MN-Sは全米科学財団からの支援を承認、RUIは、著者は感謝してサーモフィッシャーサイエンティフィックLTQオービトラップXL質量分析計を使用するためにノースカロライナ大学グリーンズボロ校でトライアド質量分析施設を承認CHE 1011859.を付与します。作者はこの作品に関する有用な提案やコメントのためにノースカロライナ大学グリーンズボロ校でダニエル・トッド、ヴィンセントシーカ、およびBrandie Erhmannに感謝します。

注：使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。塩化水銀は有毒化学物質です。それと関連するすべてのソリューションを渡す際に個人用保護具（手袋、安全ゴーグル、および白衣）を着用しなければなりません。重金属のために指定された明確に表示化学廃液ボトル内のソリューションを処分。 5 mMの脱気したギ酸アンモニウム緩衝液（pH7.5）の調製<ol><li> HPLCグレードの水450ミリリットルにギ酸アンモニウム緩衝液の0.1576グラムを溶解します。 1 Mギ酸および7.5から1 M水酸化アンモニウムで上記溶液のpHを調整します。 500ミリリットルのメスフラスコに、このソリューションを移し、5 mMのギ酸アンモニウム溶液を作製するために検量線にHPLC水を追加します。 </li><li>アルゴンで10分間パージするための真空システムの下で5 mMのギ酸アンモニウム緩衝液を脱気。アルゴン下で二回繰り返して、ストア・ソリューション。使用の日に、血友病0.2ミクロンフィルターを通して緩衝液をフィルタE使用。 </li></ol>水銀（II）塩化物溶液の調製<ol><li> 0.2375グラムの水銀（II）塩化物を秤量。 0.035 M水銀（II）塩化物溶液を生成するために5mMのギ酸アンモニウム緩衝液25ml中に溶解します。 </li><li> 7.5×10 -4 Mのソリューションを作成するために、9.785ミリリットルの5mMのギ酸アンモニウムバッファーに0.214ミリリットル0.035 M水銀（II）塩化物溶液を追加します。アルゴンガスを7.5×10 -4 Mの水銀（II）溶液をブランケット。 </li></ol> CGGCストック溶液の調製<ol><li> HPLCグレードのアセトニトリルの0.118ミリリットルで、dicysteinylテトラペプチド、CGGC 2.0mgのを溶解した後、5 mMのギ酸アンモニウム、5mMのCGGC原液を得アルゴンで脱気されたpHが7.5の緩衝液1.0647ミリリットルを追加します。 </li><li> 7.5×10 -4 M CGGC溶液を得5mMのアンモニウム形成のpHの1,275μlの7.5バッファに5 mMのCGGC原液の225μLを加えます。 </li></ol> 4.準備水銀（II）とCGGCの種々の反応混合物<ol><li>水銀の0.5比（II）：CGGC液1の調製<ol><li> 1.5mlの微小管に5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液を255μLを入れます。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。 </li><li> 10秒のためのソリューションをVORTEX。その後、1.5mlの微小に7.5×10 -4 M CGGC溶液を15μlを添加します。 10秒のためのソリューションをVORTEX。ソリューションは、質量分析計に注入前に10分間放置してみましょう。 </li></ol></li><li>水銀の1の比率（II）：CGGC液1の調製<ol><li> 1.5mlの微小管に5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液を240μLを入れます。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。 </li><li> 10秒のためのソリューションをVORTEX。そして、1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに7.5×10 -4 M CGGC溶液を30μlを添加します。 4.1節で説明したと同様に繰り返します。 </li></ol></li><li>水銀の2比（II）：CGGC液1の調製<ol><li> 1.5mlの微小管に5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液を210μLを入れます。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。 </li><li> 10秒のためのソリューションをVORTEX。その後、1.5mlの微小管に7.5×10 -4 M CGGC溶液を60μlを添加します。 4.1節で説明したと同様に繰り返します。 </li></ol></li></ol> CEEC原液の5準備<ol><li>ペプチドを溶解させ、HPLCグレードのアセトニトリルの0.145ミリリットルで、dicysteinylテトラペプチド、CEECの3.5 mgの溶解。その後5mMのギ酸アンモニウム、0.5メートルを生成するためにアルゴンで脱ガスされたpHが7.5の緩衝液13.067ミリリットルを加えますM CEECソリューション。 </li><li>すべてのペプチドが溶解するまで溶液をボルテックス。 7.5×10 -5 M CEEC溶液を得、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに、1.125ミリリットル0.5 mMのをpH7.5のバッファーをCEEC液および5mMのギ酸アンモニウムの0.375ミリリットルを追加します。ボルテックス混合されるまで。 </li></ol>水銀（II）とCEECソリューションの様々な反応混合物の調製6。 <ol><li> 1の調製：水銀（II）の比は0.5：CEEC溶液<ol><li> 1.5mlの微小管に5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液を255μLを入れます。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。 </li><li> 10秒のためのソリューションをVORTEX。その後、1.5mlの微小管に7.5×10 -4 M CEEC溶液を15μlを添加します。 4.1節で説明したと同様に繰り返します。 </li></ol></li><li>水銀（II）の1：1の比：1の調製CEECソリューション<ol><li> 240を配置81; 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液のリットル。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。 </li><li> 10秒のためのソリューションをVORTEX。その後、1.5mlの微小管に7.5×10 -4 M CEEC溶液を30μlを添加します。 4.1節で説明したと同様に繰り返します。 </li></ol></li><li>水銀（II）の2比：1の調製CEECソリューション<ol><li> 1.5mlの微小管に5 mMのギ酸アンモニウム、pH7.5の緩衝液を210μLを入れます。ギ酸アンモニウム緩衝液1.5 mlマイクロチューブに7.5×10 -4 Mの水銀（II）塩化物溶液の30μlのを追加します。 </li><li> 10秒のためのソリューションをVORTEX。その後、1.5mlの微小管に7.5×10 -4 M CEEC溶液を60μlを添加します。 4.1節で説明したと同様に繰り返します。 </li></ol></li></ol> 7. ANALYオービトラップESI質量分析による水銀（II）とCGGCサンプルの反応混合物をシュッ<ol><li> ESI質量分析計16の準備 <ol><li> 500μlのガラスシリンジに校正標準の100μLを描画します。 </li><li> 、MSポンプのシリンジクレードルに注射器を置き、チューブを取り付け、質量分光光度計の中に注入します。 </li><li>ファイルのアイコンを選択し、ファイル名を入力して実行するためのファイル名を設定します。 </li><li>データ取得モジュールで取得するデータボタンを選択し、150スキャンを収集します。 </li><li>ソフトウェアのデータ処理モジュールを開くことによって、較正基準を検証するクロマトグラムを分析します。モジュールを開き、メニューをファイルに移動して、「オープン」を選択し、ダイアログボックスでファイルを選択します。クロマトグラムのピークが基準の比率を質量電荷に相関していることを確認します。 </li><li> 500μlのHPLCグレードのメタノールを描画することにより500μlのガラスシリンジをきれいにして、Mを分配ビーカーにエタノール。 </li><li>ガラスシリンジにHPLCグレードのメタノール500μlのを描画し、ステップ7.1.2のとおりにシステムをフラッシュします。 </li><li>パラメータを設定するためのソフトウェアの方法のセットアップ・モジュールを選択します。スキャンモードメニューを選択し、FTMSなどの分析器を特定し、「OK」をクリックしてください。シースガス流量：10、ソース温度：0、キャピラリー電圧：37 V、チューブレンズ：95 V、スプレー電圧：4.20 kVのその後のリアルタイムビュースペクトルページのさまざまなアイコンをクリックすることで、以下のパラメータを設定します、フローは10.00μL/ minで、アナライザを評価：FTMS、スキャン数：150。 </li></ol></li><li> ESI質量分析計でCGGCサンプルを実行します<ol><li> 5 mMのギ酸アンモニウムpH7.5のバッファーを実行します。 <ol><li> 、500μlのガラスシリンジに5 mMのギ酸アンモニウム緩衝液500μlを置き、MSポンプのシリンジクレードルにそれを置き、チューブを取り付けます。 </li><li> 1-2分間チューブを介してバッファを実行します。 </li><li>ランのファイル名を設定しますファイルのアイコンを選択し、ファイル名を入力して。 </li><li>モジュール内の取得データ]ボタンを選択し、150スキャンを収集します。 </li><li> 150スキャンを収集した後に収集を停止するには[実行]ボタンをクリックします。 </li><li>データブラウザモジュールを開き、メニューをファイルに移動して、「オープン」を選択し、ダイアログボックスでファイルを選択します。ペプチドまたは水銀（II） - ペプチド複合体に似ていることに何の483、683、1163および1363のピークのm / zが存在しないことを確認します。 </li></ol></li><li> 0.5水銀（II）：CGGC比液1を実行します。 <ol><li> 0.5水銀（II）：注射器への試料のCGGC比1の250μLを入れます。 </li><li>チューブ、および素数装置を取り付け、MSポンプのシリンジクレードルに注射器を置きます。 </li><li>ファイルのアイコンを選択し、ファイル名を入力して実行するためのファイル名を選択します。 </li><li>データ取得モジュールで取得するデータボタンを押して、150スキャンを収集し、収集を停止するには[実行]ボタンをクリックします。 </li><li>モジュールを開き、メニューをファイルに移動して、「オープン」を選択し、ダイアログボックスでファイルを選択します。クロマトグラムは、単独でCGGCペプチドのための1つを含むピークが含まれていることを確認します。 </li><li> 500μlのギ酸アンモニウム緩衝液で吸引した後、ビーカーにギ酸アンモニウムバッファーを分配することによって、注射器を洗浄します。 </li><li> MSの廃棄物のボタンを選択し、チューブに500μlのギ酸アンモニウム緩衝液で3回洗浄します。 </li><li> 500μlのメタノールで吸引した後、ビーカーにメタノールを分配することによって、注射器を洗浄します。 </li><li> 500μlのメタノールでチューブ1時間をフラッシュします。 </li><li> MSの負荷検出器のボタンを選択します。 </li><li>シリンジにギ酸アンモニウム緩衝液500μlを追加します。 </li><li>チューブ、および素数装置を取り付け、MSポンプのシリンジクレードルに注射器を置きます。 </li><li>ファイルのアイコンを選択し、ファイル名を入力して実行し、バッファのファイル名を選択します。 </li><li>押す取得データボタンと150スキャンを収集した後、停止実行ボタンをクリックします。 </li><li>データブラウザモジュールを開き、メニューをファイルに移動して、「オープン」を選択し、ダイアログボックスでファイルを選択します。 CGGCラン：クロマトグラムは、前水銀からのピークの空隙であることを確認します。 </li></ol></li><li> 1水銀（II）：CGGC比液1を実行します。 <ol><li>シリンジにCGGC比サンプル：1の水銀（II）：1の250μLを入れます。 </li><li> 7.2.2.15までの流れ7.2.2.2で説明したように、同様に繰り返します。 </li></ol></li><li> 2水銀（II）：CGGC比液1を実行します。 <ol><li>シリンジにCGGC濃度サンプル：2水銀（II）：1の250μLを入れます。 </li><li> 7.2.2.15までの流れ7.2.2.2で説明したように、同様に繰り返します。 </li></ol></li></ol></li></ol> 8.オービトラップESI質量分析法による水銀およびCEECサンプルの反応混合物の分析<ol><li> ESI質量分析計でCEECサンプルを実行します<ol><li>繰り返し分析手順（ステップ7.1〜7.2）CEECサンプルや様々な化学量論比での水銀（II）とCEECの反応混合物を使用。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Clifton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury+exposure+and+public+health.">Mercury exposure and public health.</a> Pediatr. Clin. N. Am. 54, 237-269 (2007).</li><li>Andersen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+Recent+Developments+in+Chelation+Treatment+of+Metal+Intoxication.">Principles and Recent Developments in Chelation Treatment of Metal Intoxication.</a> Chem. Rev. 99, 2683-2710 (1999).</li><li>Aposhian, H. V., Maiorino, R. M., Gonzalez-Ramirez, D., Zuniga-Charles, M., Xu, Z., Hurlbut, J. M., Junco-Munoz, P., Dart, R. C., Aposhian, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+heavy+metals+by+newer,+therapeutically+useful+chelating+agents.">Mobilization of heavy metals by newer, therapeutically useful chelating agents.</a> Toxicology. 97, 23-38 (1995).</li><li>Flora, S. J. S., Pachauri, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelation+in+Metal+Intoxication.">Chelation in Metal Intoxication.</a> Int. J. Environ. Res. Public Health. 7, 2745-2788 (2010).</li><li>Campbell, J. R., Clarkson, T. W., Omar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+use+of+2,3-dimercaptopropane-1-sulfonate+in+two+cases+of+inorganic+mercury+poisoning.">The therapeutic use of 2,3-dimercaptopropane-1-sulfonate in two cases of inorganic mercury poisoning.</a> JAMA. 256, 3127-3130 (1986).</li><li>Rooney, J. P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+thiols,+dithiols,+nutritional+factors+and+interacting+ligands+in+the+toxicology+of+mercury.">The role of thiols, dithiols, nutritional factors and interacting ligands in the toxicology of mercury.</a> Toxicology. 234, 145-156 (2007).</li><li>Lin, X., Brooks, J., Bronson, M., Ngu-Schwemlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evalution+of+the+association+of+mercury+(II)+with+some+dicysteinyl+tripeptides.">Evalution of the association of mercury (II) with some dicysteinyl tripeptides.</a> Bioorg. Chem. 44, 8-18 (2012).</li><li>Ngu-Schwemlein, M., Lin, X., Rudd, B., Bronson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+ESI+mass+spectrometric+analysis+of+the+association+of+mercury(II)+with+multi-cysteinyl+peptides.">Synthesis and ESI mass spectrometric analysis of the association of mercury(II) with multi-cysteinyl peptides.</a> J. Inorg. Biochem. 133, 8-23 (2014).</li><li>Winther, J. R., Thorpe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+thiols+and+disulfides.">Quantification of thiols and disulfides.</a> Biochimica et. Biophysica Acta. 1840, 838-846 (2014).</li><li>D'Agstino, A., Colton, R., Traeger, J. C., Cantry, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrospray+Mass+Spectrometric+Study+of+Organomercury+(II)+and+Mercuric+Interactions+with+Peptides+Involving+Cysteinyl+Ligands.">An Electrospray Mass Spectrometric Study of Organomercury (II) and Mercuric Interactions with Peptides Involving Cysteinyl Ligands.</a> Eur. Mass Spectrom. , 273-285 (1990).</li><li>Hofstadler, S. A., Sannes-Lowery, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+ESI-MS+in+drug+discovery:+interrogation+of+noncovalent+complexes.">Applications of ESI-MS in drug discovery: interrogation of noncovalent complexes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5, 585-595 (2006).</li><li>Rubino, F. M., Verduci, C., Giampiccolo, R., Pulvirenti, S., Brambilla, G., Columbi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Characterization+of+Homo-+and+Heterodimeric+Mercury+(II)-bis-thiolates+of+Some+Biologically+Relevant+Thiols+by+Electrospray+Ionization+and+Triple+Quadruple+Tandem+Mass+Spectrometry.">Molecular Characterization of Homo- and Heterodimeric Mercury (II)-bis-thiolates of Some Biologically Relevant Thiols by Electrospray Ionization and Triple Quadruple Tandem Mass Spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 288-300 (2003).</li><li>Krupp, E. M., Milne, B. F., Mestrot, A., Meharg, A. A., Feldmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+into+mercury+bound+to+biothiols:+structural+identification+using+ESI-ion-trap+MS+and+introduction+of+a+method+for+their+HPLC+separation+with+simultaneous+detection+by+ICP-MS+and+and+ESI-MS.">Investigation into mercury bound to biothiols: structural identification using ESI-ion-trap MS and introduction of a method for their HPLC separation with simultaneous detection by ICP-MS and and ESI-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 390, 1753-1764 (2008).</li><li>Schauml&#246;ffel, D., Tholey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+directions+of+electrospray+mass+spectrometry+for+elemental+speciation+analysis.">Recent directions of electrospray mass spectrometry for elemental speciation analysis.</a> Anal. Bioanal. Chem. 400, 1645-1652 (2011).</li><li>Patiny, L., Borel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChemCalc:+a+building+block+for+tomorrow's+chemical+infrastructure.">ChemCalc: a building block for tomorrow's chemical infrastructure.</a> J. Chem. Inf. Model. 53, 1223-1228 (2013).</li><li>Thermo Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Xcaibur Versions 2.1.0-2.3.0 Data Acquisition and Processing User Guide. Revision E. United States. , (2012).</li><li>Falcone, G., Foti, C., Gianguzza, A., Giuffr&#232;, O., Napoli, A., Pettignano, A., Piazzese, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequestering+ability+of+some+chelating+agents+towards+methylmercury(II).">Sequestering ability of some chelating agents towards methylmercury(II).</a> Anal. Bioanal. Chem. 405 (2), 881-893 (2013).</li><li>Mah, V., Jalilehvand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+Complex+Formation+with+Mercury(II)+in+Aqueous+Solution+at+Physiological+pH.">Glutathione Complex Formation with Mercury(II) in Aqueous Solution at Physiological pH.</a> Chem. Res. Toxicol. 23, 1815-1823 (2010).</li></ol>

There is no disclosure for the work reported.

疎水dicysteinylテトラペプチドCGGC（C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; = 338 MW）は、図2 及び表1に示すように（ 図1）は 、水銀（II）と複合体を形成しさらに、ペプチド二量体および三量体を形成します。増分反応混合物中のペプチドの量が増加します。 [+ = 1015（3M + H）]のm / z関連する二量体の値[（2M + H）+ = 677]とトリマーによって示されるように、CGGCのチオール基は、実験条件下でジスルフィドを形成するために酸化されませんでした。これらの関連CGGC種の形成は、このテトラペプチドの疎水性によるものである可能性があります。以前dicysteinylトリペプチド7について報告されているように2水銀（II）:(ペプチド）2錯体：1水銀（II）：ペプチド1 CGGC水銀が1に対応する錯体の2つのタイプを形成します。しかし、過剰なまたは同等の水銀（II）の存在下で、それはまた、FORMS 2：2 [水銀（II）] 2（ペプチド）2錯体。 CEECテトラカルボキシル化dicysteinyl（C 16 H 26 N 4 O 9 S 2; MW = 482）水銀と（ 図1）複合体を形成する（II） 図3 および表1に示すように、それは容易にはとしてCEEC二量体を形成しませんでした。それは、より疎水性CGGCのために観察します。 1水銀（II）：ペプチドと1：2の水銀（II）:(ペプチド）2錯体CGGCに匹敵する、それは水銀が1に対応する複合体を形成します。 2 [水銀（II）] 2：（ペプチド）より容易に2複雑なしかし、補助カルボキシレート基とは、2を形成します。 1 [水銀（II）] 2：ペプチド複合体と4：2 [水銀（II）] 4：CGGCについて観察されなかった（ペプチド）2ペプチド複合体、また、過剰な水銀では、2を形成します。 複合fに対する観測信号の概要ormed m / z値を表1に示すとおりです。 <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/53536/53536table1.jpg" /> 表 水銀ペプチド複合信号の 1 概要。ギ酸アンモニウム緩衝液、pH 7.5でLTQ /オービトラップMSクロマトグラム中の水銀ペプチド複合体信号。 ペプチドなどdicysteinylテトラペプチド補助結合基の存在：私たちは、水銀（II）と2つのdicysteinylのテトラペプチドの反応は水銀（II）の初期比に依存している複合体を形成することを明らかにしました。また、指定されたエレクトロスプレーイオン化条件下で形成された複合体中の水銀およびペプチドの正確な化学量論は、異なる水銀同位体分布パターンに基づいて、高分解能ESI質量分析法を用いて決定することができます。 システイニルPEPTを反応させるには水銀（II）とのIDEは、注意がジスルフィド結合を形成するシステインのチオール基の酸化を防ぐために注意しなければなりません。記載されたプロトコル内で、緩衝液を慎重に脱気し、アルゴン下で保存しました。また、全ての反応サンプルを、ESI質量分析による分析の直前に調製されます。 2テトラペプチド、CEECとCGGC間の溶解度の違いに起因して、種々の濃度のストック溶液を調製しました。 CGGCペプチドの冷凍ストックをアセトニトリルで湿潤させ、容易に7.5×10 -4 M CGGC溶液を生成するために5mMのギ酸アンモニウム緩衝液（pH7.5）に続いて溶解させました。 CEECは、低濃度で調製した7.5×10 -5 M、水銀の前（II）：、その低い溶解性のペプチド反応混合工程。水銀を分析するための最適な希釈（II）錯体があるため、ペプチドおよび可能にする溶解度を10 -5 Mであるとみなされました質量分析計内の残留物の除去のため。 CGGCソリューションとの契約では、CEEC残基は、時折、チューブの交換が必要チューブに付着。 水銀ペプチド複合体の分析のためのESI質量分析法を使用することの重要性は、分析物のそのソフトイオン化です。これは無視でき断片化分子イオンの分析を容易にします。この作業に示すように、署名水銀同位体分布パターンに基づいて、水銀 - ペプチド複合体の化学量論を特徴付けるために使用することができます。しかし、揮発性緩衝系は、ESI質量分析法による分析のために必要です。これは、溶解のために揮発性の低い溶媒または緩衝化媒体を必要とする分析物を同定するための実用的な使用を制限することができます。 我々は以前に7,8述べたように、ESI質量分析は、水銀とPEPTの化学量論の正確な決意のための高感度な分析ツールを提供指定されたエレクトロスプレーイオン化条件の下で水銀 - ペプチド複合体でIDE。しかし、中の複合体の含有量のより正確な決意を提供するために（例えば、1 H、13 C、199 HgのNMR分光法、拡張X線吸収微細構造、または電位差17-18）追加のメソッドを使用する必要があります溶液。 我々は、オービトラップ質量分析器とのESIは、水銀 - ペプチド複合体を分析するために使用され得ることを示しました。我々は、この技術は、他の金属イオンと種々の低分子化合物との複合体の分析に向けて適用することができることを期待します。これは、異なる同位体の形態で存在することができる他の金属イオンによって形成された複合体を分析するために特に有用であろう。

Current clinical drugs prescribed for chelation therapy of mercury poisoning1 contain thiol group(s), which is/are responsible for binding and sequestering mercury ions2,3. However, studies have shown that these small thiol compounds [dimercaptosuccinic acid (DMSA) and dimercaptopropane-sulfonic acid (DMPS)] are not optimal for mercury chelation therapy4-6. Therefore, there is a need to understand the association and complex formation tendencies of mercury with thiols to enhance the rational drug design of thiol compounds for mercury chelation. Recently, we reported that n-alkyl and aryl dicysteinyl tripeptides with dithiol groups can serve as effective "double anchors" to accommodate the coordination sites of mercury(II) to form 1:1 mercury(II):peptide and 1:2 mercury(II):(peptide)2 complexes7. Additionally, we studied the effect of increasing cysteinyl residues on complex type formations8. In this study, we investigate the association of mercury(II) with two dicysteinyl tetrapeptides, where the cysteinyl residues are separated by two amino acid residues. In order to evaluate the effect of auxiliary binding groups for mercury, the intervening amino acids are either two glycine (unsubstituted) residues or two glutamic acid (gamma-carboxylated) residues. 
The reaction of cysteinyl peptide with mercury(II) requires conditions that will prevent the oxidation of the cysteinyl thiol groups to form disulfide bonds9. Moreover, the association of mercury(II) with cysteinyl peptides to form various types of mercury-peptide complexes is dependent on the initial ratio of mercury(II): peptide in the reaction mixture7,8. The types of mercury-peptide complexes formed in these reaction mixtures can be analyzed by soft-ionization mass spectroscopy, which is a sensitive analytical tool for determining species interactions between metal ions and peptides10-14. Accordingly, it will provide a profile of the various types of mercuriated peptide adducts that are formed under a specified electrospray ionization condition. Here, we will show how cysteinyl peptides and mercury(II) chloride solutions can be prepared in degassed ammonium formate buffer solution blanketed with argon to minimize oxidation. By reacting varying mole equivalents of mercury(II) with dicysteinyl tetrapeptides, we will show how the initial ratio of mercury(II):peptide has an effect on the types of complexes formed. We will also show how electrospray ionization (ESI) mass spectrometry can be used as a characterization tool to provide an accurate stoichiometry of mercury to peptide in the complexes formed. The associated video protocol will demonstrate the experimental conditions for preparing the mercury complexes, the procedure for analyzing the reaction mixtures under specified electrospray ionization conditions, and the characterization of the stoichiometries of mercury(II)-dicysteinyl tetrapeptide complexes, based on the distinct mercury isotope distribution patterns, by using the ChemCal program15. It is intended to assist those who are interested in using ESI orbitrap mass spectrometry to analyze various complexes formed by metal ions that exist in different isotopic forms.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mercury(II) chloride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">429724</td>
			<td style="width:167px;">Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ammonium formate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">516961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Formic acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td>A512-P500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC water</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">W5-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC Acetonitrile</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2405-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a study of the complexation of mercury(ii) with dicysteinyl tetrapeptides by electrospray ionization mass spectrometry

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, by electrospray ionization orbitrap mass spectrometry. This strategy is based on previous successful characterization of mercury-dicysteinyl complexes involving tripeptides by utilizing mass spectrometry among other techniques. Mercury(II) chloride and a dicysteinyl tetrapeptide were incubated in a degassed buffered medium at varying stoichiometric ratios. The complexes formed were subsequently analyzed on an electrospray mass spectrometer consisting of a hybrid linear ion- and orbi- trap mass analyzer. The electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) spectra were acquired in the positive mode and the observed peaks were then analyzed for distinct mercury isotopic distribution patterns and associated monoisotopic peak. This work demonstrates that an accurate stoichiometry of mercury and peptide in the complexes formed under specified electrospray ionization conditions can be determined by using high resolution ESI MS based on distinct mercury isotopic distribution patterns.

<html>研究は、ESI質量分析により2テ ​​トラペプチド、CGGC及びCEEC（ 図1）のための可能な水銀-ペプチド複合体組成物を特徴づけるために実施しました。 1：0.5、1：1、及び1：2（水銀（II）：ペプチド）CGGCまたはCEECと水銀の複合体（II）は、三つの異なるモル比での水銀の混合物（II）とペプチド溶液を反応させて調べました。水銀の濃度（II）が7.5×10 -6 Mとに応じて変化させるペプチド濃度でした。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53536/53536fig1.jpg" /> 図1. Dicysteinylペプチド構造。dicysteinylテトラペプチドの化学構造、CGGCとCEEC。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53536/53536fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 1 &quot;&gt;：&quot; =キープtogether.withinページFO「ENT <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53536/53536fig2.jpg" /> 図2 水銀のESI MS（II）及びギ酸アンモニウム緩衝液、変化するのHg 2+を含有する pH7.5の中で7.5×10 -6 MのHg 2+を含有する溶液からCGGCエレクトロスプレーイオン化オービトラップ質量スペクトル：CGGC化学量論比：（ ）1：0.5の比、（B）1：1の比、及び（C）1：2の比率。挿入図は指示された水銀ペプチド複合体の水銀同位体パターンを示す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53536/53536fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53536/53536fig3.jpg" /> 図3 ESI水銀のMS（II）およびCEEC。からのエレクトロスプレーイオン化質量スペクトルオービトラップCEEC化学量論比：（A）1：0.5の比、（B）1：1の比、及び（C 1）ギ酸アンモニウム緩衝液、変化するのHg 2+を含有する pH7.5の中で7.5×10 -6 MのHg 2+を含有する溶液 ：2の比率。挿入図は指示された水銀ペプチド複合体の水銀同位体パターンを示す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53536/53536fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> エレクトロスプレーイオン化オービトラップ質量クロマトグラムは、（II）の化学量論比ペプチドに様々な水銀でCGGC（ 図2）とCEECと水銀（II）錯体（ 図3）のために収集した（1：0.5、1：1と1：2）。観察された水銀 - ペプチド複合体のタイプは複合体中の水銀イオンの数ならびにDEPROの数を決定するために使用される別個の水銀同位体ピーク（インセット）を示しますtonations。例えば、 図1bの挿入図は、水銀の7つの天然に存在する同位体に対応するペプチド-水銀付加物、中の水銀同位体の署名を示しています：196のHg（0.146パーセント）、198のHg（10.02パーセント）、199のHg（16.84パーセント）カッコ内はパーセント天然の存在量と、200のHg（23.13パーセント）、201のHg（13.22パーセント）、202のHg（29.80パーセント）、204のHg（6.85パーセント）、。 3：二つの主要な同位体200 Hgのと202のHgは2.3の個別の相対強度比を示します。したがって、この1水銀同位体クラスターの最も強烈な同位体ピークは、付加物（のm / z = 539）のためのモノアイソトピック質量を構成しています。これは、[（CGGC-2H +水銀）+ H] +付加物を形成するために2つのシステインチオールの脱プロトン化によって形成される二配位複合体と相関します。これは次のように分析が行われます。 [（CGGC-2H +水銀）+ H] +のためのm / z値はEQUです（ - 2 + 202 1 338）= 539にアル。 図1Aの挿入図は、[（2CGGC-4H + 2HG）+ H] +（ 図4）のためのChemCalプログラムを用いて計算した二水銀複合体に対応するペプチド水銀付加物、水銀同位体の署名を示しています。理論上のプロトン化されたモノアイソトピック質量を計算同位体クラスター内の第九の同位体ピークである、1077.061のm / z値に対応する。 図1（a）挿入図はまた、第九のピークである1077.1のm / z値に対応する同位体ピークを示し、観察された同位体クラスターインチしたがって、この同位体クラスタの元の付加物は、[（2CGGC-4H + 2HG）+ H] +のために割り当てることができます。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53536/53536fig4.jpg" /> 図4.理論的同位体パターン[（2CGGC-4H + 2HG）+ H] + </SUP&gt; [（2CGGC-4H + 2HG）+ H] +の理論的な同位体パターンChemCalプログラムを使用して計算されます。矢印は、モノアイソトピックピークを示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53536/53536fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53536/53536fig5.jpg" /> 図5.カチオン化付加物である。水銀-ペプチド複合体に関連するいくつかのカチオン化ナトリウム、カリウム付加物である。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53536/53536fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図5は CGGCによって形成された水銀-ペプチド複合体に関連するいくつかのカチオン化ナトリウムやカリウム付加物を示しています。ナトリウムイオン付加付加物が22質量単位大きいトンですハンカリウム付加物を38質量単位大きいであり、一方、プロトン化された水銀CGGC複合体に対応します。支配的なプロトン化CGGCダイマー（のm / z = 677）はまた、ナトリウム（のm / z = 699）とカリウムイオン（のm / z = 715）とカチオン種を形成しています。これはさらに、プロトン化又はカチオン化付加物のための2つの質量単位の減少をもたらしたであろうジスルフィドを形成するシステインのチオール基の酸化、なしCGGC二量体の形成を確認します。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53536/53536fig6.jpg" /> 図6は 、水銀-ペプチドイオン[（CEEC-4H + 2HG）+ H]に関連付けられた重複ピークを1と2の電荷状態を重複 + 1と2の電荷状態にある。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53536/53536fig6large.jpg" target="_blank">拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。</a> <img alT =「図7」SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 53536 / 53536fig7.jpg&quot; /&gt; [（CEEC-4H + 2HG）+ H] +。[（CEEC-4H + 2HG）+ H]の理論的な同位体パターンについては、図7の理論的同位体パターンは、+ ChemCalプログラムを使用して計算されます。矢印は、モノアイソトピックピークを示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53536/53536fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 1と2担当水銀CEEC付加物に関連するピークを重ね6に示す図 。それはのために計算されたように、2つの水銀錯体と一致している水銀-ペプチドイオン[（CEEC-4H + 2HG）+ H]で+ 1電荷および883これのm / z値に関連付けられている同位体ピークを示します[（CEEC-4H + 2HG）+ H] ChemCalプログラム（ 図7）を使用して +。理論上のプロトン化モノアイソトピック質量は883.032のm / z値に対応しています。 883.03のモノアイソトピックピークと上記観察[（CEEC-4H + 2HG）+ H] +付加物はさらに0.5質量単位を示す対応するピークを含む別の付加物と重なっています。オービトラップ質量分析器によって達成非常に高い解像度で、これらの重なり合うピークは+2の電荷を有する付加体に対応すると仮定することができます。したがって、以下のように、重複する複合体はイオン化されたモノアイソトピック質量を計算することができる。 図8の同位体ピーク間のm / z差は0.5であり、それらの間の質量差は1原子質量単位であることを示しています。したがって、充電状態が+2です。水銀 - ペプチド複合体の質量を計算するために、モノアイソトピックピークについてのm / zは荷電状態で乗算し、正に荷電した錯イオンを行った2つのプロトンの質量から減算されます。 2付加物のための計算： 同位体ピーク間のm / zの差は 0.5であります同位体ピーク間の質量差がある1 AMU（1中性子） 0.5 = 2により、Z = 1分周プロトン化されたモノアイソトピックピークのためのm / zが （883.53×2）である- 2 = 1765.06 プロトン化されたモノアイソトピックピーク、[（2CEEC-8H + 4HG）+ H] +、上記のm / z値は1765.056（ 図8）としてChemCalプログラムにより計算された理論値と一致しています。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/53536/53536fig8.jpg" /> 図8。 理論ChemCalプログラムを用いて計算した[（2CEEC-8H + 4HG）+ H] +。[（2CEEC-8H + 4HG）+ H]の理論的な同位体パターン+ための同位体パターン。矢印は、モノアイソトピックピークを示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53536/53536fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ESIオービトラップ質量分析計で水銀ペプチド複合体を分析することの利点は、上記のように、すべてのイオンの電荷が容易に割り当てることができるということです。基本的なアミノ末端を含むペプチドは、容易に正電荷を安定化させることができます。エレクトロスプレーイオン化や、オービトラップのような高分解能質量分析計を使用する場合は、より大きな+1電荷を有するペプチドイオンの電荷状態は、イオントラップ質量分析器、より低い解像度と比較してより容易に決定することができます。 図3A および図6）に関連付けられた重複ピークは、また、タンデムMSによって分析しました。これは、得られた信号は、上述のように期待される化合物に属し、水銀対ペプチド比のより高い濃度で形成されたアーティファクトをクラスタ化されていないことが示され、任意のMS-MSフラグメンテーションを示さありませんでした。

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A Study of the Complexation of MercuryII with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

The characterization of complexes formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptides by electrospray ionization orbitrap mass spectrometry is presented.

エレクトロスプレーイオン化質量分析法によるDicysteinylテトラペプチドと水銀（II）の錯体の研究

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

7.8K ビュー.  University of North Carolina at Greensboro. The characterization of complexes formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptides by electrospray ionization orbitrap mass spectrometry is presented.

ビデオ: A Study of the Complexation of MercuryII with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass spectrometer, it is necessary to characterize and understand the physical principles of the source. Most commercial ambient ionization sources utilize jets of nitrogen, helium, or atmospheric air to facilitate the ionization of the analyte. As a consequence, schlieren photography can be used to visualize the gas streams by exploiting the differences in refractive index between the streams and ambient air for visualization in real time. The basic setup requires a camera, mirror, flashlight, and razor blade. When properly configured, a real time image of the source is observed by watching its reflection. This allows for insight into the mechanism of action in the source, and pathways to its optimization can be elucidated. Light is shed on an otherwise invisible situation.

This paper presents a protocol for the visualization of gaseous streams of an ambient ionization source using schlieren photography and mass spectrometry.

シュリーレン写真の使用とアンビエント質量分析の可視化

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

化学

Fizzy Extraction of Volatile Organic Compounds Combined with Atmospheric Pressure Chemical Ionization Quadrupole Mass Spectrometry

Chemical analysis of volatile and semivolatile compounds dissolved in liquid samples can be challenging. The dissolved components need to be brought to the gas phase, and efficiently transferred to a detection system. Fizzy extraction takes advantage of the effervescence phenomenon. First, a carrier gas (here, carbon dioxide) is dissolved in the sample by applying overpressure and stirring the sample. Second, the sample chamber is decompressed abruptly. Decompression leads to the formation of numerous carrier gas bubbles in the sample liquid. These bubbles assist the release of the dissolved analyte species from the liquid to the gas phase. The released analytes are immediately transferred to the atmospheric pressure chemical ionization interface of a triple quadrupole mass spectrometer. The ionizable analyte species give rise to mass spectrometric signals in the time domain. Because the release of the analyte species occurs over short periods of time (a few seconds), the temporal signals have high amplitudes and high signal-to-noise ratios. The amplitudes and areas of the temporal peaks can then be correlated with concentrations of the analytes in the liquid samples subjected to fizzy extraction, which enables quantitative analysis. The advantages of fizzy extraction include: simplicity, speed, and limited use of chemicals (solvents).

Fizzy extraction is a new laboratory technique for analysis of volatile and semivolatile compounds. A carrier gas is dissolved in the liquid sample by applying overpressure and stirring the sample. The sample chamber is then decompressed. The analyte species are liberated to the gas phase due to effervescence.

大気圧化学イオン化四重極質量分析法と組み合わせた揮発性有機化合物の大気抽出

Chemical analysis of volatile and semivolatile compounds dissolved in liquid samples can be challenging. The dissolved components need to be brought to ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

高分解能質量分析に結合された二次 Nanoelectrospray イオン化を用いたリアルタイム呼吸解析

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

合成とオリゴ ペプチドの質量分析

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group analysis as matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). This tutorial demonstrates methods for optimization of the sample preparation, spectral acquisition, and data analysis of synthetic polymers using MALDI-TOF MS. Critical parameters during sample preparation include the selection of the matrix, identification of an appropriate cationization salt, and tuning the relative proportions of the matrix, cation, and analyte. The acquisition parameters, such as mode (linear or reflector), polarization (positive or negative), acceleration voltage, and delay time, are also important. Given some knowledge of the chemistry involved to synthesize the polymer and optimizing both the data acquisition parameters and the sample preparation conditions, spectra should be obtained with sufficient resolution and mass accuracy to enable the unambiguous determination of the end groups of most homopolymers (masses below 10,000) in addition to the repeat unit mass and the overall molecular weight distribution. Though demonstrated on a limited set of polymers, these general techniques are applicable to a much wider range of synthetic polymers for determining mass distributions, though end group determination is only possible for homopolymers with narrow dispersity.

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

A protocol for the matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) characterization of synthetic polymers is described including the optimization of sample preparation, spectral acquisition, and data analysis.

マトリクスによる合成高分子のキャラクタリゼーション支援レーザー脱離イオン化時間 (MALDI Tof) 質量分析装置

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

An Efficient Sample Preparation Method to Enhance Carbohydrate Ion Signals in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is the method of choice in carbohydrate analysis, poor ion signal and data reproducibility of carbohydrate samples continue to be severe problems. For quantitative analysis of carbohydrates, an effective analytical protocol providing superior data quality is necessary. This video demonstrates sample preparation protocols to improve signal intensity and minimize data variation of carbohydrates in MALDI-MS. After drying and crystallization of sample droplets, the crystal morphology is reformed by methanol before mass spectrometric analysis. The enhancement in carbohydrate signal is examined with MALDI imaging mass spectrometry (IMS). Experimental results show that crystal reformation adjusts crystalline structures and redistributes carbohydrate analytes. In comparison with the dried droplet preparation method in conventional MALDI-MS, reforming carbohydrate crystal morphologies with methanol shows significantly better signal intensity, ion image distribution, and data stability. Since the protocols demonstrated herein do not involve changes in sample composition, they are generally applicable to various carbohydrates and matrixes.

A protocol for enhancing carbohydrate ion signals in MALDI mass spectrometry by reforming crystalline structures during sample preparation processes is demonstrated.

マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法における炭水化物イオン信号を強化する効率的なサンプル調製法

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

クラスターによる脱着/イオン化質量分析による、表面上の複雑分子とその反応の解析

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the past decade. Interest in the bio-nano interface arises from the fact that the biomolecular corona confers a biological identity to NMs and thus causes the body to identify them as &#8220;self&#8221;. For example, previous studies have demonstrated that the proteins in the corona are capable of interacting with membrane receptors to influence cellular uptake and established that the corona is responsible for cellular trafficking of NMs and their eventual toxicity. To date, most research has focused upon the protein corona and overlooked the possible impacts of the metabolites included in the corona or synergistic effects between components in the complete biomolecular corona. As such, this work demonstrates methodologies to characterize both the protein and metabolite components of the biomolecular corona using bottom-up proteomics and metabolomics approaches in parallel. This includes an on-particle digest of the protein corona with a surfactant used to increase protein recovery, and a passive characterization of the metabolite corona by analyzing metabolite matrices before and after NM exposures. This work introduces capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry (CESI-MS) as a new technique for NM corona characterization. The protocols outlined here demonstrate how CESI-MS can be used for the reliable characterization of both the protein and metabolite corona acquired by NMs. The move to CESI-MS greatly decreases the volume of sample required (compared to traditional liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (LC-MS) approaches) with multiple injections possible from as little as 5 &#181;L of sample, making it ideal for volume limited samples. Furthermore, the environmental consequences of analysis are reduced with respect to LC-MS due to the low flow rates (&#60;20 nL/min) in CESI-MS, and the use of aqueous electrolytes which eliminates the need for organic solvents.

Here we present a protocol to characterize the complete biomolecular corona, proteins, and metabolites, acquired by nanomaterials from biofluids using a capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry approach.

ナノ材料で獲得したタンパク質と代謝物コロナの特性解析のためのキャピラリー電気泳動質量分析法

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool for this purpose, especially for protein systems that are difficult to study by traditional methods. To study a protein&#39;s structure by MS, specific chemical reactions are performed in solution that encode a protein&#39;s structural information into its mass. One particularly effective approach is to use reagents that covalently modify solvent accessible amino acid side chains. These reactions lead to mass increases that can be localized with residue-level resolution when combined with proteolytic digestion and tandem mass spectrometry. Here, we describe the protocols associated with use of diethylpyrocarbonate (DEPC) as a covalent labeling reagent together with MS detection. DEPC is a highly electrophilic molecule capable of labeling up to 30% of the residues in the average protein, thereby providing excellent structural resolution. DEPC has been successfully used together with MS to obtain structural information for small single-domain proteins, such as &#946;2-microglobulin, to large multi-domain proteins, such as monoclonal antibodies.

The experimental procedures for performing diethylpyrocarbonate-based covalent labeling with mass spectrometric detection are described. Diethylpyrocarbonate is simply mixed with the protein or protein complex of interest, leading to the modification of solvent accessible amino acid residues. The modified residues can be identified after proteolytic digestion and liquid chromatography/mass spectrometry analysis.

質量分析によるタンパク質高次構造の研究のためのジエチルピロカーボネートとの共有結合標識

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end approaches to isolate, enrich, and process proteins ahead of MS are critical for successful proteome characterization. Low, inconsistent protein recovery and residual impurities such as surfactants are detrimental to MS analysis. Protein precipitation is often considered unreliable, time-consuming, and technically challenging to perform compared to other sample preparation strategies. These concerns are overcome by employing optimal protein precipitation protocols. For acetone precipitation, the combination of specific salts, temperature control, solvent composition, and precipitation time is critical, while the efficiency of chloroform/methanol/water precipitation depends on proper pipetting and vial manipulation. Alternatively, these precipitation protocols are streamlined and semi-automated within a disposable spin cartridge. The expected outcomes of solvent-based protein precipitation in the conventional format and using a disposable, two-stage filtration and extraction cartridge are illustrated in this work. This includes the detailed characterization of proteomic mixtures by bottom-up LC-MS/MS analysis. The superior performance of SDS-based workflows is also demonstrated relative to non-contaminated protein.

The present protocol describes solvent-based protein precipitation under controlled conditions for robust and rapid recovery and purification of proteome samples prior to mass spectrometry.

質量分析に先立つ堅牢なプロテオーム精製のための有機溶媒ベースのタンパク質沈殿

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...