本稿では、米国エネルギー省との契約番号DE-AC05-76RL01830下バテル記念研究所によって作成されました。米国政府は、保持しており、出版社は、出版物のために記事を受け入れることによって、米国政府が何を他の人に公開したり、この原稿の発行したフォームを再現する、または許可する非独占的、払込、取消不能の、世界的なライセンスを保持していることを認めますそう、米国政府の目的のために。

1.試料の調製<ol><li>文献10,11に見られる反応器の設計および実験手順に従って、藻類の連続流HTLを経由して混合水溶液/有機生成物の流れを生成します。 </li><li>水相と有機相に生成物ストリームを分離するために、重力分離器を使用してください。 </li><li> GC-TOF-MS分析×GCのために4℃に維持冷蔵庫に0.45μmのシリンジフィルターとストアを使用してHTL水相を10mlのフィルタ。 </li></ol> 2.機器のコンポーネント<ol><li>これらの実験のためのクワッドジェットデュアルステージ冷却系モジュレーター及び飛行時間型（TOF）質量分析計（MS）を備えたガスクロマトグラフ（GC）を使用します。 </li><li> GCに各サンプルまたは標準の1μLを注入するオートサンプラーを設定します。文献13に記載されているように、オートサンプラのシーケンスのためのサンプルおよび標準注射の無作為化ブロックデザインを使用してください。 randomiZEDブロックの設計は、一般的に機器の動作を制御するために定量的な研究で使用されています。私たちの研究室では、機器の動作を確認することも比較試験において日常的なデザインを採用しています。 </li><li>変調器の前にプレスタイトコネクタを使用して、プライマリとセカンダリ列を接続します。プライマリとセカンダリの両方の列の両端をプレスタイトコネクタに接続する前に、シャープなエッジずにまっすぐにカットされていることを確認してください。 </li><li> GCカラムにフェルールを配置し、その列の5ミリメートルは、インジェクタの内部にあるように、GCインジェクタにプライマリ列を接続します。 </li><li> GCインジェクタのため、ガラスライナー、ノンスティックライナOリング、セプタムが新しいと汚染の自由であることを確認してください。 </li><li>二列および移送ラインを接続するために1月16日×0.5ミリメートルID移送ラインのフェルールを使用してください。移送ラインに二列の0.2メートル部分を配置します。 </li><li>二列の0.1メートルの部分が変調器であることを確認してください。 </li><li>超高純度ヘリウムを使用します分1.5ミリリットルの流量でGCのためのキャリアガスとしてガス-1。 </li><li>変調器内の冷却剤として機能するデュワーに十分な液体窒素があることを確認します。デュワー内の液体窒素のレベルは、その出口に取り付けられた圧力ゲージを使用して予測することができます。 0 kPaのは、それが空であることを示している圧力計69 kPaでの読みは、デュワーがいっぱいであることを示しています。 </li></ol> 3.プロトコルサンプルを分析する前に<ol><li>楽器には大きな漏れがないことを確認してください。 TOF-MSの真空計の読みを1.5ml分-1 GCカラム流量用以上2.7×10 -5 Paである場合、これは、システムの主要な漏れを示します。 </li><li>品質管理（QC）メソッドを-設定し、製造業者のプロトコルを使用して、最大信号応答を達成するために、内蔵 &#39;収集システムの調整」プロトコルを実行します。 </li><li>シリーズで、内蔵QC法の「楽器の最適化」プロトコルの実行 - filam耳鼻咽喉科フォーカス、イオン光学焦点と製造業者のプロトコルを用いた質量較正試験。質量キャリブレーション・テストに合格していることを確認してください。このQC方法は、機器のすべてのハードウェアパラメータを最適なレベルであることが保証されます。 </li><li>製造業者のプロトコルを使用して、 &quot;リークチェック」を実行します。自動的にリークチェックレポートを生成し分析します。相対的な28の濃度（N 2）のことを確認して、32（O 2）と18（水分）イオンはそれぞれ、10％未満、3％と69イオンの内部標準質量スペクトルの5％未満でなければなりません。 </li><li>製造業者のプロトコルを使用して曲TOF-MS。 </li><li>サンプルおよび標準を分析しながらも、前とリークチェック後に品質管理方法と同様にTOF-MSチューンプロトコルを実行します。 </li></ol>変調器の最適な変調周期を決定する4.プロトコル<ol><li>任意の長変調周期（ 例えば、10秒または13秒）を選択します。 2.2で説明したようにサンプルを注入します。 </li><li&gt;は何のピークが溶出しない、その後等高線図の第2次元での保持時間を特定します。最適な変調周期として識別された第2次元保持時間を選択します。 図2は明らかに等高線図の第2次元での保持時間の識別を明らかにする。 </li><li>ステップ4.1で使用される変調周期を増やして、再度解析を行う「ラップアラウンド」場合は18を観察されます。二次元におけるピークは最初の次元のベースラインより下に溶出する場合はラップアラウンド現象が発生します。 「ラップアラウンド」の例の等高線図は、補足情報図3に示されています。 </li><li>最適値が決定されるまで繰り返し、4.2と4.3のステップ。 </li></ol>インストゥルメントセットアップ5.実験パラメータ<ol><li>プライマリ列と非極性（2.3 MX 0.25ミリメートル×0.5μmの膜厚）カピラなどの極性（60 MX 0.25ミリメートル×0.5μmの膜厚）キャピラリカラムを取り付け二列としてRY列。湿気、空気と新しいGCカラムに関連した汚染物質の痕跡量を除去するために、少なくとも2時間、プライマリとセカンダリの両方の列を焼きます。 </li><li> 1.5ミリリットル分-1の流量でGC用のキャリアガスとして超高純度のヘリウムガスを使用してください。 </li><li> 250：260°Cの温度と1のスプリット比にGCインジェクタを設定します。 </li><li> 5分間、260℃の一定温度に続いて5℃分-1で260℃まで温度上昇が続く0.2分間、40℃の一定温度プライマリカラムの以下の温度プログラムを使用します。 </li><li>二列および第1カラムよりも高い5℃での二次カラム温度よりも変調器温度5℃を高く維持します。 </li><li>ホットパルスの0.8秒と冷たいパルスの1.2秒と4秒の最適な変調周期を使用してください。この値は、宗派に記載のプロトコルに基づいて決定されますイオン4。 </li><li> 270℃に移送ライン温度を設定します。 </li><li> 0秒に取得遅延や溶剤の遅延を設定します。 </li><li>それぞれ、35および800としてのm / zのより低いおよびより高い範囲を設定します。 </li><li> 400スペクトル/秒でMS検出器取得速度を設定します。 </li><li>最適化された値よりも高い150 VでMS検出器の電圧を維持します。 </li><li> 225℃でのMSイオン源温度を維持します。 </li></ol> 6.データ解析<ol><li>機器製造業者によって供給されるソフトウェアを用いてデータ処理を行います。 </li><li>データ解析方法で、次のタスクを選択します - 計算のベースライン、ベースラインより上のピークを見つけ、ライブラリ検索や計算がある/高さ。 </li><li>データファイルを使用してベースラインを追跡します。 0.5のようにベースラインオフセットを入力します。 二次元で最初の次元と0.15秒で15秒の予想ピーク幅を入力します。 </li><li> 5,000として信号対雑音比を設定し、同定のために&gt; 850の類似値化合物のfication。 </li><li>サンプル中に存在する化学化合物を同定し、転送するようにライブラリ検索モードを設定するには、市販のマススペクトルライブラリを選択します。 </li><li>製造業者のプロトコルを使用して、このデータ解析方法を使用してデータファイルを処理します。これは、データ・ファイルを処理するために少なくとも1時間を必要とします。 </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

結果は、前のサンプル調製技術なし藻類バイオ原油の水性画分に存在する極性化合物および光揮発性物質を解決するための極性×非極性の列の組み合わせの能力を示しています。非極性×極性カラムの組み合わせを使用しながら、急激なピークテーリングは、有機酸及びN-化合物について観察されました。このピークテーリングは、初期溶出光有機物のために観察されませんでした。楽器を検証する（TOF-MSの真空を1.5ml分-1のGCキャリアガス流量のために2.7×10 -5 Paの下にあった）漏れの自由であると、この現象が再現可能となっています。プレスタイトコネクタ内の場合、またはデッドボリュームに問題があった場合の動作は、クロマトグラム全体に観察されるであろうことを、コールドジェット流量が過剰であることが予想されます。しかし、遅くても溶出化合物（図に識別されない）ではない尾を行います。したがって、我々は、これがaqueの結果であると結論しますOUの試料注入/カラム構成の組合せ。 スプリット比は、スプリットフローに失われた量に対するカラムに入る試料の体積です。高いスプリット比カラムに導入される試料の量が少ないです。一般に、これはピーク容量を改善するより効率的なピークを生成します。サンプルのための適切なスプリット比を決定することは、化合物の検出（スプリット比が高すぎる）でカラムのオーバーロード（スプリット比が低すぎる）や問題から問題を防ぐことができます。したがって、1のスプリット比：250をカラム装填を防止するために、また、ピーク容量を改善するために、両方の列の組合せ用のGC-TOF-MSデータ取得方法×GCで使用しました。 同定された化学物質の類似値は850から999の範囲です。これは、化学化合物が85％以上の信頼度で識別されることを示しています。これは、GC×GCで400スペクトル/秒のMS取得速度を使用することによって達成されました211; TOF-MSデータ取得方法。 400スペクトル/秒の取得速度は、識別された化学化合物17の類似度値を増加させるピークの信号対雑音比を改善します。高い類似度値は、高い信頼度で化学化合物を同定することが可能となります。しかし、長いデータ解析時間で、この高MS取得率をもたらします。そのため、データ解析時間を減少させるこれらのサンプルの定量化のために200スペクトル/秒のMS取得速度を使用することをお勧めします。 極性×非極性で水性藻類バイオ原油を特徴付けるために開発さGC-TOF-MSデータ収集方法は、さらに、二列の長さを増加させることによって改善することができる×GC。二列の長さを増加させることにより、分解能は、試料16,17内に存在する異性体の分離を可能にする二次元で改善することができます。ピーク容量がさらに増加し​​て改善することができ二列の長さ。本論文では特徴HTL藻類水を希釈11です（炭素の約3総重量％を含んでいる）と、長い二列を必要としない場合があります。しかし、この勧告は、複雑で濃縮水性サンプルの特性評価時に有益である可能性があります。 極性カラムの最大プログラム可能な温度は260℃であるので、この方法は、長鎖脂肪酸、モノ-グリセリド、ジ-グリセリド、トリグリセリドおよびアミノ酸のオリゴマーならびに糖16として高沸点の化学化合物を溶出することができません。これらの化合物を含有するサンプルは、分析した場合、GCインジェクタとカラムを汚染する可能性があります。 GCインジェクタとカラムの汚染は、ピークテーリング、化学化合物の保持時間の変化、及び高ノイズまたは定性的ならびに定量的な特徴付けのために望ましくないMS検出器の低い信号対雑音比をもたらします。したがって、時utilizinG適切な品質管理方法を採用すべきである高沸点の化合物のアナリストを含む水性サンプルを分析するために、この列の組み合わせ。 藻類バイオ原油の水性画分で同定された化学化合物は、多種多様な用途を有します。ピリジン、ピラジン及びそのアルキル誘導体は農薬、医薬品36,37を製造するための中間体化学物質であり、かつ均一な触媒38,39における溶媒として広く使用されています。同様に、コハク酸イミドの誘導体はまた、ポリマー中間体、洗剤40、臨床薬物41,42、燃料添加剤および潤滑油添加剤40を含む多種多様な用途を有します。 HTL藻類水中に存在する有機酸は、水相43から容易に分離するケトンまたはエステルを生成する触媒プロセスにおける原料として使用することができます。 目のために開発されたGC-TOF-MS法×GCこの論文で、非極性、極性×のE列の組み合わせはまた、生物学的プロセス、食品加工、および環境廃棄物からの水のサンプルを分析するために使用することができます。研究者らは、有機試料44-47の特徴付けのために、この列の組み合わせを使用しました。脂肪族、芳香族化合物、アルキルベンゼンと二核芳香族化合44-46 -この列の組み合わせが炭 ​​化水素の異なるクラスの効果的な分離のために最善であることが報告されています。したがって、分離の二次元の分離と非極性の最初の次元の極性の分離を利用すると、両方の水の特性に適したカラム構成だけでなく、バ​​イオ、粗バイオマスの水熱液化から生産の有機画分になります。

液体燃料の需要の着実な成長、有限の化石燃料資源、化石燃料供給の不確実性、および大気中の温室効果ガスの濃度の増加に対する懸念は、再生可能な資源1のグローバル意識が高まっています。 （太陽光発電と太陽熱を含む）、太陽エネルギー、風力エネルギー、水力、地熱、バイオマスは、潜在的に、化石由来のエネルギー2を置き換えることができ、一次再生可能なエネルギー源です。これらの中で、バイオマスは、液体輸送燃料及び高価値の化学物質3の製造のための唯一の炭素ベースの代替エネルギー資源です。バイオマスは、森林資源、農業残渣、藻類、油糧種子、都市固形廃棄物、および炭素に富んだ産業廃棄物として任意の有機材料を含む（ 例えば 、紙パルプ産業から、または食品加工から）1。 COMに基づいて、リグノセルロース及び非木質原料：バイオマスは2つのカテゴリに分類され、位置特性。非木質原料は、タンパク質、炭水化物および脂質/油4を持っていながら、リグノセルロース系バイオマスは、炭水化物及びリグニンから構成されています。持続可能な栽培と5,6を収穫している場合陸生植物由来リグノセルロース原料は、唯一の現在の液体燃料（ガソリン、ジェット燃料、およびディーゼル）需要の30％を満たすことができます。したがって、このような微細藻類および真菌のような非木質水生微生物は、リグノセルロース資源を補完するために再生可能な液体燃料の生産のための潜在的な原料と考えられています。 微細藻類原料は、現在の液体輸送燃料は7,8を要求満足させる可能性を秘めています。高面積生産性8、低品質、汽水、または海水9で増殖する能力、およびエネルギー密度の高いトリグリセリドまたは炭化水素7,8を蓄積する能力：藻類は多くの利点を持っています。水熱液化（HTL）が実行可能でスケーラブル共同で自然に藻類や水生原料10,11に関連した水を利用してnバージョンのプロセス。これは、燃料ブレンドストック中にアップグレードすることができ、液体製品、またはバイオの粗を生成し、10から25 MPaでの250から400°Cと動作圧力の作動温度で熱化学プロセスです。バイオの粗藻類のHTLから生産は、区別可能と容易に分離有機層と水画分を持っています。バイオ原油の有機画分を効率的に触媒水素化処理プロセス11を介して、製油所レディブレンド株式に転換することができます。バイオ原油の水性画分は〜藻類原料中の全炭素存在の30％が含まれています。数千の化合物は、HTL水流中で同定されているが、主な画分ピロールなどの炭水化物および脂質の分解により形成され、そして窒素複素環（ピリジン（酸、アルコール、ケトン、およびアルデヒドを含む）、低分子量の含酸素化合物から構成され、ピラジンタンパク質分解12由来のES、およびイミダゾール）。全体的なプロセスの経済性を向上させるために水性画分を利用するだけでなく、持続可能性に関する研究が進行中です。合成ガスは、触媒の水熱ガス化10,13、14を介して藻類バイオ原油の水性画分から製造することができます。また、水性画分中の有機物はまた、触媒燃料添加剤と特殊化学品に変換することができます。水性液相中の有機物の変換のための触媒水熱ガス化と触媒スクリーニング研究の最適化に関する研究は、パシフィック・ノースウェスト国立研究所（PNNL）で現在進行中です。この作品、定性的なだけでなく、藻類のバイオ原油の水性画分の定量的な特徴づけのために必要とされます。藻類バイオ原油の水性画分は廃棄物の流れを考えているので、藻類バイオの粗13,15の水性画分を分析した研究はほとんどあります。また、最近の研究では、高付加価値バイオ製品にこのHTL藻水を変換すると、HTLベースのバイオ精製所11の持続可能性だけでなく、経済性を改善するだろうと結論付けました。したがって、この研究は、飛行時間型質量分析（GC-TOF-MS×GC）に結合された二次元ガスクロマトグラフィーによって藻類のHTLから得られた生体粗製の水性画分の定性的特性解析のための方法の開発に焦点を当てました。 GC-TOF-MSは、化合物の同定のための解像度（またはサンプル中の化学化合物の分離）を増加させるための最も有望なクロマトグラフ分析技術、ピーク容量（分解されたピークの、すなわち数）、信号対雑音比である（×GC ）高い信頼度で、化学化合物16の共溶出を回避します。解像度、ピーク容量、及びノイズ信号の比を最大にするために、異なる固定相を有する2つのGCカラムは圧入Cを用いて直列に接続されていますonnectorまたはマイクロユニオン17（本研究で用いたGC-TOF-MSシステム×GCのブロック図である図1を参照）。変調器は再フォーカス、トラップにプレスフィットコネクタと二列の間に位置しており、二次コラム18に第1カラムからの流出物を再注入されます。 図1に示すように、変調は、本研究では二列に起こる。二カラムを次に移送ラインアセンブリを介してTOF-MSに接続されています。 GC-TOF-MS×GCは、原油16,19、ガソリン、ジェット燃料、ディーゼル、バイオディーゼル、バイオ燃料の有機画分として定性的並びに有機試料の定量分析のために以前に使用されました20-熱化学だけでなく、熱触媒変換から生成された22は 23,24を処理します 。 GC-TOF-MS機器、長い​​非極性カラムワット×GCでこれらの有機サンプルの特徴づけのための短い極性カラムは、二列として使用しながら、一次カラムとして使用されます。この従来のカラム構成は、第二次元18で極性が続く最初の次元を超えるボラティリティの差を利用する化学化合物を解決します。準備が17,25-30ステップを通して試料があった後、水または水サンプルの生物学的プロセスから、食品加工、及び環境廃棄物も、同様のプライマリ/セカンダリ列構成を使用して特徴づけました。そのような誘導体化、固相抽出、及び有機溶媒抽出などのサンプル調製技術は、すべてのGC-TOF-MS分析17,27-29,31,32×GCに先立って使用されてきました。これらの技術は、従来のカラム構成33を使用して、分析のために試料中の化合物の極性が減少することを目的としました。代替戦略は、試料の性質に基づいて、本研究で使用した（水中ここで、極性有機化合物）GC-TOF-MS分析×GCのリバースプライマリ/セカンダリカラム構成を利用します。バイオ原油HTLから製造の水性画分ので、極性化合物13を有し、一次極性カラムと第二非極性カラムのカラムの組み合わせは、任意の上流の試料調製なしGC-TOF-MS×GCで使用しました。このプライマリ/セカンダリ列の組み合わせは、二次元の変動が続く最初の次元を超える極性の差に基づいて化学物質を、解決します。制限された分析方法は、前のサンプル処理15することなく、二次元ガスクロマトグラフィーを用いて、水性試料の特徴付けのために、文献中に存在します。 本研究の目的は、藻類バイオ原油の水性画分中に存在する化学化合物を決定することでした。この目的を達成するために、GC-TOF-MSデータ取得方法×GCは、極性の列の列の組み合わせを用いて開発された（プリム進））、非極性（二×。 Klenn ら 。 （2015）は、プライマリ列に対して、第1カラム（特に60メートルGCカラム）と二列のオフセット温度を下げるの長さを増加させると、ピークキャパシティと解像度16-18を最大化することを示唆しました。したがって60 m個のプライマリカラムと5°Cは、本研究で使用した主要なカラムに対して二カラムの温度をオフセット。最適変調周期は、この研究に記載されているプロトコル（セクション4を参照）に従って決定しました。 GCカラム温度の最適ランプ速度は、試行錯誤法によって決定され、文献16〜18に提案された値と同様であるしました。水性サンプルのため、この列の組み合わせの利点を議論するために、我々は、極性、非極性×の従来のカラムの組み合わせでHTL藻類の水試料を分析しました。文献で提案動作パラメータは、水性を分析するために使用しました非極性×極性カラムの組み合わせ18と藻類バイオ原油の分数。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="867">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">GC &#215; GC - TOF/MS</td>
			<td style="width:199px;">Leco</td>
			<td style="width:151px;">PEG4D11DLN15</td>
			<td style="width:268px;">Commercial Pegasus 4D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChromaTOF version 4.50&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Leco</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:268px;">Data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Rxi-5MS GC column</td>
			<td style="width:199px;">Restek</td>
			<td style="width:151px;">13420</td>
			<td style="width:268px;">2.3 m column was used from this column.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Stabilwax GC column</td>
			<td style="width:199px;">Restek</td>
			<td style="width:151px;">10626</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">HP-5 GC column</td>
			<td style="width:199px;">Agilent</td>
			<td style="width:151px;">19091J-416</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Stabilwax GC column</td>
			<td style="width:199px;">Restek</td>
			<td style="width:151px;">15121</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Presstight Connector</td>
			<td style="width:199px;">Restek</td>
			<td style="width:151px;">20430</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">GC injector liner</td>
			<td style="width:199px;">Restek</td>
			<td style="width:151px;">23305.5</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">GC Injector ferrules</td>
			<td style="width:199px;">Agilent</td>
			<td style="width:151px;">5181-3323</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Non-stick liner O-rings</td>
			<td style="width:199px;">Agilent</td>
			<td style="width:151px;">5188-5365</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Transfer line ferrules</td>
			<td style="width:199px;">Restek</td>
			<td style="width:151px;">20212</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Ethanol</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">459844</td>
			<td style="width:268px;">Chromatography grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Acetone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">414689</td>
			<td style="width:268px;">Chromatography grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">320099</td>
			<td style="width:268px;">Chromatography grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">2-butanone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">360473</td>
			<td style="width:268px;">Chromatography grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Propanoic acid</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">402907</td>
			<td style="width:268px;">Chromatography grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Butanoic acid</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">19215</td>
			<td style="width:268px;">Chromatography grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Pyridine</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">270970</td>
			<td style="width:268px;">Chromatography grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Pyrazine</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">65693</td>
			<td style="width:268px;">Chromatography grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Acetamide</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">695122</td>
			<td style="width:268px;">Chromatography grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">2,5-pyrrolididione</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">S9381</td>
			<td style="width:268px;">Chromatography grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">N-methylsuccinimide</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">325384</td>
			<td style="width:268px;">Chromatography grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:249px;">N-(2-hydroxyethyl)succinimide</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">444073</td>
			<td style="width:268px;">Chromatography grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qualitative characterization of the aqueous fraction from hydrothermal liquefaction of algae using 2d gas chromatography with time-of-flight mass spectrometry

飛行時間型質量分析と結合した二次元ガスクロマトグラフィーは、複雑な混合物中の化学成分を同定および定量化するための強力なツールです。多くの場合、ガソリン、ジェット燃料、ディーゼル、バイオディーゼル、バイオ原油/バイオオイルの有機画分を分析するために使用されます。これらの分析のほとんどでは、分離の最初の次元は、極性の分離に続いて、非極性です。バイオ燃料の生産からバイオ原油と他の水性サンプルの水性画分を同様のカラムの組み合わせで検討されています。しかしながら、このような誘導体化、溶媒抽出、固相抽出などの試料調製技術が必要でした 分析前に。この研究では、藻類の熱水液化から得られた水性画分を、続いて第一の次元での極性分離を用いた従来の試料調製技術なしで飛行時間型質量分析計と結合した二次元ガスクロマトグラフィーによって特徴付けられました第二の非極性分離による。この分析からの二次元プロットは、より伝統的なカラム構成から得られたものと比較しました。藻類バイオ原油の水性画分の定性的な特性評価の結果を詳細に議論されています。飛行時間型質量分析と結合した二次元ガスクロマトグラフィーによる水性試料中の有機物の特性評価のための非極性の分離に続いて、極性分離を使用することの利点が強調されています。

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Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

飛行時間型質量分析法と2Dガスクロマトグラフィーを用いて藻類の水熱液化からの水性画分の質的特性評価

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.3K ビュー.  Pacific Northwest National Laboratory. A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating. 

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Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for sample pretreatment. The method was first described by Fenn and colleagues1 and has been applied to the detection of illicit drugs2 and explosives3-4, the characterization of skin volatiles5, and the analysis of breath6-7.
SESI ionization occurs by proton transfer reactions between the electrospray solution and the volatile analyte, and is therefore suitable for the analysis of hetero-organic molecules, just as in traditional electrospray ionization (ESI). However, unlike standard ESI, the proton transfer process of SESI occurs in the vapor phase rather than in solution (Fig. 1), and therefore SESI is best suited for detecting organic volatiles and aerosols.
We are expanding the use of SESI-MS to the detection of bacterial volatiles as a method for bacterial identification and characterization8. We have demonstrated that SESI-MS volatile fingerprinting, combined with a statistical analysis method, can be used to differentiate bacterial genera, species, and mixed cultures in a variety of growth media.8 Here we provide the steps for obtaining bacterial volatile fingerprints using SESI-MS, including the instrumental parameters that should be optimized to ensure robust bacterial identification and characterization.

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) enables the detection of volatile organic compounds (VOCs) without the need for any sample pretreatment. This protocol provides instructions for the rapid (within minutes) characterization of bacterial VOCs using SESI-MS.

二次エレクトロスプレーイオン化質量分析法（SESI - MS）を用いて細菌揮発性物質の特性評価

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

生物工学

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

水性二相系を用いた細胞の共培養パターニング

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析法による生体組織のイメージング

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet

Various cell transfection techniques exist and these can be broken down to three broad categories: viral, chemical and mechanical. This protocol describes a mechanical method to temporally permeabilize adherent cells using an inert gas jet that can facilitate the transfer of normally non-permeable macromolecules into cells. We believe this technique works by imparting shear forces on the plasma membrane of adherent cells, resulting in the temporary formation of micropores. Once these pores are created, the cells are then permeable to genetic material and other biomolecules. The mechanical forces involved do run the risk of permanently damaging or detaching cells from their substrate. There is, therefore, a narrow range of inert gas dynamics where the technique is effective. An inert gas jet has proven efficient at permeabilizing various adherent cell lines including HeLa, HEK293 and human abdominal aortic endothelial cells. This protocol is appropriate for the permeabilization of adherent cells both in vitro and, as we have demonstrated, in vivo, showing it may be used for research and potentially in future clinical applications. It also has the advantage of permeabilizing cells in a spatially restrictive manner, which could prove to be a valuable research tool.

This protocol describes a method for the temporary permeabilization of adherent cells using an inert gas jet. This technique facilitates the transfer of genetic material and biomolecules into adherent mammalian cells by the utilization of mechanical forces to disrupt the plasma membrane.

不活性ガスジェットを用いて接着した細胞の透過性

Various cell transfection techniques exist and these can be broken down to three broad categories: viral, chemical and mechanical. This protocol describes ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

3次元細胞培養モデルの質量分析イメージング用試料調製の戦略

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

薬物検査のための水性二相系と癌細胞スフェロイドのロボット生産

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe a novel protocol employing the TiO2 photocatalysis to locally alter cell affinity of the substrate surface. For this experiment, a thin TiO2 film was sputter-coated on a glass coverslip, and the TiO2 surface was subsequently modified with an organosilane monolayer derived from octadecyltrichlorosilane (OTS), which inhibits cell adhesion. The sample was immersed in a cell culture medium, and focused UV light was irradiated to an octagonal region. When a neuronal cell line PC12 cells were plated on the sample, cells adhered only on the UV-irradiated area. We further show that this surface modification can also be performed in situ, i.e., even when cells are growing on the substrate. Proper modification of the surface required an extracellular matrix protein collagen to be present in the medium at the time of UV irradiation. The technique presented here can potentially be employed in patterning multiple cell types for constructing coculture systems or to arbitrarily manipulate cells under culture.

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.

TiOを使用して水性環境中のタンパク質や細胞を光パターニング<sub&gt; 2</sub&gt;光触媒

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

2Dと3Dの肌の改善<em&gt;インビトロ</em分子クラウディングの使用&gt;モデル

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.