送します。等量のPBSを加え、混合します。 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによって洗浄し、上清を捨てます。 （50μL/ウェル）完全培地中の磁気ビーズを希釈します。 </li><li> CD4 + CD25 + T reg細胞のアリコート50μlを、U底96ウェルプレートのウェルあたり（1×10 5細胞/ウェル）。レスポンダーT（TのRESP）などのCD8 + T細胞細胞ウェルあたり（1×10 5細胞/ウェル）を50μLを加えます。ウェルあたりに希釈した抗CD3 / CD28被覆ビーズの50μlを添加。 注：このステップは、ラベルには、次のようにコントロールウェルを設定する：「未刺激のCD8 + T細胞のみ「ノー抗CD3 / CD28でコーティングしたビーズで。 「CD8 + T細胞のみ「抗CD3 / CD28でコーティングしたビーズで。 「CD8 + T細胞のみ「抗CD3 / CD28でコーティングしたビーズで、「。」のみT reg細胞、抗CD3 / CD28でコーティングしたビーズでT reg細胞は、Tの異なる比でのT RESP細胞を完全培地と共培養することによって希釈することができますRESP細胞 ：T reg細胞（1：0.25〜1：1）。 </li><li>総量200μlに、すべてのウェルに50μlのか、メディアの適切な量を追加します。ホイルでプレートをカバーし、72時間、37℃のCO 2インキュベーターでインキュベートします。 </li></ol> CD8 + T細胞増殖およびサイトカイン産生の7分析CD8 + T細胞から<ol><li>サイトカイン産生の分析のために、培養の3日後、ウェル別のプレートに各上清を分離し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を行います。 注：上清は-70℃でアリコートに分けて保存することができます。この実験では、抗マウスIFN-γ抗体でコーティングされたプレートは、IFN-γ産生協定を検出しました製造業者のプロトコールにる。単一細胞レベルでのCD8 + T細胞増殖のIFN-γ産生を決定するために、細胞内サイトカイン染色を行うことができます。 </li><li>各ウェルから上清を分離した後、4°C（3回）で2分間、300×gでFACS緩衝液および遠心分離で細胞を含むプレートを洗浄します。 </li><li>洗浄した後、上清を捨てます。増殖したCD8 + T細胞の染色のための抗体カクテルの50μlの細胞ペレットを再懸濁します。 4℃の暗所で20分間インキュベートします。 注：FACS緩衝液中に、抗CD4 FITC、抗CD8 PerCPを-のCy5.5、及び細胞生存能力検出試薬（近IR蛍光反応性染料）を追加し、抗体カクテルを調製しました。 注：そのようなCD44又はCD69のような種々のマーカーに対する抗体は、CD8 + T細胞の活性化を確認するために、他の抗体と組み合わせることができます。 CD8 + T細胞は、すでに細胞増殖トラッキングVで標識されていることを思い出してくださいステップ5.10でiolet染料。 </li><li> 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによって二回洗浄します。最後の洗浄工程の後、上清を捨て、そして固定緩衝液100μlで4℃で暗所で20分間、細胞を固定。 </li><li> 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによって二回洗浄します。 FACSバッファー200μlで細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーによる細胞増殖追跡バイオレット色素で標識されたCD8 + T細胞の増殖を測定します。 <ol><li>ゲート生細胞のう ​​ちCD8 + T細胞集団。以下の式に従って細胞増殖追跡バイオレット染料及びCD8 + T細胞の希釈の希釈に応じて分割し、分割されていない細胞の割合を測定します。阻害％= [（T reg細胞の非存在下で増殖したCD8 + T細胞の％ - T reg細胞の存在下で増殖したCD8 + T細胞の％）/（％で増殖したCD8 + T細胞のT reg細胞の非存在下）]をX 100はまた、ソフトウェア25フローサイトメトリーを使用してデータを分析します。 </li></ol></li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signature+of+CD8++T+cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection.">Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection.</a> Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).</li><li>Jin, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+Tim-3+and+PD-1+in+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection.">Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).</li><li>Punkosdy, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T-cell+expansion+during+chronic+viral+infection+is+dependent+on+endogenous+retroviral+superantigens.">Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).</li><li>Blackburn, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coregulation+of+CD8++T+cell+exhaustion+by+multiple+inhibitory+receptors+during+chronic+viral+infection.">Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection.</a> Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).</li><li>Park, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+upregulated+on+regulatory+T+cells+during+chronic+virus+infection+enhances+the+suppression+of+CD8++T+cell+immune+response+via+the+interaction+with+PD-L1+expressed+on+CD8++T+cells.">PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells.</a> J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).</li><li>Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+chronic+viral+infection.">Redefining chronic viral infection.</a> Cell. 138 (1), 30-50 (2009).</li><li>Penaloza-MacMaster, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+regulatory+T+cells+and+PD-1+in+modulating+T+cell+exhaustion+and+viral+control+during+chronic+LCMV+infection.">Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection.</a> J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+ligase+Peli1+negatively+regulates+T+cell+activation+and+prevents+autoimmunity.">The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity.</a> Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).</li><li>Krishnamoorthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+infection+with+respiratory+syncytial+virus+impairs+regulatory+T+cell+function+and+increases+susceptibility+to+allergic+asthma.">Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma.</a> Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).</li><li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo.">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).</li><li>Tai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basis+of+CTLA-4+function+in+regulatory+and+conventional+CD4(+)+T+cells.">Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells.</a> Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).</li><li>Rushbrook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+suppress+in+vitro+proliferation+of+virus-specific+CD8++T+cells+during+persistent+hepatitis+C+virus+infection.">Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).</li><li>Sekiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+orphan+receptor+Nr4a2+induces+Foxp3+and+regulates+differentiation+of+CD4.">The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4.</a> T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).</li><li>Merianos, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice.">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).</li><li>Allakhverdi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD103+identifies+human+regulatory+T-cell+subsets.">Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets.</a> J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).</li><li>Camisaschi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAG-3+expression+defines+a+subset+of+CD4(+)CD25(high)Foxp3(+)+regulatory+T+cells+that+are+expanded+at+tumor+sites.">LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites.</a> J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GARP+selectively+identifies+activated+human+FOXP3++regulatory+T+cells.">Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).</li><li>Myers, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2-independent+and+TNF-alpha-dependent+expansion+of+Vbeta5++natural+regulatory+T+cells+during+retrovirus+infection.">IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection.</a> J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).</li></ol>

S.-J.H. has a patent and receives patent royalties related to the PD-1 pathway. The other authors have no financial conflicts of interest.

T reg細胞の少数が、マウスおよびヒトに存在するが、免疫応答を調節し、免疫寛容の維持において重要な役割を果たしているように、それらの機能を理解することが重要です。 T reg細胞の数と抑制機能は、慢性ウイルス感染15-20だけでなく、癌の進行13,14の間に増加します。これはおそらく、継続的な抗原刺激によるものです。抗原の永続性と病気の開発中のT...

調節性T（TのREG）細胞は、それらの発生と機能1用の転写因子としてフォークヘッドボックスP3（Foxp3の）を発現します。加えて、T reg細胞は、CD25 2、リンパ球活性化遺伝子-3（LAG-3）3、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体4、および細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）5などの様々な他の分子を発現しますそれらの表面または細胞内領域に。このような強化された抑制機能を表示するウイルス6,7、細菌8,9、および寄生虫10-12、または癌発生13,14の過程で、T reg細胞が活性化された細胞に分化になる、などの病原体の様々な種類の慢性感染の間エフェクターCD4 +及びCD8 + T細胞を標的とします。論文の数は拡大し、活性化したT reg細胞が損なわCD8 + T細胞RESPONSに寄与することが示唆されています友人レトロウイルス（FV）感染15-17の間に電子。 FV誘発性T reg細胞は、IFN-γまたはグランザイムBの発現およびCD8 + T細胞の細胞傷害反応性15-17を阻害します 。また、単純ヘルペスウイルス感染モデルでは、ウイルス特異的CD8 + T細胞および免疫病原性CD4 + T細胞の18-20の浸潤によって深刻な組織損傷の拡大が生じたCD4 + CD25 + T reg細胞の枯渇が報告されました。 リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV CL13）のクローン13株を用いて慢性的に感染したマウス21〜24は、広く、慢性ウイルス感染の間にエフェクターT細胞（T effの）およびT reg細胞の表現型および機能を特徴づけるために使用されています。永続LCMV感染の間に、ウイルス特異的T effの細胞が次第に彼らのエフェクター機能を失い、疲れT（TのEXH）細胞になります。一方、Treg細胞は、ウイルス特異的T細胞応答25を抑制する能力を強化します。 T effは細胞の機能容量の低下は、T effは細胞上の阻害性受容体のアップレギュレーションは、抗原提示細胞の変化した機能、免疫調節性サイトカインの産生、および頻度の増加、またはT REGの強化機能など、いくつかの要因によって説明することができます細胞26。 T細胞の抑制に関与する因子の中でも、プログラムされた細胞死は、タンパク質1（PD-1）発現のT EXH細胞およびT reg細胞が広く、抗原の持続性および抑制性環境の特徴として考えられてきました。最近では、T reg細胞のPD-1経路及びアブレーションの遮断が強化されたT細胞の機能をもたらし、LCMV慢性感染27の間のウイルス負荷を減少させたことが報告されました。また、T reg細胞は、LCMV 23,25によるマウスの慢性感染の間に活性化されています</sアップ&gt;とその抑制機能は25強化されます。 PD-1は、高T reg細胞ならびにT EXH細胞上に発現し、T reg細胞によって発現されるPD-1のレベルは、T細胞増殖25を阻害するそれらの抑制機能の強さと相関します。 ここでは、LCMV CL13とナイーブマウスから単離された休止T reg細胞に感染したマウスから単離した活性化T reg細胞の特性を比較する方法を記載しています。さらに、我々は活性化T reg細胞を分離し、それらのex vivoでの表現型を調べるだけでなく、in vitroでのそれらの抑制活性を測定するための一連の処理を説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="976">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">FITC Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td style="width:67px;">RM4-5</td>
			<td style="width:173px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:104px;">553047</td>
			<td style="width:249px;">Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytofix/Cytoperm</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Use this reagent for cell surface staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-Bottom Tissue Culture Plates</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation buffer</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">554655</td>
			<td>Use this reagent for cell surface staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC Rat Anti-Mouse CD25</td>
			<td>7D4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553072</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer, 70mm</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td>Use this strainer for grinding the whole spleen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer, 40mm</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352340</td>
			<td>Use this strainer for filtering the cells before column enrichment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)</td>
			<td>29F.1A12</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>135217</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4</td>
			<td>RM4-5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td align="right">100547</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC Anti-Mouse/Rat Foxp3&#160;</td>
			<td>FJK-16s</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5773</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td></td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a</td>
			<td>53-6.7</td>
			<td>eBiosicence</td>
			<td>45-0081</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse IFN-gamma Platinum ELISA</td>
			<td></td>
			<td>eBiosicence</td>
			<td>BMS606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td></td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (1X)</td>
			<td></td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine, 200mM solution</td>
			<td></td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL</td>
			<td></td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td></td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-34975</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-091-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS Separation Columns, LD columns</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Use this column for Treg cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS Separation Columns, LS columns</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td></td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30919.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTrace Violet Cell Proliferation Kit</td>
			<td></td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Canto II flowcytometer</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer*</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flowjo</td>
			<td></td>
			<td>TreeStar</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry software&#8224;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematocytomer</td>
			<td></td>
			<td>Marienfeld superior</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phenotypic and functional analysis of activated regulatory t cells isolated from chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice

転写因子としてのFoxp3を発現する調節性T（T REG）細胞、CD4 + T細胞のサブセットです。 T reg細胞は、免疫応答を調節することによって免疫寛容と恒常性の維持に重要な役割を果たしています。 T reg細胞の主な役割は、エフェクターT（T effの）細胞の増殖ならびにIFN-γ、TNF-α、およびIL-2などのサイトカインの産生を抑制することです。 T effは 、細胞の機能を阻害するT reg細胞の能力は、永続的な病原体感染および癌の発生の間に増強されることが実証されています。休止または炎症条件下でT reg細胞の機能を明確にするために、マウスまたはヒトT reg細胞を使用して、種々のインビトロ抑制アッセイが考案されています。本研究の主な目的は、休止および活性化T regの間の表現型および抑制機能の違いを比較するための方法を開発することです細胞。活性化T reg細胞を単離するために、マウスを、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）クローン13（CL13）、LCMVの慢性株に感染させました。 LCMV CL13感染マウスの脾臓から単離されたT reg細胞は、ナイーブマウスから単離されたT reg細胞を休止期と比較して活性化された表現型および強化された抑制活性の両方を示しました。ここでは、T reg細胞を休止期から活性化したT reg細胞を区別するためのex vivoでの表現型分析のための基本的なプロトコルを記述します。さらに、我々は、完全に活性化したT reg細胞の抑制活性の測定のためのプロトコルを説明します。

私たちは、静脈内にLCMV CL13の2×10 6 PFUでそれらを注入することにより、持続的なウイルス感染マウスを作製しました。 T reg細胞および慢性ウイルス感染の間にT CONV細胞における表現型の変化を調べるために、ナイーブ、感染マウスから得られた脾臓リンパ球を、種々の抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析しました。 CD4 + T?...

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Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

表現型および慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに感染したマウスから単離された活性化制御性T細胞の機能解析

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

phenotypic-functional-analysis-activated-regulatory-t-cells-isolated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.7K ビュー.  Yonsei University. Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

ビデオ: Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

免疫・感染学

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

HIV-1に感染した個体からの制御性T細胞を増殖するための新しいツール

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative neurology. This directive has arisen from the extensive evidence that brain repair is achieved after focal or systemic NPC transplantation in several preclinical models of neurological diseases.
These experimental data have identified the cell delivery route as one of the main hurdles of restorative stem cell therapies for brain diseases that requires urgent assessment. Intraparenchymal stem cell grafting represents a logical approach to those pathologies characterized by isolated and accessible brain lesions such as spinal cord injuries and Parkinson's disease. Unfortunately, this principle is poorly applicable to conditions characterized by a multifocal, inflammatory and disseminated (both in time and space) nature, including multiple sclerosis (MS). As such, brain targeting by systemic NPC delivery has become a low invasive and therapeutically efficacious protocol to deliver cells to the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system (CNS).
This alternative method of cell delivery relies on the NPC pathotropism, specifically their innate capacity to (i) sense the environment via functional cell adhesion molecules and inflammatory cytokine and chemokine receptors; (ii) cross the leaking anatomical barriers after intravenous (i.v.) or intracerebroventricular (i.c.v.) injection; (iii) accumulate at the level of multiple perivascular site(s) of inflammatory brain and spinal cord damage; and (i.v.) exert remarkable tissue trophic and immune regulatory effects onto different host target cells in vivo.
Here we describe the methods that we have developed for the i.v. and i.c.v. delivery of syngeneic NPCs in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), as model of chronic CNS inflammatory demyelination, and envisage the systemic stem cell delivery as a valuable technique for the selective targeting of the inflamed brain in regenerative neurology.

The transplantation of neural stem/progenitor cells (NPCs) holds great promises in regenerative neurology. The systemic delivery of NPCs has turned into effective, low invasive, and therapeutically very efficacious protocol to deliver stem cells in the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system.

慢性EAEを有するマウスにおける神経幹/前駆細胞の全身注射

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

T細胞の導出<em&gt;体外</em&gt;マウス胚性幹細胞からの

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

末梢血からのヒトアロ抗原特異的T細胞の生成

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

表現型分析のためのヒト皮膚からリンパ球単離と<em&gt; ex vivoで</em&gt;細胞培養

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T細胞は、樹状細胞からTransinfectionによって細菌をキャプチャ

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with respect to how viral members of the microbiome affect subsequent microbe interactions with these virus-infected host cells. The co-habitation of virus with bacteria and fungi is principally present on the mucosal surfaces of the oral cavity and genital tract. Mucosal cells, particularly those with persistent chronic or persistent latent viral infections, could have a significant impact on members of the microbiome through virus alteration in number and type of receptors expressed. Modification in host cell membrane architecture would result in altered ability of subsequent members of the normal flora and opportunistic pathogens to initiate the first step in biofilm formation, i.e., adherence. This study describes a method for quantitation and visual examination of HSV&#39;s effect on the initiation of biofilm formation (adherence) of S. aureus and C. albicans.

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

細菌や真菌によってウイルス感染細胞上のバイオフィルムの開始の決意

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the allograft early after transplantation, mount a graft reactive response against the transplanted organ, and initiate organ rejection2. Recent data suggest that suppressive macrophages facilitate successful long-term transplantation3 and are required for the induction of transplantation tolerance4. This suggests a multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation, and function, which demands a new roadmap for the isolation and analysis of macrophage function5. Due to the plasticity of macrophages, it is necessary to provide a methodology to isolate and characterize macrophages, depending on the tissue environment, and to define their functions according to different scenarios. Here, we describe a protocol for immune characterization of graft-infiltrating macrophages and the methods we used to functionally evaluate their capacity to inhibit CD8+ T proliferation and to promote CD4+Foxp3+ Treg expansion in vitro.

Macrophages are plastic cells of the hematopoietic system that have a crucial role in protective immunity and homeostasis. In this report, we describe optimized in vitro techniques to phenotypically and functionally characterize graft-infiltrating regulatory macrophages that accumulate in the transplanted organ under tolerogenic conditions.

グラフト反応性免疫を阻害する調節性マクロファージの機能的特徴付け

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.