We thank Saran Kupul for technical assistance. This work was supported in part by NIH grant R01-AI104952 to FW. Further support was provided by the University of Alabama at Birmingham (UAB) Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI027767) that was made possible by the following NIH Institutes: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.

1.バイオフィルム開始<ol><li>栄養豊富な培地中でバイオフィルム産生生物の文化を育てます。グリセロールストックからミューラーヒントン培地10mlに黄色ブドウ球菌株ニューマンを接種します。 S.の取り扱いに関わるすべての作業を実行します手袋と安全キャビネット内球菌 。 </li><li>ロータリーシェーカー（100〜200回転）に37℃で16時間インキュベートします。 </li><li>分光光度計と標準キュベット（：1センチメートル経路長）を用いて培養のOD 600を決定します 。 </li><li>式を使用してchelexedロズウェルパーク記念研究所培地（cRPMI中）9で0.1のOD 600（接種材料）で接種物の20ミリリットルを準備するために必要な培養液量（V）を計算します。[V = 20ミリリットル* 0.1 / OD 600（文化）] 注：リファレンス9のcRPMIの準備の詳細を提供します。 <ol><li>万×gで1分間回転させることによって遠心分離管、ペレット細胞に（上から）計算培養容量を加えます。 prepaへバイオフィルム接種再、20ミリリットルのcRPMIで過ごした成長培地を再懸濁細胞ペレットを吸引。 </li></ol></li><li> 25ミリリットルのリザーバーに接種材料を注ぎます。 </li><li>慎重にそれをまっすぐに引き上げて、滅菌96ウェルペグプレートからふたを外します。 注意：注意は、蓋から垂下ペグを汚染しないように注意する必要があります。蓋は安全キャビネット内の清浄表面上に逆さまに配置することができます。 </li><li> 200μlのマルチチャンネルピペットを用いて、底板のGへの行の各ウェルに125μlの接種材料を追加します。 </li><li>無菌性制御などの行Hの各ウェル中の125μlの無菌のcRPMI培地を記入してください。 </li><li>ペグ蓋を取り、下に向けペグ付きプレート底部の上にそれを保持します。慎重に、それ​​ぞれのウェルを有する個々のペグの位置を合わせます。プレートとペグの間の物理的接触を避けてください。整列した後、慎重にダウン蓋を下げます。ペグの後に行われる再調整が底板は続きがあり触れてきたようにミスアライメントを避けます行Hのアミ無菌コントロール</li><li>しっかりとシール、密封可能なビニール袋に蒸発し、場所を防止するために、パラフィンフィルムでプレートに蓋をシール。蒸発を最小限に抑えるために、できるだけ低くバッグ内の空気量を保ちます。 </li><li> 5％CO 2インキュベーター中で48時間37℃で振盪せずにインキュベートします。 注：成長の48時間は、Sのために最適となっています黄色ブドウ球菌が、使用する生物に基づいて異なります。 注：静的なインキュベーションは、アッセイを最適化するための良い出発点ですが、静かにマイクロプレートシェーカー上で150 rpmで振とうすると、一部のS.のバイオフィルムの形成を促進する可能性のある変動であります黄色ブドウ球菌が分離します。 </li></ol>バイオフィルムチャレンジプレートの調製<ol><li>バイオフィルムチャレンジの日に新鮮な96ウェルプレートを取ると、一貫性のない結果を回避するために、行の各ウェルBにHに、RTに平衡化のcRPMIの100μLを、追加、200μLを保持することができ、96ウェルプレートを利用メディアのペグが内側であり、バイオフィルム開始プレートのものと同一の寸法でウェルを備えていたとき。 </li><li>ステップ2.7での最終希釈を考慮するために、所望の最終濃度を2倍のcRPMI中の1.0ミリリットルで別々に4試験化合物まで希釈します。 注：良い出発点は、浮遊細胞の阻害濃度以上の8倍です。 </li><li> A3、ウェルA12にA10のA9にウェルA7におけるA6にウェルA4中の化合物2、化合物3および化合物4に、ウェルA1に化合物1の200μLを加えます。 </li><li>シリアルマルチチャンネルピペットを用いて、試験化合物を希釈し、B行と混合するためにA列から100μlのを転送します。 </li><li>そのようにして、ウェルによく100μlのを転送し続けます。各転送後に混合し、行Fに停止</li><li>混合した後、廃棄物容器に行Fから100μLを追放します。行GとHに液体を転送しないでください</li><li>にマルチチャンネルピペットを用いてプレートの各ウェルにcRPMI中の100μlのを追加します。200μlにボリュームをもたらします。最終的なプレートレイアウトについては、 図1を参照してください。 </li></ol> 3.バイオフィルムチャレンジ<ol><li>バイオフィルム開始プレートのものと同一の寸法を有するウェルを備え、新鮮な滅菌96ウェルプレートにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の200μlのを追加します。 </li><li>インキュベートバイオフィルム開始プレートからプラスチックの袋とパラフィン膜を除去。 </li><li>まっすぐふたを持ち上げます。バイオフィルムを損傷する恐れがあり、このようペグとプレート底部との接触を避けてください。 （3.8を参照）、その後のOD 600の分析のために底部を保管してください。 </li><li> （ステップ3.1から）PBSを含むプレート上にペグ蓋を配置することにより、浮遊細胞を洗い流します。 PBSの外に持ち上げ、5秒間ペグ水没し、ウェル側面に対するペグをヒットしないように注意して、もう一度水没。 </li><li>チャレンジプレートにすすぎペグ蓋を置きます。これはにつながるバイオフィルムにダメージを与えますようにペグと底板との間に不必要な接触を避けます一貫性のない結果。 </li><li>シールパラフィンフィルムでプレートし、ステップ1.10で説明したように密封可能なビニール袋に入れます。 </li><li> 5％CO 2インキュベーター内で37℃で24時間振盪せずにプレートをインキュベートします。 </li><li> 3.3からバイオフィルム開始プレートの底を取ります。各ウェルにマルチチャンネルピ ​​ペットを使用して細菌を再懸濁し、全てのウェルに生じる成長を確認するために、適切なマイクロプレートリーダーでOD 600を測定するが、行Hの無菌コントロール</li></ol> 4.バイオフィルムの決意<ol><li>インキュベーションチャンバーとレサズリン変換を検出するための運動蛍光測定値をとることができる装備プレートリーダーを使用してください。 530nmの励起および590nmの発光を用いて24時間の運動蛍光測定を設定します。 </li><li> 37℃に室内温度を設定し、プレートを20分ごとを読んでいます。メーカーのinstrucに係るプレートの底から測定するために、プレートリーダーを設定します。ション。 </li><li>滅菌96ウェルプレートにマルチチャンネルピペットを用いて200μlのPBSを添加することにより、洗浄プレートを準備します。 </li><li> 0.8ミリグラムの400μLを添加することによって、バイオフィルムの回復培地を調製/ 16 / mlのレザズリンの最終濃度までのcRPMI培地20mlのストック溶液をレサズリンmLです。 注：レサズリンは、既知の皮膚刺激性です。処理中に白衣、スプラッシュゴーグル、手袋を使用してください。バイオフィルムの回復メディアとしてのcRPMIは、最低のバックグラウンド信号を提供するために使用したが、適切な場合には、ミューラーヒントン培地に置き換えることができます。 </li><li>新鮮な96ウェルプレートの各ウェルにマルチチャンネルピペットを用いてバイオフィルムの回復培地150μlを添加します。 </li><li>安全キャビネットに移すインキュベーターからチャレンジプレートと慎重にビニール袋を取り外し、封止膜。 </li><li>チャレンジプレートからペグ蓋を外し、3.4で説明したようにPBSに浮遊細胞を洗い流してください。その後のOD 600 ANAための挑戦プレートの底を保ちます溶解（4.10を参照）。 </li><li>すすいだ後、バイオフィルムの回復培地を含むプレート底部にペグ蓋を置きます。 </li><li>周囲のウェルの底を妨げないように注意しながら、パラフィンフィルムでプレートの側面を包みます。すぐにプレートをラップした後、プレートリーダーの上に置き、ステップ4.1から以前に運動プロトコルリザズリン製を開始することにより、24時間の期間にわたって運動の読み取りを開始します。 </li><li>または挑戦中に発生してもしなくてもよい浮遊細胞の成長を定量化するために、マイクロプレートリーダーを使用して、全体チャレンジプレート底部のOD 600を読み取ります。ステップ3.8で与えられた指示に従ってください。 注：バイオフィルムをオフに流して細胞がウェルの底に塊に成長する傾向があるとして慎重に各ウェルの内容を再懸濁します。ウェル内の気泡を強くOD 600の読みを妨害する、回避または読み取りの前に除去されなければなりません。 </li></ol>

<ol>
	<li>Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+insights+from+biofilm+biology+to+drug+development+-+can+a+new+approach+be+developed.">Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prosthesis+infections+after+orthopedic+joint+replacement:+the+possible+role+of+bacterial+biofilms.">Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms.</a> Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).</li><li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. 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Chapter 13, Unit 13A 18 (2010).</li><li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MBEC+Assay+System:+multiple+equivalent+biofilms+for+antibiotic+and+biocide+susceptibility+testing.">The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing.</a> Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).</li><li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Calgary+Biofilm+Device:+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms.">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li><li>Baker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+stress+induces+a+global+stress+response+in+Staphylococcus+aureus+and+represses+sae+and+agr+expression+and+biofilm+formation.">Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation.</a> Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).</li><li>Haeili, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+complexation+screen+reveals+compounds+with+potent+antibiotic+properties+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).</li><li>O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+Alamar+Blue+(resazurin)+fluorescent+dye+for+the+assessment+of+mammalian+cell+cytotoxicity.">Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity.</a> Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).</li><li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+the+minimal+bactericidal+concentration+of+an+antimicrobial+agent+for+planktonic+cells+(MBC-P)+and+biofilm+cells+(MBC-B).">Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B).</a> J Vis Exp. (83), e50854 (2014).</li><li>Junker, L. M., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).</li><li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persisters:+a+distinct+physiological+state+of+E.+coli.">Persisters: a distinct physiological state of E. coli.</a> BMC Microbiol. 6, 53 (2006).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riddle+of+biofilm+resistance.">Riddle of biofilm resistance.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここでは、Sでテストした阻害剤の活性を測定するために修飾バイオフィルムアッセイを記載していますバイオフィルム関連する細胞の代謝状態に焦点を当て球菌バイオフィルム。記載のバイオフィルムの開始とチャレンジ手順主に模倣メーカーの推奨事項が、24時間の阻害剤の挑戦を生き残るバイオフィルム関連細胞を検出し、定量化するための色素をレサズリンの使用は劇的に細胞（水浴の超音波処理を介して）回復とそれに続く列挙の推奨手順を簡素化CFUの計数を経由しての生細胞。このメーカー推奨の手順は、それらの各エラーを起こしやすい、労働集約、および自動化することは非現実的に少なくとも5つの追加操作ステップを伴います。ペグプレートアッセイの読み出し手順を簡素化することの利点は、高スループット動作及びアプリケーションのための魅力を増加させます。 ステップ数によって長いプロトコル、このprocedurけれどもeは、いくつかの重要なステップで、かなり概念的には簡単です。最も決定的に、繰り返し同じ品質のバイオフィルムを増殖する能力は、再現性のある結果を得るために必須です。ペグ蓋を取り外しまたは交換するたびにまた、1は注意を払わなければなりません。よくの壁との任意の点での接触は、結果をゆがめる、バイオフィルムを崩壊させることになります。より多くのように、十分な洗浄が重要である：任意の時点で浮遊細胞を除去するための障害はバイオフィルム関連細菌を測定するための任意の機能を削除します。逆に、しかし、洗浄があまりにも厳格にすることはできません。追加の洗浄ステップは、一貫性のない結果を生成する、バイオフィルムの除去を開始することができます。 ペグプレートのアプローチは、所望の結果得られたデータに応じて、複数の用途があります。アッセイは、蛍光色素11への代謝レサズリン変換の情報が豊富な運動測定としてここに記載されています。この変換は、青からピンクへの色変化（ 図2C）、additiで関連付けられています定量的蛍光読み取り上に、単に変換を観察することで簡単に初期の質的読み出しを可能にします。ペグ蓋を除去した後、この変換はまた、機能が利用できない蛍光べきで600 nmの吸光度を読み取ることによって定量することができます。蛍光は、最終的に（生存者）を各ウェルに最大色素変換時にプラトーが、染料の変換の開始は、未処理の対照（ 図3）に代謝的に活性な生存者人口の相対を推定するために使用することができます。私たちの手では、レサズリン変換の発症における各〜100分の遅延が直列に浮遊性細胞培養で決定されるように、未処理の対照に開始接種相対（内代謝活性細胞の数の約10倍の減少に対応することを発見しましたバイオフィルムの回復培地を用いて10倍ずつ希釈した）（データは示さず）。 運動の読み出しを超えて、しかし、修正されたペグプレートこの方法は、元のプロトコルよりも、ハイスループット薬物スクリーニングプロジェクトに、より適しています。代わりに、運動の終点としてレサズリン変換を測定することにより、ユーザは、蛍光プレートリーダーで24時間の必要性を除去する化合物の単純な活性（ すなわち、染料変換/無変換）を追跡するためにサンプルのバイナリ分析を生成することができます従来のインキュベーションを可能にします。この方法は、超音波処理及びめっきを必要とせずに濃度を根絶最小バイオフィルムを決定することを可能にします。運動の読み取りは、治療条件および阻害剤濃度に応じてバイオフィルムの代謝状態を追跡します。操作工程数の減少、増加再現性、定量的な読み出し方法は、（個別ウェル12を各メッキではなく）ユーザーが単一濃度画面で、潜在的に一日あたり数千の化合物をスクリーニングすることができます。実際には、ペグ風板は、以前に、ハイスループットDRに使用されてきましたレサズリンしかし、バイオフィルムの分散のためのUG画面は、（ここで使用されるような）13を利用した独自のルシフェラーゼ試薬よりもはるかに経済的な選択肢です。 既存の製造業者のプロトコル上での一般的な改善は、ここで取り上げアッセイは、一定の制限を持っていないが1は、心に留めておく必要があります。本質的に、我々は唯一のバイオフィルム関連細胞の代謝能力を測定しています。このアッセイは、バイオフィルムの質量を測定するか、そうでなければバイオフィルムのアーキテクチャや完全性を弱めていません。これらの効果は、必ずしも検出されません。バイオフィルム14,15内に存在することが示されている細胞、存続、代謝的に不活性、まだ実行可能なも検出されないことになります。また、実際にバイオフィルムを殺菌せずに静止状態を誘導する化合物は、誤って誘導された状態の長さに応じて、偽陽性として表示される場合があります。生存率の指標は、最終的に、このようなフローサイトメトリーまたはCFUなど、より鉄壁の測定方法のために代理であり、列挙、およびエンドユーザーは、どちらの方法が適切かを決定しなければなりません。レサズリン変換は、内因性のNADHに依存しているように最後に、細胞内貯蔵の枯渇は、細菌にとって有害で​​ある可能性があります。我々はS.に対して有害な効果を認められなかったが黄色ブドウ球菌は 、他の細菌種は異なって反応することがあります。ユーザーがテストを経験的に、信頼性と再現性与えられた様々な生物やラボ環境のためにこのプロトコルを検証する必要があります。

病原性微生物は、非急性慢性感染1に導くインビボでバイオフィルムを形成することができます。バイオフィルム関連感染は、異物（ 例えば、人工骨置換、乳房インプラント）、または気管チューブまたは尿道カテーテル2のインストールの注入を伴う医療処置の重大な危険因子です。バイオフィルムベースの感染はめったに自分でクリアされないように、これらの状況では、抗感染療法も免疫応答性個体では、ほとんど常に必要である。 黄色ブドウ球菌は、の使用中に発生するバイオフィルム関連の合併症に関与し、最も頻繁に観察された病原体の一つであります侵襲性医療機器3。 残念ながら、保護バリアとしてのバイオフィルムの本質は、浮遊細胞1,4より治療に対してより耐性になり、予測臨床的有効性の評価は、両方の初期の重要な部分です医薬品開発だけでなく、薬剤耐性サーベイランス。プランクトンの文化に焦点を当てた実験室条件は、忠実に実世界の疾病5を表していない可能性があること増加肯定応答があります。さらに問題を配合、バイオフィルムの表現型の複製は困難であり、既存のバイオフィルムモデルは面倒であり、高間およびアッセイ内変動6苦しみます。このように、多くの研究者は、必要を通じて、それによって潜在的に細菌毒性および疾患の重要な側面を無視し、薬剤感受性の浮遊性細胞アッセイをデフォルトに。 ここでは、具体的には、S、細菌をアッセイするためのプロトコルを記述します96ウェルベースのバイオフィルムシステム7,8を利用して事前に成長したバイオフィルム中の黄色ブドウ球菌 、。バイオフィルム形成と挑戦のためのプロトコルは、本質的に製造業者の勧告に従っているが、我々はbioF遺伝子の生存率を定量化するための代替情報が豊富な方法論を提示しますチャレンジ後ILM。簡単に説明すると、細菌がバイオフィルムは、プレートの蓋に取り付けられた突出ペグに形成ペグプレートで培養されます。バイオフィルム形成後、ペグは穏やかに浮遊細胞を除去するためにPBSで満たされた新鮮なプレートのウェル中に浸漬されています。ペグ蓋は、添付のバイオフィルムで、アッセイされる抗生物質の種々の濃度を含む、新規のチャレンジプレートに移します。第二のインキュベーションの後、蓋を再び取り出し、洗浄し、そしてそれらが最終インキュベーションを受けるレサズリン色素を含有する回収プレートに移します。レサズリン変換を動力学的に記録された、または定義された回復期間の後、エンドポイントの読み取りとすることができます。独自プロトコル7に記載され、このバイオフィルムの生存率を定量化するの染料ベースの方法は退屈CFU（コロニー形成単位）かなり異なるカウントベースの方法論。 OD薬物挑戦板とレサズリン変換速度の600の測定値は、生存率のリードとして働きますそれぞれプランクトンとバイオフィルム細胞のアウト、バイオフィルムの生存のための高速で信頼性の高い、情報が豊富で技術的に簡単な分析を提供しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">&#160;Mueller-Hinton Medium</td>
			<td style="width:89px;">Oxoid</td>
			<td style="width:103px;">CM0405</td>
			<td style="width:195px;">Follow recommendations of manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">RPMI-medium</td>
			<td style="width:89px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:103px;">17-105-CV</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:227px;">CRPMI</td>
			<td style="width:89px;">Ref 9</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:195px;">RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Chelex 100 Resin</td>
			<td style="width:89px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:103px;">142-2822</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">MBEC-plates</td>
			<td style="width:89px;">Innovotech</td>
			<td style="width:103px;">19111</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Resazurin Sodium Salt</td>
			<td style="width:89px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">R7017</td>
			<td style="width:195px;">800&#181;g/ml in DI water&#160;&#160;&#160;&#160; Filter sterile</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Micro Plate Shaking Platform&#160;</td>
			<td style="width:89px;">Heidolph Titramax 1000</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Cytation 3 Plate Reader</td>
			<td style="width:89px;">Biotek</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:58px;width:227px;">Gen5 software</td>
			<td style="width:89px;">Biotek</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:195px;">Recording and analysis of resazurin conversion</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Neocuproine</td>
			<td style="width:89px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">N1501&#160;</td>
			<td style="width:195px;">prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Copper sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:103px;">7758-99-8</td>
			<td style="width:195px;">prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:227px;">Cu-Neocuproine</td>
			<td style="width:89px;">Self-Made</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:195px;">Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:89px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">G3632-1G</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting biofilm associated staphylococcus aureus using resazurin based drug-susceptibility assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

レサズリンアッセイは確実に挑戦した後、薬剤を含まない培地中で複製することができる非常に少数の生存可能な細胞を検出するのに十分な感度です。この方法論では、我々は何のレサズリン変換は24時間以内に見られない最低の濃度として最小のバイオフィルム根絶濃度を定義します。レサズリンアッセイは、青からピンクへの染料の色を変換する代謝的に活性な細胞に見られる酸化的分子に依存しています。染料の変換は、このように、細胞増殖の指標であり、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて定量することができます。本論文では、ネオクプロインとCu-ネオクプロイン（銅と複合体を形成ネオクプロイン）はS.関連するバイオフィルムに向かってそれらの活性について試験しました黄色ブドウ球菌は、 図1に基づいてレイアウトを適用する。プロトコルの実行中に得られたデータは、品質管理として機能するバイオフィルムの開始プレートのOD 600読み取りである（データは示していません）プレート底部の、OD 600読書課題は、完了した後（ 図2A）、及び回収プレート（ 図2B）、その蛍光代謝産物レゾルフィンへのレサズリン変換の運動記録。はい/レサズリン変換のない評価は、実験の目的のために十分でない場合、さらに、チャレンジプレートのエンドポイント・イメージはレサズリン変換（ 図2C）の目視検査のために使用することができる。あるいは、運動記録機能が利用できないか、複数ある場合プレートは、並列に実行され、蛍光は、単一のエンドポイント読み取りにより24時間後に決定することができます。 図2Aに見られるように、チャレンジ・プレートからのOD読み取り値は、単独で、ネオクプロインは浮遊細胞の増殖を阻害しないことを示しています。 10ただし、期待どおりのCu-ネオクプロインは、1.3μMでの成長を阻害します。同様のパターンを示し、バイオフィルムプレートのレサズリン運動から観察されますその唯一のCu-ネオクプロインは、代謝的に活性なバイオフィルム関連細胞（ 図2B）を除去することができます。 バイオフィルム根絶濃度を提供することに加えて、動力学的アッセイは、生菌数の指標であるバイオフィルムの代謝状態に関する情報を提供します。未処理の対照の濃度を増加させることをゲンタマイシンで処理されたバイオフィルムを比較すると、レサズリン変換の遅れが（ 図3）を見ることができます。ウェルは未処理対照としてレサズリンの同じ変換に達するまでは2.5μg/ mlのゲンタマイシンの場合、13時間の遅延があります。この遅れはおそらく、未処理と比較して、処理されたバイオフィルム中に存在する生細胞の数の減少から来ます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53925/53925fig1.jpg" /> 図1.チャレンジプレートレイアウト。Exampl6つの異なる濃度で、三重の4つの化合物の並列試験を収容チャレンジプレートの電子レイアウト。未処理および無菌対照も含まれています。レイアウト設計は、マルチチャンネルピペットを用いて連続希釈液の便利でプレートの準備をサポートしています。濃度はμMである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53925/53925fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53925/53925fig2.jpg" /> 図2.最小バイオフィルム根絶濃度を決定する。ネオクプロインとCu-ネオクプロインは、バイオフィルムの根絶の可能性について試験しました。 （A）OD 600がバイオフィルム解離細胞の増殖を定量するためにペグ蓋を除去した後にチャレンジプレートから採取しました。 （B）レサズリン変換はINDIVIに動力学的にモニターしました24時間の期間にわたってデュアル井戸。個々のminigraphsは時間（24時間）以上の蛍光（RFU）を示しています。レサズリン変換の欠如は、生存者が存在しないことを示しています。レサズリン変換は、バイオフィルムをオフ脱落し、回復培地で増殖する生細胞の存在を示します。 （C）運動読み出しが不可能であるか、必要ではない、単純なイエス/生存細胞の存在のための答えはそのピンク、還元型に青レサズリンの色変換から視覚的に決定することができない場合。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53925/53925fig2large.jpg" target="_blank">にはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53925/53925fig3.jpg" /> 図3.キネティックレサズリンアッセイは、バイオフィルム中の細菌に対する抑制効果を明らかにした。化合物は完全にバイオフィルム埋め込 ​​まれた細胞を根絶ないかもしれないが、それでも減らすことができますIRの生存率。ゲンタマイシンの異なる濃度で処理したウェルのレサズリン変換の遅延を比較した場合に見られます。レサズリン変換の遅延を持つウェルズは、生存細胞数の減少を示しています。ブラック（メディアのみ）、オレンジ（0 / mlの）、グリーン（0.3 / mlの）、ブルー（0.6 / mlの）、パープル（2.5 / mlの）、およびグレー（5μg/ mlの）。 Δtはおおよそ半分の最大蛍光値で未処理およびゲンタマイシン処理サンプル間の指数レサズリン変換の時間差を指す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53925/53925fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

バイオフィルム関連をターゲット<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;レサズリン基づく薬剤感受性アッセイを使用して

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

targeting-biofilm-associated-staphylococcus-aureus-using-resazurin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

12.9K ビュー.  University of Alabama at Birmingham. Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms. 

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Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

マイクロタイター皿のバイオフィルム形成アッセイ

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

免疫・感染学

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1 Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached to a surface.2 Biofilm formation and development are commonly studied in the laboratory using batch systems such as microtiter plates or flow systems, such as flow-cells. These methodologies are useful for screening mutant and chemical libraries (microtiter plates)3 or growing biofilms for visualization (flow cells)4. Here we present detailed protocols for growing Staphylococcus aureus in two additional types of flow system biofilms: the drip flow biofilm reactor and the rotating disk biofilm reactor.
Drip flow biofilm reactors are designed for the study of biofilms grown under low shear conditions.5 The drip flow reactor consists of four parallel test channels, each capable of holding one standard glass microscope slide sized coupon, or a length of catheter or stint. The drip flow reactor is ideal for microsensor monitoring, general biofilm studies, biofilm cryosectioning samples, high biomass production, medical material evaluations, and indwelling medical device testing.6,7,8,9
The rotating disk reactor consists of a teflon disk containing recesses for removable coupons.10 The removable coupons can by made from any machinable material. The bottom of the rotating disk contains a bar magnet to allow disk rotation to create liquid surface shear across surface-flush coupons. The entire disk containing 18 coupons is placed in a 1000 mL glass side-arm reactor vessel. A liquid growth media is circulated through the vessel while the disk is rotated by a magnetic stirrer. The coupons are removed from the reactor vessel and then scraped to collect the biofilm sample for further study or microscopy imaging. Rotating disc reactors are designed for laboratory evaluations of biocide efficacy, biofilm removal, and performance of anti-fouling materials.9,11,12,13

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Protocols for utilizing open system flow biofilms with drip flow reactors and rotating disk reactors are presented in detail.

用ドリップ流れと回転円板の原子炉の使用黄色ブドウ球菌バイオフィルム分析

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the United States. Among soft-tissue infections, myositis, pyomyositis, and necrotizing fasciitis have been increasingly reported in association with MRSA arising from the community. To understand the interplay between MRSA and host immunity leading to more severe infection, the availability of animal models is critical, permitting the study of host and bacterial factors. Several infection models have been introduced to assess the pathogenesis of S. aureus during superficial skin infection. Here, we describe a subcutaneous infection model that examines the skin, subcutaneous, and muscle pathologies.

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Murine skin and soft tissue infection model is utilized for assessing the virulence function of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the host immunological responses. Here, we presented a subcutaneous infection model for skin and soft tissue infection.

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の皮下感染

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause of such syndromes with unacceptably high morbidity and mortality even with appropriate antimicrobial agent treatments4-6. The increase in infections due to methicillin-resistant S. aureus (MRSA), the high rates of vancomycin clinical treatment failures and growing problems of linezolid and daptomycin resistance have all further complicated the management of patients with such infections, and led to high healthcare costs7, 8. In addition, it should be emphasized that most recent studies with antibiotic treatment outcomes have been based in clinical settings, and thus might well be influenced by host factors varying from patient-to-patient. Therefore, a relevant animal model of endovascular infection in which host factors are similar from animal-to-animal is more crucial to investigate microbial pathogenesis, as well as the efficacy of novel antimicrobial agents. Endocarditis in rat is a well-established experimental animal model that closely approximates human native valve endocarditis. This model has been used to examine the role of particular staphylococcal virulence factors and the efficacy of antibiotic treatment regimens for staphylococcal endocarditis. In this report, we describe the experimental endocarditis model due to MRSA that could be used to investigate bacterial pathogenesis and response to antibiotic treatment.

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Experimental rat endocarditis model due to methicillin-resistant S. aureus.

メチシリン耐性の実験的心内膜炎モデル<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;（MRSA）ラットにおける

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

鉄源としてヒトヘモグロビンを用いた黄色ブドウ球菌の成長

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

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Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

の相互作用を研究<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;フローサイトメトリーとタイムラプス顕微鏡による好中球と

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

のジェノタイピング<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;によってリボソームスペーサーPCR（RS-PCR）

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

マイコバクテリアの半定量的、ミディアムスループット列挙のためのチャコール寒天レサズリンアッセイの可視化

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

で水平遺伝子伝達の研究のための方法論<em&gt;黄色ブドウ球菌</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...