著者らは、PDMS基板の製造に彼の援助のためのエリック・バスコ、博士Shiyong王有益な提案とDRG分離の訓練のためのミシガン大学の博士マリーナ・マタの研究室で、博士マークTuszynski博士に感謝したいと思いますUCサンディエゴ校。W.マリーカンパーナ有益な提案とSC分離のためのプロトコルのために。この研究は、国立科学財団（CBET 0941055とCBET 1510895）、国立衛生研究所（R21CA176854、R01GM089866、およびR01EB014986）によって部分的にサポートされていました。

細胞の単離のためのすべての手順は、ミシガン州立大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 前延伸異方性表面の調製<ol><li>塩基及び硬化剤の1液及び組織培養皿（直径12cm）中に混合物を注ぐ：10を混合します。 4900 mgのベースと合計架橋混合物のための490 mgの硬化剤を使用してください。 </li><li>気泡を除去するために20分間真空下でゲル混合物を保管してください。 </li><li> 60℃で一晩硬化のためにオーブンでゲル混合物を置きます。 </li><li> PDMS膜が硬化した後、165ミリトルで3分間及びO 2の65 SCCMフローのプラズマ洗浄/エッチングシステムを使用して酸素プラズマを用いて表面を処理します。 </li><li>皿から長方形のメンブレン（5×3.5センチメートル）の一部をカットし、酸素処理されている側認識しながら、必ず酸素処理された面を上に、延伸フレームに固定されていることを確認。上のフレームを配置<html>ステージをストレッチし、均等に、それは10％の伸び率に達するまでステージ上のノブを回してストレッチ（またはいくつかの他の予め定められたストレッチを、伸びが直接、延伸段階から読み取ることができます）長軸9に。フレームのネジを締めて、ストレッチを修正しました。 </li><li>ステージからフレームを削除します。膜表面が乾燥し、ほこりのないことを確認し、その後、チャンバーの粘着面が膜に強固に取り付けることができるようにメンブレン上にシリコーン室を配置します。 注：シリコーン室は、PDMS膜上の細胞培地を保持するための十分を提供します。装置の設計は、 図1に示されています。 </li><li> 10分間UVで表面を滅菌します。 </li><li>追加1 mlのポリ-L-リジンプラズマ処理の6時間以内にチャンバー内PDMS表面に（PLL）（リン酸緩衝生理食塩水0.01％）、および37℃で2時間インキュベートDRGニューロンを播種する前に。これは、細胞接着を増強します。 </li></ol>DRGのル &quot;&gt; 2。アイソレーション<ol><li> DRGニューロンのための標準的な増殖培地を準備します。 </li><li>分離前に、分離装置とフィルタ試薬をオートクレーブ。 6ウェルプレートの1ウェル中に分離緩衝液5mlを追加し、氷上にプレートを置きます。 0.05％トリプシン-EDTA（1mg / ml）の9ミリリットルにコラゲナーゼA（500 U / ml）を1ミリリットルを追加することにより、解離培地10mlを用意し、氷上で0.22μmフィルターと場所とのソリューションをフィルタリングします。 </li><li>単離のために7日間の齢のSprague-Dawleyラット - 10 5〜12を使用してください。 75％イソプロパノールで子犬をスプレーし、断頭により犠牲に。 </li><li>背中から脊髄を覆う皮膚を切り取ると、背骨の周りの余分な組織を除去します。上の外科手術用のスポットライトが付いている外科手術用ルーペの下では、首から最初の切開を行い、その後、ハサミで両側の背骨に沿ってカット。仔の身体から背骨を外し、過剰な筋肉を取り除きます。その後、経度に沿って切断するはさみを使用して脊椎および使用ピンセットのG軸は完全に脊椎を開いて滅菌15mlチューブに分離緩衝液でのDRGを転送するための大きな開口部を作成するために、ピペットから脊髄cord.Removeに先端を抽出します。 </li><li>ピンセットの罰金ペアを使用して、骨のポケットから神経節を除去し、約10収集 - 両側から16 DRGを。神経根をトリムし、氷冷分離バッファに神経節を移します。 </li><li>滅菌15ミリリットルチューブに分離バッファでのDRGを転送するための大きな開口を作成するために、ピペットからヒントを削除します。化学解離した後、5分間900×gで4℃で遠心神経節を。 </li><li>組織は、チューブの底に沈殿し、そっと上に単離緩衝液を除去し、チューブに解離培地10mlを追加してみましょう。 </li><li> 10分 - チューブごと5を振とうしながら1時間、37℃の水浴中で解離培地中で解剖した組織をインキュベートします。 </li><li>後の5分間900×gで4℃での化学的解離、遠心神経節。 </li><li>上清を除去し、10ミリリットルの標準的な成長培地、ボルテックスでペレットを再懸濁。 </li><li>再び2.9節に示されているように解離した細胞を遠心します。 </li><li>上清を除去し、標準的な増殖培地と渦の12ミリリットル中にペレットを再懸濁します。 </li></ol>前延伸表面上のDRGの3文化<ol><li> 、細胞を播種チャンバーからPLLソリューションを除去し、滅菌水と空気乾燥でPDMS表面を洗浄する前に。 </li><li> 2分の残骸がチューブの底に沈殿することを可能にするために - 細胞を再懸濁した後、1用のサスペンションセットができます。各ストレッチチャンバ内に細胞懸濁液1.5 mlを加え、5％CO 2で37℃でインキュベートします。 </li><li> 10μlの（または15μl）をフルオロ-2-デオキシウリジンおよびウリジン（FDU-U）の株式solutiの混合物を追加し、in vitroで 1日（DIV）で、グリア細胞を排除するために、各ウェルに（ 材料の表を参照してください）に。 7時間後、新鮮な標準的な増殖培地でこの培地を交換し、5％CO 2、37℃のインキュベーター中でプレ延伸培養装置を配置します。 </li><li>細胞培養期間中（2から3週間）、新鮮な培地で半分使用済み培地を交換し、2日毎に培地を変更します。注：2週間の延伸、未延伸面に培養した後、精製されたSCがチャンバに追加され、別の週（ステップ4.7）培養しました。 </li></ol> 4.事前延伸表面上のDRGニューロンとシュワン細胞（SCS）の共培養<ol><li>博士カンパーナのグループ以前に15で説明したようにのSCを分離します。 <ol><li>簡単に言えば、1日齢の子犬からのSCを分離します。収集し、機械的に坐骨神経化学（トリプシンEDTAおよびコラゲナーゼA）の両方と（18ゲージの針/ 10ミリリットルの注射器）15を解離。 </li><li>ポリ-D-リジン（PDL）の共同に解離細胞をシード5％CO 2で37℃でT25フラスコと文化をated。 5日目に、抗なた1.1抗体及びウサギ補体を用いて抗体の選択を介して細胞を精製し、流路2に精製された細胞を継代培養 - ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）を含む4.培養培地、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌）、21 / mlのウシ下垂体は、（BPE）を抽出し、4μMフォルスコリン。 </li></ol></li><li> SCからの培養培地を除去し、そしてフラスコに5ミリリットル0.05％トリプシン-EDTAを追加します。 3分- 2、5％CO 2にて37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li>彼らはフラスコから持ち上げる場合には、培地の5ミリリットルを追加し、フラスコ内の細胞と混合見るために10倍の対物レンズを用いて光学顕微鏡下で細胞を確認してください。 </li><li> 200×gで15ミリリットルの遠心管と遠心分離機に細胞懸濁液を追加し、20℃で5分間。 </li><li>上清を除去し、7ミリリットル標準DRG成長MEDにペレットを再懸濁IA。 </li><li> 0.5 mlマイクロチューブに10μlの細胞懸濁液を取り、トリパンブルーを10μlと混合し、次いで10×対物レンズを用いて光学顕微鏡下で血球計数器を用いて細胞数をカウントします。 DRGの増殖培地を添加することによって1ml当たり5,000細胞の細胞懸濁液を希釈します。 </li><li>延伸室でDRG培養物から培地の0.5ミリリットルを削除し、DRG培養物にSC懸濁液0.5ミリリットルを追加します。 </li><li>文化DRGのための新たな標準的な増殖培地で半分使用済み培地を交換することにより、37℃で1週間の細胞および5％CO 2を変更し、メディアごとに2日。 1週間共培養した後、免疫組織化学10で細胞を処理します。 </li></ol>

<ol>
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The authors do not have any conflict of interest to disclose.

前延伸表面に軸索アライメントを誘導するために、2つの重要なステップがあります：1）PDMS膜は、均一な厚さのフラットでなければなりません。及び2）グリア細胞をDRGから削除する必要があります。 PDMSと架橋剤を混合し、オーブンで硬化させた後、架橋PDMSゲルは平らな作業台の上に保持し、任意の傾きを避けるために慎重に取り扱われるべきです。プラズマ処理後（細胞接着に必要な）表面の親水性は経時的に減衰するため、PDMS膜の酸素プラズマ処理は、PLLコーティングによって6時間以内に従うべきです。プラズマ処理は、膜の一方の側に印加されるので、注意がプラズマ処理された表面への細胞のために上向きにされるべきである、すなわち、フレーム上に配置され、正しい側を確実にするために皿からPDMSを剥離した後に注意しなければなりませんに接続します。 DRGは脊柱と一緒に揃え骨ポケットの内側に配置されています。椎骨の色は、白ですので、若い仔は、椎骨からのDRGを区別することは困難です。この場合には、スポット光に近い背骨を配置することが重要です。骨は白と不透明のまま光の下では、DRGを透明にします。 pHは、神経細胞の生存率に影響を与えるので、氷の上および生理的pHで解離緩衝液を保持することが重要です。単離した組織は非常に粘性であり、遠心分離管に転送する際ピペットチップに固執する傾向があります。このように大きな開口を生成するために、ピペットの非常に先端を切断して転送を容易にします。 いくつかのプロトコルでは、解離緩衝液を添加する前に、単離された組織と必要なもう一つの遠心分離工程があります。このステップの代わりに、我々のプロトコルは、そうでなければ、細胞の生存率および密度に影響を与える余分な遠心分離工程を削減し、数分のための解剖バッファに解決するために組織が必要です。細胞密度も依存しています仔の数に屠殺し、したがって仔の一貫した数たびに維持することが重要です。 DRGニューロン、従って有糸分裂阻害剤、FDU-U、グリア細胞の増殖を抑制するために1 DIVで培地に添加されると共に単離されるグリア細胞もあります。いくつかのプロトコルはarabinofuranosylcytidine（のAraC）とFDU-Uの組み合わせを好むが、これは、一般的に、神経細胞の初期の成長期間中のグリア細胞を阻害するために使用されます。 FDU-Uのモル濃度は、単離された細胞の密度に依存して、異なるプロトコルで変化培養物に添加しました。我々は、全DRG培養の間、（グリア細胞が存在する場合）、必要に応じて、有糸分裂阻害剤は、（ステップ3.3で指定された濃度で）複数回追加することができるが見つかりました。一般的に影響を与えるDRGニューロンの添付ファイル以来の任意の時点で大量（以上15μl）を追加することは推奨されません。 プラズマ処理はsurfacを増強します軸索は添付ファイルを開始するための電子親水性およびPLLコーティングは、帯電した表面を提供します。文献中の参考文献によれば、親水性を誘導し、プラズマ処理は、乾燥条件16-17の下で、時間の経過とともに減衰します。しかし、PDMSは、液体の条件の下で、水と遅い反応を受けることになると徐々に親水18に疎水性であることから変更されます。したがって、プラズマ処理は、時間の経過とともに減衰していても、それが当社の業績に影響を与えるべきではありません。有利な条件下に置かれた場合、PLLコーティングのために、供給業者からの製品情報によると、それは、長年にわたって安定です。細胞は、PLLコーティング上にアタッチすると、彼らは一般的にデタッチされません。また、PLLコーティングは初期付着に役立ち、そして細胞は、さらに、それらが表面19に固定されたままに役立つ細胞外マトリックス（ECM）タンパク質を分泌成長します。将来の設計改善は、PDにペプチドを埋め込む含めることができますプラズマ処理およびPLLコーティング工程を排除する架橋時MSネットワーク。 プロトコルは、本明細書において、正常軸索整列、成長および髄鞘形成を誘導するために、表面異方性を発生工学的手法を記載しています。アプローチは、実験的に二つの方法で拡張することができます。まず、異方性の表面は、培養中の神経組織を作成するために適用することができ、 インビトロ神経路は、次いで、in vivoで移植することができます。第二に、表面異方性の概念は、ホストのSCから損傷部位および髄鞘形成の再生軸索の位置合わせを向上させるためにインビボで使用することができる移植可能な足場の設計に組み込むことができます。複数かつ複雑な装置20-22、ならびに成長因子の添加を必要とする他のアプローチと比較して、我々のプラットフォームは、比較的単純で適用が容易であり、そして両方の軸索アリを向上させるためにのみプレストレッチに依存します成長因子の添加を必要とせずgnment及び髄鞘形成。さらに、我々は簡単に他の細胞型に適用することができるMSCおよびDRGニューロンの両方で実験的なデザインでプレストレッチのこの概念をテストしています。現在の設計は、装置は、3 dimenstional細胞培養物の試験を可能にするためにアップグレードすることができたが、将来的に、2次元表面上の軸索成長を調べました。神経修復および移植における将来のアプリケーションは、制御放出薬物特性と共に、架橋ペプチドを含む生分解性の天然または合成材料から作られた移植可能な足場にプレストレッチを組み込むことができます。

神経損傷では、近位および遠位の神経断端はしばしば病変部位1-2に神経繊維束の直接の再編が防止されます。通常、軸索路は、接続の複雑なネットワークを形成する軸索の高度に秩序と整列束で構成されています。しかし、神経再生は不十分編成軸索整列3-4による無秩序なプロセスです。したがって、損傷部位を埋める軸索再生の十分な数を生成するためには、よく組織軸索整列を誘導することが必要です。さらに、脱髄は、損傷部位でのミエリン形成細胞の死による神経損傷を伴います。脱髄が強く軸索の生存導電容量を損なうので、脱髄をターゲットまたは再ミエリン化を促進する治療は、神経損傷5後の機能回復のために重要です。したがって、このプロトコルの目的は、これらの2つの問題に対処する工学的手法を説明することです神経再生の。 材料の物理的又は機械的性質に、異なる軸に沿って測定したとき、差として定義される面の異方性は、セルの配置、増殖、および遊走6-7に影響を与えるために適用されています。地形に加えて、異方性を誘導する他の方法があります。以前、我々は、ポリジメチルシロキサン（PDMS）膜の機械的静的プレストレッチによって誘発される表面異方性を調べました。 「小変形超大規模に課さ」の理論は、細胞が延伸方向に感知有効剛性は、垂直方向と異なり、有効剛性の違いは、表面異方性8によるものであること。予想しました予備延伸PDMS膜上で培養した間葉系幹細胞（MSC）は、積極的に表面を引っ張ることにより、結果として異方性を感知する事前延伸方向9に整列することができます。同様に、異方性表面AR機械的な事前延伸表面からイジングすると、アライメントに影響を与えるだけでなく、後根神経節（DRG）の成長と髄鞘形成は、10を軸索。ここでは、軸索再生10を強化するために、静的な事前延伸PDMS基板上の表面異方性を誘導するためのプロトコルを提供します。 軸索アライメント、目的のパターンを持つ地形的特徴を引き出すために、整列した繊維およびチャネル6,11-12を通じて接触ガイダンスを提供することが報告、軸索アライメント11,13を容易にするために実証されました。しかしながら、そのような繊維、チャネルおよびパターニングなどの地形的特徴を介して軸索整列を誘導するための技術が報告され、長く及び軸索の厚さを増加させることができませんでした。これとは対照的に、ストレッチング緩やかな機械的ストレッチ14の大きさに伴って増加長く、太く軸索との延伸方向における軸索アライメントにつながりました。しかしながら、 インビボでの電力供給のモータ装置を搭載することはありません実現可能。対照的に、静的な事前延伸誘導異方性は、より複雑で、より容易にインビボ用途のための将来の足場の設計に組み込むことができます。 このプロトコルでは、静的な事前延伸細胞培養系は、トポロジー特徴なし表面異方性を誘導するために使用されます。膜は、フレームに固定され、所定の伸びの大きさは、延伸ステージに適用されるところの事前延伸培養系は、PDMS膜、伸縮フレーム延伸ステージで構成されています。最大21日間の事前延伸表面上で培養新たに単離したDRGニューロンは軸索のアライメントおよび厚さのために監視されています。続いて、シュワン細胞（SCS）整列軸索と共​​培養は、髄鞘形成のために監視されます。プレストレッチ誘発される表面異方性を組み込むことによって、私たちはそれぞれ、MSCおよびDRGニューロン9-10のセルアライメント分化と軸索配向成長を促進することができました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane &#65288;PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium 1X</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement 50X</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax-I 100X</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax-I</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>11020-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Growth Factor-7S</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13290-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA</td>
			<td>GibcoBRL</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td><a href="http://www.trevigen.com/item/2/7/64/220/Cultrex_PolyLLysine/">3438-100-01</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p-6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-2 deoxy-uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30080.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPE</td>
			<td>Clonetics</td>
			<td>CC-4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>344270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone chamber</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>FlexiPERM ConA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaning/etching system</td>
			<td>March Instruments</td>
			<td>PX-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Thy 1.1 antibody</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>M7898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Complement</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S-7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard growth medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 &#956;l of NGF-- 7S (50 ug/ml).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDU and Uridine stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>then divide in 1 ml aliquots and store at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an approach to enhance alignment and myelination of dorsal root ganglion neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

予備延伸細胞培養系は、DRG軸索アラインメント10を推進します。 DRGニューロンは、12日間プレ延伸、未延伸表面上で培養しました。軸索は、それらの位置合わせを実証するために、β-IIIチューブリンを染色した。 図2は、培養の12日後に前延伸、未延伸PDMS基板上の軸索の向きを比較します。彼らは、ランダムな配向を示し、未延伸PDMS基板上の相互接続ネットワークを形成し、一方、DRG軸索は、延伸方向に平行に整列されます。 軸索整列を誘導することに加えて、プレストレッチ誘導異方性は、軸索の束形成を増強しました。接続された軸索のネットワークとは異なって、延伸表面に形成され、軸索の束に整列軸索は、未延伸の表面に観察しました。前延伸表面上のこれらの束状の束は、神経組織のTRに似ていました生体内での働きをする。 図3は、培養の21日後に前延伸、未延伸表面上のDRGニューロンの軸索を示しています。 図3のように、束状管と同様の登場バンドルを形成するために一緒に凝集し、予め延伸基板上に軸索を示します。これは、事前延伸面が神経組織の再生を増強するのに重要であるプレストレッチの方向に豊富な軸索成長を促進することができることを示唆しました。 髄鞘形成を評価するために、SCが整列軸索と共​​培養しました。 2週間の延伸、未延伸表面のDRGニューロンを培養した後、精製されたSCがチャンバーに添加し、さらに1週間培養しました。 図4では、共培養の軸索は、β-IIIチューブリン（緑）で染色され、そしてSCがP0（赤）で染色されています。 P0は、成熟したSCのマーカーであり、また、ミエリン鞘のコンポーネントですならびに髄鞘形成の指標を検討しました。延伸表面上の軸索に付着SCの挑発ではなく、緑と赤の汚れがランダムに分布している未延伸表面上の予め延伸表面上の緑と赤の重要な共局在は、あります。髄鞘形成のためのすべての重要な軸索アライメント、束状のような管形成、及び再生軸索へのSCの添付ファイルを、拡張された前延伸面。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54085/54085fig1.jpg" /> 図1：プレストレッチ手順のための回路図（a）は、PDMS膜の片を摺動可能なフレームの2つのストリップ上にクリップされます。装置のフレームは、約7 &quot;×5&quot;です。ブレースは約5である &quot;×1、中括弧にクランプが、約3&quot;×0.25 &quot;、そしてカップは約1.5である「直径ワイドオープントップ、1&quot;開放底部、および約0.25＆＃34;背の高いです。 （b）は 、ストレッチングステージ上にフレームを置き、10％の伸び率を適用するためにローラーを回し、その後、ネジを締めてストリップの位置を固定。 （c）は 、延伸段階からフレームを削除し、膜上にシリコンチャンバーを取り付けます。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54085/54085fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54085/54085fig2.jpg" /> 図2： プレ延伸・未延伸表面の軸索アライメント DRGニューロンの蛍光画像は、12日間（B）未延伸表面上に播種DRG細胞と比較して、12日間、（a）は静的プレ延伸表面に播種しました。軸索は未延伸制御面にランダムに整列しながら軸索は、前延伸方向に並びます。軸索sは抗マウスβ-IIIチューブリン一次抗体で染色し、10倍の対物レンズを用いた共焦点顕微鏡で画像化した。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54085/54085fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54085/54085fig3.jpg" /> 図 3： 軸索厚成長 DRG軸索の未延伸PDMS基板位相差画像対ストレッチ上の （a）の上には、21日後に未延伸面を伸ばし、および（b）。未延伸表面に軸索が相互接続された軸索のネットワークを形成しながら伸ばし表面上の軸索は​​、厚い束を形成しました。画像は10倍の対物レンズを用いて逆位相差顕微鏡を用いて撮影した。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54085/54085fig3large.jpg" target="_blank">アルを表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図のargerバージョン。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54085/54085fig4.jpg" /> 図4は： 未延伸PDMS基板対ストレッチ上に整列DRG軸索とのSCを共培養 2週間の延伸、未延伸表面上に培養した後、精製されたSCがチャンバーに添加し、さらに1週間培養しました。延伸表面上の軸索のための（a）は、β-IIIチューブリン（緑）染色; （b）は、β-IIIチューブリン（緑）のオーバーレイ、P0（赤）は、延伸表面に染色します。未延伸表面上の軸索のための（c）の β-IIIチューブリン（緑）染色; （d）の未延伸表面上のβ-IIIチューブリン（緑）、P0（赤）染色のオーバーレイ。前延伸表面には、赤と緑の汚れが共存し、示唆SCがに取り付けられ、おそらく軸索をミエリン形成されています。未延伸で表面は、赤と緑の汚れがランダムに軸索に取り付けられていないのSCを示唆し、分散されています。スケールバー=100μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54085/54085fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

後根神経節ニューロンのアライメントや髄鞘形成を強化するためのアプローチ

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.4K ビュー.  Michigan State University. This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

ビデオ: An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

神経科学

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

根神経節ニューロンと差別化された脂肪由来幹細胞を背：<em&gt;インビトロ</em末梢神経再生を研究するために&gt;共培養モデル

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

後根神経節モデル：癌性神経浸潤のin vitroモデルでは

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

後根神経節インジェクションおよび後根感覚軸索再生のためのモデルとして傷害をつぶします

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

腰部後根神経節のアクセスと豚注入の椎

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of the PNS are affected by injury and disease, affecting the nerve function and the capacity for regeneration. Neuronal immune cells are commonly analyzed by immunofluorescence (IF). While IF is essential for determining the location of the immune cells in the nerve, IF is only semi-quantitative and the method is limited to the number of markers that can be analyzed simultaneously and the degree of surface expression. In this study, flow cytometry was used for quantitative analysis of leukocyte infiltration into sciatic nerves or dorsal root ganglions (DRGs) of individual mice. Single cell analysis was performed using DAPI and several proteins were analyzed simultaneously for either surface or intracellular expression. Both sciatic nerves from one mouse that were treated according to this protocol generated &#8805; 30,000 single nucleated events. The proportion of leukocytes in the sciatic nerves, determined by expression of CD45, was approximately 5% of total cell content in the sciatic nerve and approximately 5-10% in the DRG. Although this protocol focuses primarily on the immune cell population within the PNS, the flexibility of flow cytometry to measure a number of markers simultaneously means that the other cells populations present within the nerve, such as Schwann cells, pericytes, fibroblasts, and endothelial cells, can also be analyzed using this method. This method therefore provides a new means for studying systemic effects on the PNS, such as neurotoxicology and genetic models of neuropathy or in chronic diseases, such as diabetes.

Quantitative analysis of cell content within the murine sciatic nerve is difficult due to the scarcity of the tissue. This protocol describes a method for tissue digestion and preparation that provides sufficient cells for flow cytometry analysis of immune cell populations from nerves of individual mice.

単一の坐骨神経とフローサイトメトリーを使用して単一のマウスの後根神経節における免疫系細胞の解析

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

伝達物質の放出を勉強する後根神経節細胞の分離と培養

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

成体マウス後根神経節の調査の哺乳類の軸索の再生: In Vivoエレクトロポレーション

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for nerve fibers in the central and peripheral nervous systems. This method is particularly applicable to dorsal root ganglia (DRG), which are primary sensory neurons that exhibit a pseudo-unipolar structure of nervous processes. The patterns and features of the action potentials passed along axons are recordable in these neurons. The present study uses in vivo single-fiber recordings to observe the conduction failure of sciatic nerves in complete Freund&#8217;s adjuvant (CFA)-treated rats. As the underlying mechanism cannot be studied using in vivo single-fiber recordings, patch-clamp-recordings of DRG neurons are performed on preparations of intact DRG with the attached sciatic nerve. These recordings reveal a positive correlation between conduction failure and the rising slope of the after-hyperpolarization potential (AHP) of DRG neurons in CFA-treated animals. The protocol for in vivo single fiber-recordings allows the classification of nerve fibers via the measurement of conduction velocity and monitoring of abnormal conditions in nerve fibers in certain diseases. Intact DRG with attached peripheral nerve allows observation of the activity of DRG neurons in most physiological conditions. Conclusively, single-fiber recording combined with electrophysiological recording of intact DRGs is an effective method to examine the role of conduction failure during the analgesic process.

Single-fiber recording is an effective electrophysiological technique that is applicable to the central and peripheral nervous systems. Along with the preparation of intact DRG with the attached sciatic nerve, the mechanism of conduction failure is examined. Both protocols improve the understanding of the peripheral nervous system&#39;s relationship with pain.

インビボシングルファイバー記録と無傷の後部根神経を用いて伝導障害のメカニズムを調べる

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for ...