この研究は学際臨床ヴュルツブルクの大学病院の研究（IZKF、グラントBD247）及び（平家Wallesに付与された）バイエルンフィットプログラムのためのセンターが主催しました。

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著者らは、開示することは何もありません。

我々は、バイオマーカー誘導の治療の予測のためのシリコ腫瘍試験システムのin vitro /で組み合わせ確立しています。 in vitroモデルは、また、 シリコ 17 でシミュレートすることができ、特定の突然変異背景に、腫瘍細胞の増殖およびアポトーシスの変化などの化合物のアクションの異なる重要な側面を評価します。ここでは、3D腫瘍モデルの生成および増殖およびアポトーシスの定量化とシリコモデルで予測の確立を含む化合物試験のための標準化されたプロトコルを提示します。 3D腫瘍モデルは、特定の変異を有する腫瘍細胞株に基づいています。細胞は、細胞冠における脱細胞化組織マトリックス上で増殖させます。行列の脱細胞化、二つの金属リング（セルクラウン）、バイオリアクターシステムの組み立てとの固定だけでなく、足場の播種は25前にJoveの中で可視化されています。 試験管内で </em&gt;の3D腫瘍モデル クリニックにここで達成された結果の翻訳は、選択した標的薬のためのバイオマーカーに応じて患者を分類するために、関心の変異を保有する適切な腫瘍細胞の慎重な選択が必要です。成層医学のために、次世代シーケンシングによってドラッガブルドライバ変異の同定は、特にNSCLCにおける主要な関心事であり、うまくいけば、将来29に新たな遺伝子マーカーを明らかにします。 in vitro試験のために、目的の化合物は、選択された細胞株または初代細胞で高活性な部位を標的とすべきです。ここで、細胞株HCC827およびA549は、EGFR突然変異状態での違いによる選択され、過敏症（HCC827細胞）および2D培養30-32におけるTKIゲフィチニブ向かっ中間感度（A549細胞）を報告しました。 3D腫瘍モデル生成の第1段階では、細胞数と選択された腫瘍細胞の培養期間はadjuでなければならここでいう異なるセルが使用されている場合STED。最適な化合物の濃度を見つけるためには、2Dで市販の生存率アッセイの助けを借りて、IC50値を決定することをお勧めします。このテストに基づき、化合物は、IC50濃度と3Dモデルの次に高い濃度で使用する必要があります。私たちは、2〜3週間以内に、他方では、2D腫瘍試験システムに容易に比較の結果を得るために、一方では、治療の3日間を選択しました。しかし、治療期間は、長期・効果を調査するために延長することができます。それにもかかわらず、長期治療または試験化合物の高投与量は、それによって、増殖または他の免疫組織化学的マーカーの評価を防止する完全な細胞の損失を引き起こす可能性があることを考慮すべきです。 信頼性のあるシグナル伝達ネットワークの解析のために、特定の化合物で処理すると、腫瘍応答は、増殖およびアポ区別分析されなければなりません眼瞼下垂。これらのリードアウトは、異なるシグナル伝達ネットワークに接続されています。このように、両方のパラメータの特徴的な分析は、薬物作用およびその後のターゲット予測のより良い理解を可能にします。前に述べたように、腫瘍細胞の増殖を、2D培養条件と比較して、我々の3Dモデルに低減され、従って、試験された細胞増殖抑制化合物の偽陽性の結果を減少させるべきです。増殖指数の決意について、核の総数とKi67染色のための陽性の核の数は、例えばソフトウェアフィジーを用いて定量化されなければなりません。これは、これは、核のより低い又はより高い数値になるように細胞が密な凝集体を形成する場合、それぞれ、しかし、不可能である腫瘍細胞の二次元培養におけるマクロの使用によって簡略化することができます。全ての場合において、マクロ設定は、各細胞株および染色のために慎重に調整しなければなりません。アポトーシスはWH、カスパーゼ切断サイトケラチン18を測定する上清から非侵襲的に定量化することができますICHは、M30-ELISAを使用して、上皮の特徴を有する細胞に限定されています。これはいくつかの利点を有する：I）それは経時治療効果を監視し、効果的な治療の開始点を識別することができます。 II）試料は破壊されず、他の読み出し技術のために使用することができます。 III）上皮細胞のアポトーシスは、共培養の設定で最適な間葉アポトーシス、区別することができます。この技術は、しかしながら、それによってそれらの上皮表現型を失って、EMTを受けた腫瘍細胞には不適切かもしれません。この技術が適用される前にこのように、使用された各腫瘍細胞株のサイトケラチン18の発現は、免疫組織化学的染色によって確認されるべきです。化合物の試験は、より腫瘍幹細胞様の表現型で行うことができます。通常、薬物検査で異なる侵襲のステージは、TKIのよう標的薬のほとんどは、より高度な腫瘍の段階で適用されていても無視されます。我々のモデルは、侵襲的または全くの調査を可能に細胞が侵入プロセスの間に横断する必要が原因で保存基底膜17のn型浸潤性腫瘍細胞。細胞の運動性および浸潤性に向けた重要なステップは、TGF-β-1 17,33刺激により異なる肺癌モデルに誘導することができるEMTです。これは、しかし、増殖及び足場上ことにより細胞数を減少させます。この負の副作用が強く、3Dモデルにおける腫瘍細胞密度を増加させる動的な培養条件を適用することによって回避することができます。バイオリアクターは、生理学的条件に培養物を調整するにもかかわらず、それは、電池特性及びシグナリングが応力25をせん断への暴露によって影響され得ることを考慮しなければなりません。 スピードアップするために シリコ シミュレーション で 使用した 細胞株に特異的薬物検査 唯一の半 ​​定量的ものの、イベントのシーケンスを適切にケアすることによりシリコモデルで私たちによってモデル化され、完全に各特定の細胞株について知られている変異を考慮。これは、異なる受容体活性化レベルの細胞株特異的修飾、キナーゼが活性化したときに、どのように長い間、このようなアポトーシスまたは増殖などのネットワーク出力が期待されるされている関与する度合いが含まれています。例えば、人は、取得した抗EGFR療法抵抗30の約20％に起こると考えられている臨床的に既知のc-MET増幅を考慮することができます。その後、 インシリコモデルは、時間をかけて対応するネットワークの挙動を計算例えば 、ゲフィチニブ耐性の発達増殖の増加によって表されるとアポトーシスを減少させました。我々のモデルでは、我々は、最も有望な標的候補としてMEK及びPI3Kが同定されました。したがって、新しい潜在的な治療の組み合わせは、急速に、さらにin vitro試験のための基礎として機能する、in silicoで事前に評価することができます。また、in vitro実験からの出力データは、缶最良の実験結果に適合するネットワークの調整によってインシリコシステムで洗練するために使用されます。 インシリコ戦略の半定量的には（100、タンパク質-タンパク質相互作用を考慮することができる程度）ネットワークサイズに関するいくつかの制限を有します。また、現実的な結果を得るために、ネットワークトポロジにすべての主要なタンパク質のノードを統合することが重要です。 インシリコのモデルは、このように生きている腫瘍細胞内の既存のネットワークの唯一の近似を与えます。しかし、この集束されたビューは、関心のある特定の変化、 例えば 、細胞株内の異なる突然変異背景に薬物の組合せの効果をシミュレートすることを可能にします。これは、私たちは系統的に新しい治療戦略を導出するだけでなく、癌のシグナル伝達ネットワークの複雑さを理解するのに役立ちます。 結論として、我々は簡単にprecliに統合することができた試験管ツールにおいて操作役立つ組織を開発したと確信しています単一の薬物化合物およびそれらの組み合わせの有効性に関するnicalテスト。テストではコストと時間を削減するために、この腫瘍モデルは、さらにインシリコ予測ツールでクリニック指向標的療法または考慮すべき新しいプレーヤーなどの薬物および薬物併用効果の細胞型特異的予測に収集したデータを拡張することを可能にすることによって補完され（ 例えば 、miRNAは）。

製薬業界は、莫大なコスト1-5を引き起こす臨床段階における癌治療の分野で最大95％の高い離職率に直面しています。この赤字の1つの理由は、現在、潜在的な新規化合物の有効性は、癌細胞株の2D細胞培養でまたは動物モデルでの大規模スクリーニングで評価することです。動物モデルは、より高い複雑さを持っていますが、マウスと男性6,7間の決定的な違いがあります。 10年で、異なるアプローチを使用して3D癌モデルは、2D癌細胞株の培養およびインビボ腫瘍 6,8,9 における複合体との間のギャップを埋めるために生成されています。細胞分化にもシグナル伝達に対する3D環境の影響は数年前にいくつかの研究で示されている（ 例えば 、ミナザビッセルによって）10,11。今日では、多くの3D細胞培養モデルは、スフェロイド培養、ヒドロゲルまたはマイクロ流体チップ12-16として入手可能です。でもthesというかかわらずEモデルは、それらが主に腫瘍担持の効果と影響の薬効を有することが知られている組織の微小環境を欠いている、従来の2D培養システムと比較して複雑性を高めます。 この問題に対処するために、我々は、脱細胞化ブタ空腸に由来するSISmuc（ 小腸、粘膜下層+粘膜 ）と呼ばれる生物学的足場に基づいた3D腫瘍モデルを生成しました。これにより、組織構造や、異なるコラーゲンと同様に基底膜構造としてECMの重要な構成要素は、17を保持されます。このユニークな機能は、上皮から生じ、固形腫瘍の約80％を占める癌の腫瘍モデル生成のために重要です。さらに、我々の組織工学腫瘍モデルにおける増殖速度は、2D培養で達成され、人為的に高い速度に比べて低減されます。増殖が薬効を評価する上で重要なパラメータであるように、薬物検査は類似で我々のモデルで有効になっています17 in vivoでの腫瘍内への条件。 そのEGFRの -biomarker状態が異なる2つの異なる肺癌細胞株のための正常なバイオマーカー依存性薬物の有効性を予測するために我々のモデルの可能性を評価するために、ここで現在のデータ。この変異状態は、NSCLC患者に日常的に決定され始めています。例えば、白金ベースの化学療法18-21のものと比較して、活性化EGFR変異ショー優れた成果を保有する腫瘍に対するEGFR -inhibitorゲフィチニブなどのTKIとターゲットを絞った治療法。 我々は、化合物の有効性を評価するために関連するいくつかの読み出し技術を確立しました。さらに、TGF-β-1刺激後に、我々は、悪性形質転換22,23における重要なステップであると考えられ、薬物RESISTANに接続されたEMTプロセスを、開始した腫瘍細胞における化合物の作用を調査することができますCE 24。 3D腫瘍モデルは、良好なコントラストで標的治療、化学療法、または薬物の組み合わせに細胞特異的応答を監視することができます。さらに強化し、薬剤スクリーニングをスピードアップし、抵抗に遭遇するために、これはシリコシミュレーションにによって補完されます。いくつかの実験に基づいて、腫瘍反応は、薬物およびそれらの組み合わせの完全な範囲についての結果についてインシリコで予測することができます。

<table><tbody><tr><td>Bioreactors</td><td>Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, W&amp;uuml;rzburg (GER)</td><td></td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji)</td><td>Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell crowns</td><td>Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, W&amp;uuml;rzburg (GER)</td><td></td><td>for static 3D culture</td></tr><tr><td>CellDesigner</td><td>http://www.celldesigner.org/</td><td>-</td><td>This software was used for drawing the network.</td></tr><tr><td>Citrate buffer stock solution (10x)</td><td>in house production</td><td></td><td>42 g/L Citric acid monohydrate, 17.6 g/L Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6.0, stored at RT.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Citrate buffer working solution</td><td>in house production</td><td></td><td>10% Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT.</td></tr><tr><td>Citric acid monohydrate</td><td>VWR, Darmstadt (GER)</td><td>1002441000</td><td>used for the citrate buffer</td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>VWR, Darmstadt (GER)</td><td>631-1339</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>SouthernBiotech, Birmingham (USA)</td><td>SBA-0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes &amp;amp; Pathways)</td><td>http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/</td><td>-</td><td>Different known literature databases were used for generating the network topology.</td></tr><tr><td>Female Luer Lug Style Tee</td><td>Mednet, M&amp;uuml;nster (GER)</td><td>FTLT-1</td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>Female Luer Thread Style with 5/16&quot; Hex to 1/4-28 UNF Thread</td><td>Mednet, M&amp;uuml;nster (GER)</td><td>SFTLL-J1A&amp;nbsp;</td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Bio&amp;amp;SELL, Feucht (GER)</td><td>FCS.ADD.0500</td><td>not heat-inactivated</td></tr><tr><td>Gefitinib</td><td>Absource Diagnostics GmbH, M&amp;uuml;nchen (GER)</td><td>S1025-100 mg</td><td>100 mM stock solution with DMSO</td></tr><tr><td>Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection</td><td>Weckert, Kitzingen (GER)</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Histofix 4% (Paraformaldehyd)</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>P087.1</td><td></td></tr><tr><td>Hose coupling</td><td>Mednet, M&amp;uuml;nster (GER)</td><td>CC-9</td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>Incubator for bioreactors</td><td>Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, W&amp;uuml;rzburg (GER)</td><td></td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>M30 CytoDeath&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; ELISA</td><td>Peviva, Bromma (SWE)</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>Male Luer Integral Lock Ring</td><td>Mednet, M&amp;uuml;nster (GER)</td><td>MTLL230-J1A</td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>Moisture chamber</td><td>custom made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti Pan-Cytokeratin</td><td>Sigma-Aldrich, Munich (GER)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>C2562-2ML</td><td>Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3
+M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence</td></tr><tr><td>Needlefree Swabable Valve Female Luer</td><td>Mednet, M&amp;uuml;nster (GER)</td><td>NVFMLLPC</td><td>Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized</td></tr><tr><td>O-Ring MVQ 10 red 37 x 3 mm</td><td>Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER)</td><td>21444</td><td>O-ring large, Bioreactor setup</td></tr><tr><td>O-Ring MVQ 70 red 27 x 2.5 mm</td><td>Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER)</td><td>19170</td><td>O-ring small, Bioreactor setup</td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Dako, Hamburg (GER)</td><td>S002</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6642.6</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER)</td><td></td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich, Munich (GER)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>D8537-6x500ml</td><td></td></tr><tr><td>Pump tubing cassette</td><td>Ismatec, Wertheim (GER)</td><td>IS 3710</td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>Rabbit anti Ki67</td><td>Abcam, Cambridge (UK)</td><td>ab16667</td><td>Clone SP6, used for 1/100 for IF</td></tr><tr><td>Rabbit anti Vimentin</td><td>Abcam, Cambridge (UK)</td><td>ab92547</td><td>used 1/100 for IF</td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Life technologies, Darmstadt (GER)</td><td>61870-044</td><td>warm in 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Silicone tube</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER)</td><td>HC66.1</td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich, M&amp;uuml;nchen (GER)</td><td>30620-1KG-R</td><td>used for the citrate buffer</td></tr><tr><td>SQUAD</td><td>http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm</td><td>-</td><td>This software was used for performing the semiquantitative simulations.</td></tr><tr><td>Sterile air filter, pore size 0.2 &amp;micro;m</td><td>Sartorius Stedium Biotech, G&amp;ouml;ttlingen (GER)</td><td>16596-HYK</td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>Syringe Luer Lok 5 ml</td><td>BD Biosciences, Heidelberg (GER)</td><td>309649</td><td>for bioreactor sampling</td></tr><tr><td>Tissue culture test plates: 6-,&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 12-, 24-, 96- well</td><td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER)</td><td>92006, 92012, 92024, 92048&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Transforming growth factor-beta 1 (TGF-&amp;beta;1) with carrier</td><td>Cell Signaling, Frankfurt (GER)</td><td>8915LC</td><td>stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, M&amp;uuml;nchen (GER)</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich, M&amp;uuml;nchen (GER)</td><td>P7949-500ml</td><td>for washing buffer of immunofluorescent staining</td></tr></tbody></table>

a combined 3d tissue engineered in vitro/in silico lung tumor model for predicting drug effectiveness in specific mutational backgrounds

本研究では、我々は特定の突然変異背景に基づいて、薬物応答の予測を最適化するために、 シリコモデルで用いたin vitro 3D肺腫瘍モデルを組み合わせます。モデルは、基底膜を含む細胞外マトリックス組成物およびアーキテクチャに関する組織特異的特性を再現脱細胞化ブタの足場上に生成されます。私たちは、薬物治療の3日を含め14日以内に人工的な腫瘍組織の生成を可能にするプロトコルを標準化しました。私たちの記事では、読み出しの有効性を評価するための便利なツールである増殖指数Ki67染色の、M30-ELISAによって上清からアポトーシスと間葉転換 （EMT） に上皮の評価の決意のようなスクリーニング技術を、3Dのいくつかの詳細な説明を提供します治療用化合物。我々は、2D培養物にrelatある我々の3D腫瘍モデルにおける増殖の減少を比較し示すことができ臨床状況にエド。このより低い増殖のにもかかわらず、このモデルは、HCC827肺癌細胞株の比較によって示されるように正確にバイオマーカーの状態に応じてEGFR -targeted薬物応答を予測（EGFRは -mutated、KRAS野生型）およびA549（EGFR野生型KRAS -変異） チロシンキナーゼ阻害剤 （TKI）ゲフィチニブで処理しました。ビメンチン/パン - サイトケラチン免疫蛍光染色によって評価されるように、より高度の腫瘍細胞の薬物応答を調べるために、我々は、TGF-β-1との長期治療によりEMTを誘導しました。フローバイオリアクターは、組織の生成を改善し、生理的条件下に培養物を調整するために使用しました。アポトーシス、増殖指数とEMT - -ブール値へのシリコモデルではさらに、我々は、ゲフィチニブ治療またはTGF-β-1刺激の際に薬剤応答の統合を示しています。さらに、当社は、特定の突然変異背景とカウントを有する腫瘍細胞のどの薬物応答を説明します抵抗に対するerstrategiesを予測することができます。我々は、特にそのインシリコ拡大を用いたin vitroのアプローチで私たちの 3Dは2D細胞培養におけるよりもより現実的な条件での前臨床薬物検査のための付加価値を提供することを確信しています。

SISmuc足場（Cに図2A）に基づき、我々は3D腫瘍試験システム（ 図2D）の生成、刺激及び治療 ​​のための標準化された操作手順を確立しました。それぞれ、 図1および図3に示すように、このモデルは、増殖指数及びM30-ELISAを使用して、アポトーシスの定量化の決意を可能にします。3に示すA549およびHCC827モデルの代表的なH＆E染色とゲフィチニブとの一つの代表アポトーシスの測定図 。ここに提示さモデルが正常に診療所における標的阻害剤で治療されているEGFR -mutated NSCLCの例を使用して設計されています。これに対応し、唯一のEGFRは HCC827細胞を-mutatedおよびA549細胞は、アポトーシスの増加によって評価されるように我々のモデルでTKIのゲフィチニブによるEGFR阻害に応答しない。 図4 </強い&gt;は、EMT誘導因子TGF-β-1による刺激後、当社のモデルの一つの代表的な染色を示します。フローバイオリアクター増強組織の生成における動的培養条件図5C及びDに示されるように、動的な培養条件下で、ゲフィチニブは、EGFR -mutated HCC827（ 図5D）に強力な効果を有します。 図6は、ネットワーク・トポロジ（ 図6A）およびHCC827細胞（ 図6B、C）における抗EGFR療法抵抗性のシリコシミュレーションに詳細を示しています。シグナリングネットワークはCellDesignerソフトウェア26で可視化42ノードおよび55エッジのトポロジー、その結果、このようなHPRD、KEGGおよびQIAGEN（遺伝子＆経路）をとして知られている文献のデータベースを使用して生成されました。既知のドライバ変異EGFR（赤）およびc-MET共活性化のシミュレーション（緑、値では約0.7）増加prolを示していますiferation率（サーモン曲線）およびMEKおよびPI3K（ 図6B、ダークグリーン、シアン）の活性化に伴って行くHCC827細胞の抵抗（黄色）ゲフィチニブを反映して時間をかけて減少したアポトーシス率（紫色曲線）。組み合わせPI3KおよびMEK阻害剤（暗い部分と明るい灰色の曲線）のモデル化抗EGFR抵抗効果の復帰の結果は、増殖を減少させ、アポトーシス（ 図6C）を誘導します 。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53885/53885fig1.jpg" /> 図1増殖率は二次元細胞培養物に比べて3Dに低減される。のKi67陽性HCC827細胞（A赤及びB）は 、2D細胞培養物（A）とSISmucの三次元細胞培養物（B）で染色しました。 （C &lt;HCC827細胞およびA549細胞を計数し、増殖指数（のKi67陽性細胞の割合）を測定しました。5のうちカウント/ strong&gt;の、一つの代表）。 AとBにおけるスケールバー：100μmのは、 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53885/53885fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53885/53885fig2.jpg" /> TKIゲフィチニブ図2. SISmuc骨格形態と治療スケジュール細胞は、 小腸粘膜下組織 （SIS）で構成されていSISmuc +粘膜（Aに播種されています。明視野、B：SISmuc、Cの上DAPI染色細胞：オーバーレイAとBの）および治療 ​​方式はDに示されている0日で細胞冠に固定されている：ミディアム変化（MC）は、2〜3日毎に行われています。 11日目に治療を開始します。上清を回収し、M30-ELIのために使用されます時間をかけてアポトーシスを定量化するために、SA（青矢印とボックス）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53885/53885fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53885/53885fig3.jpg" /> HCC827でSISmucおよびアポトーシスを誘導する上図3.ゲフィチニブ治療の変更の細胞成長ではなく、A549 3Dで腫瘍モデル。いずれの処置がなければ、両方の細胞株は、SISmuc（AとB）の上に単分子膜を形成し、また元のcrypt構造を解決します。 A549細胞の成長パターンはゲフィチニブ（C）で処理した後に変更されていないが、HCC827細胞の数は、細長いセル形状（D）への変化を伴って減少します。培養上清からのM30-ELISA測定により見られるように、アポトーシスは、E（HCC827モデルにおいてゲフィチニブによって誘導されます</st栄&gt;、5のうち、代表的な一測定）。 Dでのスケールバー：Dに100ミクロン<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53885/53885fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53885/53885fig4.jpg" /> SISmuc上HCC827細胞における図4. TGF-β-1を誘導するEMT。3Dで培養されたHCC827細胞汎サイトケラチン（PCK）の全体的な発現を示す（Aで緑、a1）は1つだけです細胞は、（Aで赤をビメンチンを表現A2）。 TGF-β-1刺激後、細胞は細長い形状にその形態を変更し、ビメンチンの発現が強く増加される（Bで赤を、b2）は、PCKの発現が維持されているのに対し、（Bで緑、B1）。 Bにおけるスケールバー：Aの100ミクロン</強い&gt;とB。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53885/53885fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53885/53885fig5.jpg" /> 図5.動的な細胞培養は、組織の生成を強化。培養した場合、バイオリアクター（B）内の3D条件下では、静的モデル（A、H＆E染色）から単層の単層（A）から多層組織（C、H＆E染色への変更）。 HCC827細胞は、ゲフィチニブ治療（D、H＆E染色）の際に強力な薬剤応答を示しています。 Dでのスケールバー：A、C、およびDの100ミクロン<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53885/53885fig5large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53885/53885fig6.jpg" /> イチジク。 シリコ 腫瘍モデルの生成と抗EGFR療法抵抗。ネットワーク赤（EGFR経路）における重要なシグナルノードを持つ腫瘍細胞のトポロジーと緑（C-MET）とその下流のノードのシミュレーション 6.。特徴的な腫瘍（サケ）読み出したパラメータの増殖と（紫で）アポトーシスは、六角形として表されます。矢印は活性化、鈍化矢印阻害を示しています。治療標的は、暗い部分と明るい灰色の長方形で表され、ゲフィチニブによる阻害は黄色（A）に示されています。電子機能（着色曲線）による力学シミュレーションは、ブールネットワーク接続を補間する（AND、OR、NOT）増殖の増加（サケ曲線）と広告で示すようにEGFR及びc-METの共発現は、ゲフィチニブ耐性を引き起こします約任意の時点8（B）の後にアポトーシス（紫色曲線）のecrease。 PI3KおよびMEK阻害剤による（黄色の曲線下、同じ活性化、プロトコルを参照のこと）の両方の潜在的な治療タックル。（C）は、 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53885/53885fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

操作された複合三次元組織<em&gt;インビトロ</em&gt; /<em&gt;インシリコ</em具体的な突然変異背景に薬物の有効性を予測するための&gt;肺腫瘍モデル

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

a-combined-3d-tissue-engineered-vitroin-silico-lung-tumor-model-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

10.1K ビュー.  University Hospital Wuerzburg. We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity. 

ビデオ: A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

がん研究

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor cells with a natural matrix and continual flow of nutrients, as well as a model that shows the interaction of tumor cells with normal cellular components and a natural matrix. The acellular ex vivo lung model is created by isolating a rat heart-lung block and removing all the cells using the decellularization process. The right main bronchus is tied off and tumor cells are placed in the trachea by a syringe. The cells move and populate the left lung. The lung is then placed in a bioreactor where the pulmonary artery receives a continual flow of media in a closed circuit. The tumor grown on the left lung is the primary tumor. The tumor cells that are isolated in the circulating media are circulating tumor cells and the tumor cells in the right lung are metastatic lesions. The cellular ex vivo lung model is created by skipping the decellularization process. Each model can be used to answer different research questions.

Here, we present a protocol for an ex vivo lung cancer model that mimics the steps of tumor progression and helps to isolate a primary tumor, circulating tumor cells, and metastatic lesions.

無細胞性と細胞の肺転移モデル

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

人間の3次元の組織工学<em&gt; in vitroで</em&gt;腫瘍テストシステム

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

生物工学

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions contribute to tissue architectural changes observed during tumorigenesis remains challenging due to the lack of appropriate models. In this protocol, we describe the generation of a 3D coculture model using a LUSC primary cell culture known as TUM622. TUM622 cells were established from a LUSC patient-derived xenograft (PDX) and have the unique property to form acinar-like structures when seeded in a basement membrane matrix. We demonstrate that TUM622 acini in 3D coculture recapitulate key features of tissue architecture during LUSC progression as well as the dynamic interactions between LUSC cells and components of the tumor microenvironment (TME), including the extracellular matrix (ECM) and cancer-associated fibroblasts (CAFs). We further adapt our principal 3D culturing protocol to demonstrate how this system could be utilized for various downstream analyses. Overall, this organoid model creates a biologically rich and adaptable platform that enables one to gain insight into the cell-intrinsic and extrinsic mechanisms that promote the disruption of epithelial architectures during carcinoma progression and will aid the search for new therapeutic targets and diagnostic markers.

An in vitro model system was developed to capture tissue architectural changes during lung squamous carcinoma (LUSC) progression in a 3-dimensional (3D) co-culture with cancer-associated fibroblasts (CAFs). This organoid system provides a unique platform to investigate the roles of diverse tumor cell-intrinsic and extrinsic changes that modulate the tumor phenotype.

肺扁平上皮癌進行をモデル化する多次元共培養システム

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

医薬品評価研究のための3D腫瘍スフェロイドの作製

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

マイクロ流体工学に基づく血管新生ヒト微小腫瘍モデルの準備

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

著者スポットライト:トランスレーショナルがん研究のモデルとしてのヒト血管新生微小腫瘍の作成 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

操作された複合三次元組織

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創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成

無細胞性と細胞の肺転移モデル

人間の3次元の組織工学

肺扁平上皮癌進行をモデル化する多次元共培養システム

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

医薬品評価研究のための3D腫瘍スフェロイドの作製

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立