This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.

1.創意工夫パスウェイ解析<ol><li>アップロードタンパク質 - インタラクトームデータセット<ol><li>彼らのユニークな遺伝子識別子（質量分析データで得られたとして、好ましくは、遺伝子記号および遺伝子識別番号）とのスプレッドシートで目的のタンパク質/遺伝子を挿入します。 </li><li>遺伝子識別番号と観測値の1列（ 例えば 、倍数変化またはp値）のためのスプレッドシートの1列を割り当てます。列見出しを表示するには、「列ヘッダーが含まれている」オプションを選択します。 </li><li>アップロードデータセット]タブをクリックし、上記のスプレッドシートを選択することにより、IPAにデータセットをアップロードします。柔軟なフォーマット]タブを選択し、遺伝子識別子の適切なカテゴリを選択します。 注：データセットの柔軟なフォーマットは、アップロードのフォーマット仕様を克服します。 </li><li>データセットが表示されたら、IDと観測列を選択します。質量-SPによるタンパク質の全て（MRP4のインタラクトームを識別されることを確認してくださいectrometry）データセットの概要]タブで確認することによりマッピングされています。データセットは、今所望の分析のために準備ができています。 </li></ol></li><li>データ分析 注：この研究のために使用したIPAの機能の部分的な用途が記載されています。 <ol><li>一意の識別子としてそれらの遺伝子名でMRP4のインタラクトームをアップロードした後、新しいをクリックして、IPAソフトウェアの左上のメニューで、コアの分析を選択します。 </li><li>実験の種類に応じた強度のために発現カットオフ値を設定します（100の強度値は、分析のために推奨されます）。 </li><li>対照および実験条件が関与しているとの比較分析を実行する必要がある場合は、データセットファイルの一部として含まれている場合、データセットを準備しているときに、発現の倍数変化を計算する（1.5倍の変化のカットオフ値は、通常、分析のために推奨されます）。 注：コア解析の終了後、分析の複数のセクションを得ることができます。最初のタブは、番目の概要を示していますeは、総分析し、他の人の間でトップカノニカル経路、上流調節因子、分子や細胞機能、およびネットワークを示唆しています。すべての信頼レベル（p値）に基づいて計算し、p値の昇順に並べ。 </li><li>絵重複クロストーキングを示す（オープン経路オプションを使用して）主要な標準的な経路のような大きな分子ネットワークを開き、シグナル伝達経路に影響を与えました。 すぎなかっp値に基づいて関与している標準的な経路のリストを見た（p &lt;0.05を有意であると考えられます）。 注：カノニカル経路の有意値は、右尾のフィッシャーの直接確率検定によって計算されます。意義だけでは偶然によって標準経路を持つデータセットからの分子の会合の確率を示します。 </li><li>各経路に関与するタンパク質のリストの間で入力タンパク質（質量分析によって識別されるようMRP4のインタラクトーム）を確認してください。 注：このOPTIOを使用してnは、それは、細胞のアクチン細胞骨格のシグナリングネットワークは、入力されたタンパク質は、それに合う主要な影響を受ける経路および方法（ 図1）であることが観察されました。このアプローチは、分子ネットワークが密接に関連しており、試験タンパク質によって影響を受けるかを識別するのに役立ちます。 </li><li>潜在的にフォーカス分子の数に基づいて、特定のタンパク質のネットワークにリンクされているトップ疾患や機能を識別するための分析で、ネットワーク]タブを使用します。 文学の知識と実験的証拠を介して、スコア値は、ネットワークなどの一部として決定される既知のタンパク質に基づいて付与され、携帯アセンブリおよび組織のネットワークとデータセットから識別され、ネットワークの一部となっている分子を集中：注意。今後、ネットワークは、フォーカス分子の数に基づいて、最初に濾過されます。 </li></ol></li></ol> 2.高含量顕微鏡<ol><li>細胞の調製 注：すべての細胞培養作業は、水平流動細胞培養フード下で行いました。 <ol><li>創傷治癒アッセイのための96ウェルマイクロプレートを使用してください。 </li><li> （PBS中で再構成）を1％フィブロネクチン溶液でコートマイクロプレートを、2時間、37℃で、標準的なCO 2インキュベーター内でプレートを保持します。 </li><li> / - - MRP4を削除し、インキュベーターから25 cm 2の細胞培養フラスコ中で増殖させMRP4 + / +マウス胚性線維芽細胞（MEFに）、PBSで1回洗浄し、4倍のトリプシン-EDTA溶液1mlを用いて5分間、細胞をトリプシン処理。 </li><li>完全培地で細胞を洗浄（DMEM、10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含有する）、完全培地5mlに再懸濁。 </li><li>ウェルからフィブロネクチンソリューションを吸引。血球計数器を用いて細胞を計数し、各ウェルに（細胞数、細胞の種類に基づいて最適化する必要がある）30,000細胞を播種します。 </li><li>標準で100％コンフルエンスまで細胞を増殖させます24時間、37℃でCO 2インキュベーター。 </li></ol></li><li>傷の作成<ol><li>すべてのウェルが溶液で満たされていることを確認します。創傷製造工具の損傷を防止するためにPBSで、未使用のウェルを満たす（ 例えば 、WoundMaker）。 </li><li> 100％の細胞集密度を確認した後、金属ベース板上に巻か製造ツールの内側96ウェルプレートに配置し、96ウェルピンブロックを押し下げ。 </li><li>任意の外れ細胞を除去し、完全培地100μlを追加するために、PBSで細胞を3回洗浄します。 </li><li>試験化合物を追加 - H-89（50μM; 1：DMSO中の50mMのストックを使用して完全なメディア1,000希釈）またはラトランキュリンB（1μM; 1：DMSO中で1 mMのストックを使用して完全なメディア1,000希釈）この段階で。 </li><li> 37℃でリーダーの内部アッセイプレートを配置し、実験期間にわたって移行を監視します。 </li></ol></li><li>モニタリング細胞遊走 注：細胞遊走は、顕微鏡およびソフトウェアPRを用いてモニターしました。高コンテンツ顕微鏡システムでovided。傷が自動的に顕微鏡で監視し、ソフトウェアによって登録されることを保証する96ウェルマイクロプレートを使用します。 <ol><li>スケジュールスキャン]タブを使用して、遊走アッセイのためのアッセイプレートを時間ごとにスキャンするようにソフトウェアを設定します。少なくとも15分のイメージングの前に平衡化を可能にするために、読者の内側アッセイプレートを配置した後、開始時刻を選択します。 </li><li>トレイを選択して、容器の種類（96ウェルマイクロプレート）と、実験の種類（スクラッチ傷）を選択します。 </li><li> 10倍対物レンズを選択し、位相コントラスト撮像パラメータを選択します。編集スキャンパターンオプションを使用してスキャンする必要がある井戸を選択します。 </li><li> [プロパティ]タブを選択し、プレートマップを設定することにより、治療グループと任意の複製を指定します。スキャンは、実験条件に基づいて、いつでも停止することができます。 </li></ol></li><li>データ分析<ol><li>スキャンが完了した後、アッセイプレート用の容器ビュー]タブを選択します。 G解析ジョブユーティリティへoおよび新しい分析ジョブを起動する]を選択します。 </li><li>ジョブの種類としてスクラッチ傷を設定し、分析（24時間の時点を0時点）の時間範囲を選択します。 </li><li>よく上のシングルクリックによる分析のために選択される井戸を選択して、分析を開始するために「OK」をクリックします。解析が完了すると、グラフィカルにグラフオプションへの輸出を使用して、各時点で各ウェルについて相対的創傷密度（RWD）のデータを視覚化します。 </li><li>各ウェルビュー画像]タブを使用して、異なる時点に対応する位相コントラスト画像のセットを表示します。プレートのマップをクリックすることで、特定の十分を選択し、時間範囲]タブから特定の時点を選択して、ビューの画像]タブをクリックします。 </li></ol></li></ol> 3.蛍光共鳴エネルギー移動（FRET） <ol><li>細胞の調製<ol><li> （セクション2.1で説明したように）でそれらを保つため、1％のフィブロネクチン溶液100μlでコート35ミリメートルのガラス底の皿2時間37℃で、標準的なCO 2インキュベーター。 </li><li>プレートと完全培地中でHEK293細胞（10,000細胞/プレート）の種子同数からフィブロネクチンソリューションを吸引。 </li><li> 24時間、37℃で、標準的なCO 2インキュベーター内でフィブロネクチンコーティングされたガラス底皿に60から70パーセントコンフルエンスまで細胞を増殖させます。 </li></ol></li><li>トランスフェクション<ol><li>製造業者の指示に従って商業トランスフェクション試薬を使用して、すべての一過性トランスフェクションを行います。 </li><li>小分けした各35mm皿のための2つの別個の1.5ミリリットル滅菌遠心チューブに完全培地250μlの。 </li><li>別のチューブにトランスフェクション試薬の（2.5 DNA濃度を倍）1管および5μlのDNA（pmAKAR3またはpmAKAR3-TA）2μgのを追加します。 </li><li>室温で20分間チューブをインキュベートした後、トランスフェクション試薬を含有するチューブに希釈したDNAを移します。 </li><li>完全に混合し、37℃でインキュベートさらに30分間℃です。 </li><li>細胞から培地を吸引除去し、PBSで一度洗っ。細胞に10％FBSを含有する抗生物質を含まないDMEM F-12培地1ml加えます。 </li><li> 、各プレート中の細胞にメディアとのDNA-脂質複合体の507μl加え穏やかに混合し、48時間、37℃でCO 2インキュベーター内で保管してください。 2μgのDNA（1μgの/μlのストック）と各プレートで10,000〜50,000細胞のための5μlの脂質を使用してください。 </li></ol></li><li>生細胞イメージング<ol><li>トランスフェクションの48時間後、増殖培地を除去し、ハンクス平衡塩溶液（HBSS、37℃で予め温めて2倍の細胞を洗浄 °C）。カスタムメイドの37°Cの内部にFRETイメージングのために反転広視野顕微鏡システム上で洗浄した細胞に1.9ミリリットルのHBSSの最終容量を追加し、それらをマウントするには、チャンバを維持しました。 注：このシステムでは、励起光を50％の光transmiss中性濃度フィルタを用いて減衰300Wのキセノンランプによって提供されますイオン。 </li><li> 60Xの対物レンズを使用してください。手動細胞に焦点を当て、顕微鏡を使用してビューの最適なフィールドを設定します。ソフトウェアに焦点を当て、「F」オプションを使用して、コンピュータ画面上のビューの選択したフィールドをアクティブにします。 FRET測定を実行するため、適切なフィルターセットCFPとFRETのための30分の535 nmのための25分の430 nmの励起フィルター、二重のダイクロイックビームスプリッタ、および2つの発光フィルタ（30分の470 nmのと設定（CFP / YFPフィルター）を選択手動で。 </li><li>最初のオープンフッ素タブをクリックし、続いてチャネルオプションCFP / YFP / FRETにチェックすることにより、蛍光を可視化します。カメラ]タブで強化ツールを使用して、信号強度を向上させます。 </li><li>信号強度の飽和を回避pmAKAR3またはpmAKAR3-TAを発現しているセルを選択。 FRET測定を開始するために、キャプチャウィンドウを使用します。 </li><li>タイムラプスオプションとセットアップ30秒間隔で30分間の時間スキャンを選択します。 FRETオプションをチェックし、100ミリ秒の露光時間を設定します。画像ラベルANを入力してくださいDを押して測定を開始するために開始します。 </li><li> 5時間点とベースラインの確立した後、プレートを乱すことなく細胞にフォルスコリンの25μM（HBSS100μlで希釈し、エタノール中10μMの株式の5μLを、）追加し、合計30分間細胞を監視します。 </li></ol></li><li>データ分析 注：データ分析のために使用するレシオメトリック計算モジュールを。 <ol><li>画像ウィンドウの左側の選択ツールをクリックし、ドロップダウンメニューから塗りつぶした長方形を選択します。無細胞領域の画像フィールド上の四角形をドラッグし、右のバックグラウンド減算の目的のための背景として設定するためにそれをクリックしてください。 </li><li>マスクに移動し、オプション「新しいマスクを作成」を使用します。選択ツールに移動し、手動測定のためにそれを選択するために、細胞の周りにマスクを描画するためにドロップダウンメニューからペンを選択します。条件ごとに少なくとも4-6セルを選択します。 </li><li>マスク]タブを選択し、マスクの統計を行います。 </li><li> 「全体のマスク」をチェックし、クロスチャネルオプションを選択し、ドナー正規化されたFRET（N-FRET）（FRET / CFP）を展開します。 N-FRET値は、原形質膜におけるPKA活性を表します。 </li><li>ルックアップテーブルとスケールバーをアノテーションを使用して、タイムスタンプを追加します。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts14. In contrast to the conventional scratch wound assay, the microscopy here conducts the wound healing assay in an automated convenient, consistent and high-throughput manner. The software analyzes the cell migration rate based on three separate metrics: i) change in wound width, ii) change in cell confluence within the wound region, and iii) relative wound density (RWD). RWD is a self-normalized metric that measures the spatial cell density inside the wound area relative to the spatial cell density outside of the wound area. Therefore, it is not affected by changes in cell density due to cell proliferation and provides very specific information regarding cell migration which is otherwise difficult to be obtained by the conventional scratch wound assay26. Initially, at the 0 time point, the RWD will be 0% and upon complete wound healing, the RWD will be 100%. All of these metrics are calculated by custom-made software with inbuilt algorithms and the migration information is automatically generated for every time point. The assay is easy to perform but proper washing (70% ethanol) and handling (inside the hood) of the wound-maker is important to prevent contamination. Our data suggested that the RWD kinetics for Mrp4-/- MEFs are significantly higher compared to Mrp4+/+ MEFs.
During migration, cells polarize into leading and trailing edges that ultimately pull the cell body toward the direction of migration1,27. Distinct and segregated signaling events at different regions of a moving cell ensure the polarization process. Polarized accumulation of cAMP and subsequent activation of PKA at the leading edge is a key early step in directional cell migration5. Since MRP4 has very high affinity for cAMP (Km = 45 &#181;M)12, we hypothesize that the effect of MRP4 on cell migration is cAMP-dependent. To identify the proteins acting downstream of MRP4 and simultaneously interacting with MRP4, we characterized MRP4-containing macromolecular complexes by mass-spectrometry. The MRP4 interactome was subjected to multiple analyses including generation of protein networks, path maps, and functional integration to the canonical pathways of the cellular signaling and their respective pictorial representation through the use of IPA. In general, IPA allows scientific users to recognize the molecular and physiological contexts of their genes and proteins of interest. However the analysis is completely based on the literature and experimental evidences. Novel interactions cannot be suggested by IPA. But it can identify which network, the proteins of interest, can potentially form. Additionally users can identify the top diseases and functions that are potentially linked to a particular protein network based on the confidence level (P value). Of interest to our study, the actin cytoskeleton pathway was a major affected pathway with a P value of 6.75 x 10-4. This comprehensive approach also revealed that F-actin is a major protein target for MRP4 and cAMP is the key mediator17. Based on these data, we further studied the underlying molecular mechanisms.
To understand the effect of MRP4 on cAMP dynamics and PKA activity during the course of cell migration, we used FRET-based live-cell imaging techniques. Using FRET-based sensors for cAMP and PKA activity, we confirmed higher cAMP accumulation and higher PKA activity at the leading edge of migrating and polarized fibroblasts22,28. We further demonstrated that in the absence of MRP4, MEFs have more polarized cAMP and PKA activity, which in turn facilitates cortical actin formation and cell migration. The high-content microscopy-based wound-healing assay showed that the effect of MRP4 on cell migration is completely abolished by PKA inhibition or actin disruption, which indicates a direct role of PKA and actin as downstream targets17. Unlike conventional cell population-based assays such as ELISA, use of a FRET-based sensor allows us to identify the downstream effector kinases that regulate various signaling processes and detect the correlation between cyclic nucleotide dynamics and their corresponding kinase activity in real time and space. Additionally it can discriminate intracellular and intercellular heterogeneity during the signaling events. For example it can detect the difference in PKA dynamics in the cells at the wound edge compared to the cells inside the monolayer and away from the wound edge5, whereas ELISA based assays can only detect total intracellular cyclic nucleotide or PKA level in a sample14,17. However the transfection efficacy of particular cell types can be a limiting factor for conducting FRET based assays but the highly efficient transfection reagents can overcome this problem.
Together, our results indicate that in addition to conferring drug resistance, MRP4 also plays important physiological roles by modulating intracellular cAMP dynamics. Using three unique approaches, i) high-content microscopy18, ii) IPA15, and iii) FRET5,28, we have begun to unravel the previously undefined role of MRP4 in cell migration. In general, these useful scientific techniques will allow us to identify new downstream targets of any protein of interest and explore novel molecular mechanisms involved in particular pathological or physiological cell responses. Where IPA provides useful information regarding downstream effectors of the protein of interest and potential regulatory networks; FRET-based live imaging can monitor compartmentalized signaling in real time. High-content microscopy is a convenient high-throughput screening tool to monitor and analyze physiological events, such as cell migration and cell proliferation, over a period of time as a final readout.

細胞移動は、複雑な多段階プロセスです。研究は、移行細胞中に前縁及び後縁に分極されていることを示しています。細胞外マトリックスに付着することで、先端が前方に移動するための細胞体に必要なトラクションを提供します。最後に、エッジのリリースに末尾の後部アタッチメントとは、移行サイクル1,2を完了します。 効率的な細胞移動のための細胞の分極は、細胞内シグナル伝達の空間的な分離によって調節されます。また、cAMPなどの細胞のセカンドメッセンジャー、微調整の方向性細胞遊走3,4に必要なシグナル伝達事象の区画化を媒介します。リーディングエッジでcAMPおよびcAMP依存性キナーゼPKA活性の優先的な蓄積は、方向性細胞遊走5,6において重要な役割を果たしています。このようなRas関連C3ボツリヌス毒素基質（RAC）と細胞分裂制御タンパク質42ホモログまたはCdc42の、PKなどの低分子量GTPaseをリン酸化することにより、Aは、立ち上がりエッジでアクチン関連タンパク質2/3（アープ2/3）を活性化し、葉状仮足7-9の形成を誘導します。 PKAはまた、抗キャッピング剤をリン酸化し、血管拡張剤は、それによって、膜の伸縮10,11の振動周期を調節し、リンタンパク質（VASP）を刺激しました。 膜結合型排出トランスポーター3によって輸送アデニル酸シクラーゼによってI）の合成、ホスホジエステラーゼによってii）の劣化、及びiii）：細胞では、cAMPレベルは、3つの主要なプロセスによって規制されています。多剤耐性タンパク質4（MRP4）、膜輸送体のATP結合カセット（ABC）ファミリーのメンバー、環状ヌクレオチドの内因性の排出トランスポーターとして機能します。したがって、MRP4は11-13シグナル 、細胞内cAMPレベルおよびcAMP依存性細胞を調節することができます。 - / -線維芽細胞は、環状ヌクレオチドの比較的高いレベルを含有し、より速いCを移行我々は以前MRP4であることを示しましたMRP4 + / +線維芽細胞14にompared。我々はまた、線維芽細胞の遊走上の環状ヌクレオチドの二相性の効果を報告しました。以前の研究に基づいており、MRP4がという我々の発見- / -線維芽細胞は、移行の過程でより多くの偏光のcAMPが含まれている、我々は、線維芽細胞の遊走のこのMRP4媒介性調節は、cAMPのが依存しているという仮説を立てました。下流側の機構を理解するために、我々は直接まだ多面的なアプローチを取りました。 関連するとMRP4との相互作用中のタンパク質を同定するために、我々は以上のMRP4を発現するHEK293細胞からMRP4含有高分子複合体を免疫沈降させました。質量分析を使用して、我々は、複数のMRP4相互作用タンパク質を同定し、創意工夫パスウェイ解析（IPA）を使用して、それらの相互接続性を分析しました。 IPAは、（構造的および機能の両方）タンパク質 - タンパク質相互作用を分析し、特定の生理学的および病理学における彼らの貢献を探求するための有用なツールであります文学と実験的証拠15,16に基づいてイベント。 IPAは、F-アクチンは、cAMPおよびcGMPのは、分子17シグナル伝達の鍵となる細胞遊走の文脈におけるMRP4の主要な下流標的であることを示しました。これらのデータはさらに、高含有量顕微鏡により確認しました。高コンテンツ顕微鏡は、より便利で正確かつ高スループットの方法18に、このような細胞遊走などの細胞挙動をキャプチャし、分析することができます。高コンテンツ顕微鏡データは、線維芽細胞の遊走にMRP4の影響を完全にPKA 17のアクチン細胞骨格または阻害の破壊時に廃止されていることを実証しました。 さらに、我々は、リアルタイムでの細胞の移行にPKA動態をモニ​​ターするためにPKAセンサーベースの蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用います。 FRETベースのキナーゼセンサーは通常、CFPとYFPの蛍光団19-21によって隣接特異的リン酸化基質ペプチドで構成されています。 pmAKAR3が向上し、私れますmbraneはフォークヘッド関連ドメイン1（FHA1）とPKA基質配列LRRATLVD 5,22が含まれているFRETベースのPKAセンサーをターゲットに。 PKA触媒サブユニットの増加によりpmAKAR3のリン酸化は、CFPとYFP 19との間の信号をFRET。センサーへの脂質修飾ドメインの挿入は、特に、膜区画23において、PKA動態を監視するための原形質膜に標的化します。 pmAKAR3を使用して、我々は実証そのMRP4の移行の前縁- / -今度はセルの前縁17での皮質アクチン形成を増加MRP4 + / +線維芽細胞、より多くの偏PKA活性を示した線維芽細胞。一緒に、これらのイベントは、MRP4の不在下でより良い携帯偏光と速い方向性細胞遊走をもたらしました。当社の特定と直接的なアプローチは、MRP4のための鍵下流標的を同定し、重要なを提供していますが、として線維芽細胞の遊走のMRP4依存性調節のためのまだ未踏のメカニズム。

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen(Carlsbad, CA)&amp;nbsp;</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&amp;nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well IncuCyte Image-Lock microplates&amp;nbsp;</td><td>Essen BioScience</td><td>4493</td><td></td></tr><tr><td>Latrunculin B</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).</td><td>L5288</td><td>Stock in DMSO</td></tr><tr><td>H-89</td><td>Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)</td><td>BML-EI196</td><td>Stock in DMSO</td></tr><tr><td>35 mm glass-bottomed dishes&amp;nbsp;</td><td>(MatTek Corporation; Ashland, MA)</td><td>P35G-1.5-20-C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Media</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&amp;nbsp;</td><td>31985-088</td><td></td></tr><tr><td>FRET microscopy system</td><td>Olympus inverted microscope (IX51)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD camera&amp;nbsp;</td><td>Hamamatsu, Japan</td><td>ORCA285</td><td></td></tr><tr><td>SlideBook software 5.5</td><td>Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity Pathway Analysis software</td><td>IPA, QIAGEN Redwood City,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris (Ellisville, MO).&amp;nbsp;</td><td>1099</td><td>Stock in 100% EtOH</td></tr><tr><td>DMEM F-12&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&amp;nbsp;</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&amp;nbsp;</td><td>14025-134</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen(Carlsbad, CA)&amp;nbsp;</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution (TE)</td><td>Invitrogen(Carlsbad, CA)&amp;nbsp;</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen(Carlsbad, CA)&amp;nbsp;</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

methods to study mrp4-containing macromolecular complexes in the regulation of fibroblast migration

多剤耐性タンパク質4（MRP4）膜トランスポーターのATP結合カセットファミリーのメンバーであり、環状ヌクレオチドの内因性の排出トランスポーターです。細胞内の環状ヌクレオチド濃度を調節することにより、MRP4は、細胞遊走を含む複数の環状ヌクレオチド依存性細胞事象を調節することができます。以前、我々は、MRP4の非存在下で、線維芽細胞は、細胞内の環状ヌクレオチドのより高いレベルを含有し、より迅速に移行することができることを実証しました。この知見の根底にあるメカニズムを理解するために、我々は直接まだ多面的なアプローチを採用しました。まず、質量分析に続いて免疫沈降法を用いて、MRP4過剰発現細胞系からMRP4の潜在的な相互作用タンパク質複合体を単離しました。 MRP4のインタラクトームに固有のタンパク質を同定した後、我々は、シグナル伝達との関連でこれらのタンパク質 - タンパク質相互作用の役割を探求するために工夫経路分析（IPA）を利用します。私たちは、経口解明しました細胞遊走のMRP4の効果の主要なメディエーターとして細胞移動におけるMRP4タンパク質複合体と同定されたF-アクチンのtential役割。この研究はまた渡り鳥の現象におけるキープレーヤーとしてのcAMPおよびcGMPの役割を強調しました。高含量顕微鏡を用いて、我々は、細胞遊走アッセイを行い、繊維芽細胞の遊走にMRP4の影響を完全にcAMP依存性キナーゼA（PKA）のアクチン細胞骨格又は阻害の破壊によって廃止されることを観察しました。リアルタイムでの移行のセルに変調をシグナリングを可視化するために、我々はPKA活性を測定するためのFRETベースのセンサーを利用し、見つかった、MRP4の移行の前縁近くでより多くの偏PKA活性の存在- / -と比較して、線維芽細胞、MRP4 + / +線維芽細胞。これにより、皮質のアクチン形成を増加し、移行のプロセスを増強しました。我々のアプローチは、MRP4の下流に作用するタンパク質の同定を可能にし、オーバーを提供してくれます線維芽細胞の遊走のMRP4依存性調節に関与する機構の眺め。

線維芽細胞遊走に対するMRP4の影響を研究するために、我々は、高含量の顕微鏡14を用いた創傷治癒アッセイを使用します。正確な創傷から単離されたMEFのコンフルエントな単層上で行われたいずれかのMRP4 - / -またはMRP4 + / +マウス、および画像は24時間を1時間間隔で採取しました。 MRP4 + / + MEFを（ 図2）と比較したMEF - / -私たちは、MRP4のために、より高い移動速度を観察しました。 MRP4 + / + MEFのは、傷をカバーするために、ほぼ20時間を要したのに対し、MEFを- / -傷は完全にMRP4未満15時間で癒されました。 移動細胞の先端のPKA活性の偏蓄積は、方向移動のための重要な初期の事象です。 PKA活性は、リアルタイムusinでモニターすることができますPKA 5,17のためのグラムpmAKAR3 FRETベースのセンサー。 PKA活性のためpmAKAR3の特異性を確認するために、我々は、PKAのための基板領域のスレオニンからアラニンへの変異が含まれているため、25μMのフォルスコリンとPKAリン酸化に反応のないですpmAKAR3または点変異体pmAKAR3-TAを、過剰発現するHEK293細胞を処理しました、cAMPの誘発剤14。私たちはpmAKAR3を過剰発現する細胞におけるFRETシグナルの増加を見つけましたが、pmAKAR3-TAを過剰発現する細胞は（ 図3）変わりませんでした。基礎はレベルがpmAKAR3-TAを発現する細胞と比較してもpmAKAR3を発現する細胞のための高かったFRET。これらのデータは、pmAKAR3はPKA活性に非常に特異的であることを示しました。 要約すると、プロトコルセクションに記載された方法は、特定の細胞事象に関連する分子メカニズムを研究するための有用なツールです。 <img alt= &quot;図1&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 53973 / 53973fig1.jpg&quot; /&gt; 図1：MRP4インタラクトームの創意工夫パスウェイ解析（IPA）IPAアクチン細胞骨格の経路を使用しては、MRP4のインタラクトームの影響を受け、主要な標準的な経路の一つとして同定されました。発表アクチンシグナル伝達ネットワークは、接続されたタンパク質（白）と文学と実験的証拠から推測MRP4のインタラクトーム（ピンク）で同定されたタンパク質との相互通信を示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53973/53973fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53973/53973fig2.jpg" /> 図2：創傷治癒アッセイハイコンテント顕微鏡 MRP4 + / + および MRP4を 使用して - / - 。 マウス胚線維芽細胞（MEFが）fibrone上で増殖させましたctin-コーティングした96ウェルディッシュ、及び単層で傷を正確に96ピンの傷メーカーを使用して作成しました。異なる時点での代表的な画像は10倍の倍率で示されている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53973/53973fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53973/53973fig3.jpg" /> 図3：蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）がpmAKAR3センサを用いてPKA活性の測定をベース 60X倍率でN-FRETの代表的な疑似カラー画像フォルスコリン処理の前と後のpmAKAR3センサとpmAKAR3-TAセンサでトランスフェクトされたHEK293細胞のためのものです。示す（上パネル）。各パネルの画像は同じ視野から捕捉しました。カラーバーは、N-FRETの大きさを示しています。折れ線グラフ（下のパネル）はtreatmen後のN-FRETレベルの変化を表しフォルスコリンとトン。データ（平均±SEM; n = 3）を少なくとも3つの独立した実験の平均を表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53973/53973fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

MRP4は、細胞遊走における最近明らかに役割を含む種々の環状ヌクレオチド依存性シグナル伝達事象を調節します。我々は、線維芽細胞の遊走の微調整調節に重要な役割を果たしているユニークなMRP4のインタラクトームの識別結果としてMRP4の下流の分子標的を解明するために、直接、しかし、多面的なアプローチについて説明します。

線維芽細胞移動の調節にMRP4含有高分子複合体を研究するための方法

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

methods-to-study-mrp4-containing-macromolecular-complexes-regulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.7K ビュー.  Cincinnati Children’s Hospital Medical Center.  MRP4は、細胞遊走における最近明らかに役割を含む種々の環状ヌクレオチド依存性シグナル伝達事象を調節します。我々は、線維芽細胞の遊走の微調整調節に重要な役割を果たしているユニークなMRP4のインタラクトームの識別結果としてMRP4の下流の分子標的を解明するために、直接、しかし、多面的なアプローチについて説明します。 

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Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

ロイコトリエンBのリアルタイムイメージング 4介在細胞の移行とβ-アレスチンとBLT1の相互作用

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

免疫・感染学

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

三次元マトリックスの蛍光タグ付きタンパク質を発現する遊走細胞の生細胞イメージング

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

生物工学

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

生きた細胞の細胞内レベルでの秒のタイムスケールの上に小さなGTPase活性の時空間操作

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global reorganization and realignment of the gel microstructure. This process proceeds in a complex manner that is dependent in part on the interplay between the location of the cells, the geometry of the gel, and the mechanical constraints on the gel. To better understand how these variables produce global fiber alignment patterns, we use time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy coupled with an environmentally controlled bioreactor to observe the compaction process between geometrically spaced explants (clusters of fibroblasts). The images are then analyzed with a custom image processing algorithm to obtain maps of the strain. The information obtained from this technique can be used to probe the mechanobiology of various cell-matrix interactions, which has important implications for understanding processes in wound healing, disease development, and tissue engineering applications.

Time-lapse microscopy and image processing techniques were used to observe and analyze fibroblast-mediated gel compaction and fibrin fiber realignment in an environmentally controlled bioreactor over a 48 hr&#160;period.

線維芽細胞媒介フィブリンゲル圧縮の観察と定量

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

微細加工チャネルにおける細胞移動の研究

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

同心円状のゲルシステムは、3D細胞移動に対するマトリックスの微小環境の生物物理役割を研究する

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

三次元培養細胞遊走を特徴付ける傷の環境

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

生物学

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

線維芽細胞移動の調節にMRP4含有高分子複合体を研究するための方法

要約

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ロイコトリエンBのリアルタイムイメージング₄介在細胞の移行とβ-アレスチンとBLT1の相互作用