This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

注意：（ すなわち 、メタノールのためのMSDS）は、使用する前に、すべての材料および試薬のための材料安全データシート（MSDS）をご参照ください。溶剤および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を溶離液を取り扱うときは、すべての適切な安全対策を使用することを確認してください。 HPLC、分析天びんと検出器計測器の技術的管理の適切な使用を確保し、個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣、完全長ズボン、およびクローズドつま先の靴）を使用することを保証します。 注：このプロトコルは、目的の化学化合物の性質に固有の異なる試薬と反応流ポストカラム誘導体化の3つの方法（RF-PCD）技術、それぞれについて説明します。 ROSの解析については、「DPPH•を使用してROSの1検出」に進み、第一級アミンの分析については、「カミンを使用して、第一級アミンの2検出」、およびフェノール化合物の分析のために」セクションに移動を参照してください3 。フェノール類の検出4-aminoantipyreneとフェリシアン化カリウム」を使用して。全体に超純水（ 例えば 、ミリQ水）を使用します。 注：RF列の接続が主な違いは、RF列の端金具の数であると従来のHPLCカラムとほぼ同じ方法で達成されます。 HPLCシステムに標準的なHPLCカラムを接続するために使用される継手は、HPLCシステムへRF列を接続するために使用されることが可能です。 DPPHを用いたROSの1検出• <ol><li> HPLC機器の設定 <ol><li>移動相としてのラインB上のラインA上の水100％と100％のメタノールでHPLC機器を準備します。メーカーの要件に従ってポンプをパージします。 </li><li> 図4（a）に示すように 、HPLC楽器の部品や追加の誘導体化ポンプを設定します。 </li><li> 520ナノメートルの波長で分析するために、UV-Visの検出器を設定します。 </li></ol></li><li> の設定RFコラム<ol><li> HPLC機器へのRFカラムの入口を接続します。 </li><li> RF列の中央のポートをコンセントに0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの長さを接続します。 </li><li> 0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの長さを使用して、UV-Visの検出器に流出ペリフェラルポートに接続します。 </li><li> RFのカラムの出口上のペリフェラルポートにDPPH•ポンプラインを接続します。 </li><li>列のストッパーを用いたRFカラムの出口に未使用のペリフェラルポートをブロックします。 </li><li> 100％メタノール- 1分ml -1の100％の線BにまでHPLCポンプの流量をもたらします。 </li><li>内径4.6mm×100mmの長列の10分間、100％メタノールを移動相でカラムを平衡化します。この時間は、ユーザが使用することができる他の列の寸法に応じてスケーリングされるべきです。 </li></ol></li><li> DPPH•試薬の調製 <ol><li>メタノールにDPPH•の0.1mg / mlの溶液を調製します。 </l私&gt; <li> 10分間DPPH•試薬を含有するフラスコを超音波処理します。 </li><li>光への曝露を防止するために箔でフラスコをカバーしています。 </li><li>メーカーの要件に従って準備されたDPPH•試薬とDPPH•ポンプをパージします。 </li></ol></li><li> RFのカラム出口のチューニング <ol><li>正確に2清潔で乾燥した船の重量を量ります。周辺機器など、中央およびその他のような1つの容器にラベルを付けます。 </li><li> 1.0分間、中央ラベル付き容器に中央ポートから出る廃液を収集します。 </li><li>中央ポート容器を再計量し、次のように中央のポートからの流れの重量を計算します。 中央港の重量（g）=中央ポート船（グラム）の最終重量 - 中央ポート容器の初期重量（g） </li><li>繰り返しは、UV-VisのRFカラムの周辺ポートに接続し、ペリフェラルポート容器としての重みを計算されて出た廃液用の1.4.2と1.4.3ステップ次のとおりです。 ペリフェラルポートの重量（g）=ペリフェラルポート容器（G）の最終重量 - ペリフェラルポート容器の初期重量（g） </li><li>次のように中央と周辺機器ポートからの流れの割合を計算します。 中央ポートの％中央ポート=重量（g）/（中央ポー​​トの重量（g）+ペリフェラルポート（G）の重量）×100 ペリフェラルポート％のペリフェラルポート=重量（g）/（中央ポー​​トの重量（g）+ペリフェラルポート（G）の重量）×100 </li><li>中央流と周辺の流れの間のセグメンテーション比が30:70（：末梢中央）であることを確認してください。中央流が30％以上である場合には、中央のポートの出口0.13ミリメートルIDチューブの長さを追加することによって、出る流量を減少させます。中央流が30％未満である場合には、中央ポートから0.13ミリメートルのチューブの長さを減少させます。 </li><li> 1.4.6への手順を繰り返し1.4.1 30:70（中央：周辺）のセグメンテーション比がまで達成されています。 </li><li> Dの流量を設定します0.5ミリリットル分-1へのPPH•試薬ポンプ。 注：DPPH•試薬で設定RF列は現在、分析の準備ができています。サンプルは、現在注入されてもよいです。 </li></ol></li><li> ポスト実行停止条件 <ol><li>すべてのサンプルは、実行が終了したことを示す、注入された後、誘導体化試薬ポンプ流れを止めます。 </li><li>ペリフェラルポートからDPPH•試薬ポンプ行を削除し、ポートをストッパー。 </li><li>それは、移動相は1分ml -1の10分間でカラムを通過させることによって格納すべき移動相でカラムを平衡化します。 </li><li> HPLC機器上で、移動相ポンプの流れを停止します。 </li><li>メタノールでDPPH•試薬を交換して、追加のポンプをパージします。 注：HPLCシステムは現在、シャットダウンすることができます。 </li></ol></li></ol> Fluorescを使用した第一級アミンの2検出アミン<ol><li> 移動相の調製 <ol><li>ボリュームへの希釈前に5 M水酸化アンモニウムで9.0に溶液のpHを調整し、10mMの酢酸アンモニウム溶液の1リットルを調製します。 </li><li> 95:05（：ACN緩衝液）の予混合移動相を達成するために酢酸アンモニウム緩衝液にアセトニトリル52.6ミリリットル（ACN）を加えます。 </li></ol></li><li> HPLC機器の設定 <ol><li>移動相としてA線にプレミックス準備緩衝液を用いてHPLC機器を準備します。メーカーの要件に従ってポンプをパージします。 </li><li> 図4（a）に示すように 、HPLC楽器の部品や追加の誘導体化ポンプを設定します。 </li><li>誘導体化ポンプにパルスダンパーコイルを取り付けます。 </li><li>セットアップ蛍光検出器（FLD）を475 nmで390 nmおよび発光波長の励起波長を有します。 </li></ol></li><li> RF列の設定 <ol><li>目を接続しますHPLC装置にRF列のE入口。 </li><li> RF列の中央のポートをコンセントに0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの長さを接続します。 </li><li> 0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの長さを使用して、FLD検出器へのRFカラムの出口周辺ポートを接続します。 </li><li> RFのカラムの出口上のペリフェラルポートに誘導体化ポンプラインを接続します。 </li><li>列のストッパーを用いたRFカラムの出口に未使用のペリフェラルポートをブロックします。 </li><li> 5％ACNと予備混合の10mM酢酸アンモニウム緩衝液pH 9、 - 1分ml -1の100％の線AににHPLCポンプの流量をもたらします。 </li><li>内径4.6mm×100mmの長列の10分間100％ラインA、移動相でカラムを平衡化します。この時間は、ユーザが使用することができる他の列の寸法に応じてスケーリングすることができます。 </li></ol></li><li> カミン試薬の調製 <ol><li> 0.1ミリグラムミリリットル-1カミン試薬の100ミリリットルを加えます。 </li> &lt;1分間のLI&gt;超音波処理します。 </li><li>光への曝露を防止するためにホイルで覆います。 </li><li>メーカーの要件に従って準備されたフルオ試薬と試薬ポンプをパージします。 </li></ol></li><li> RFのカラム出口のチューニング <ol><li>正確に2清潔で乾燥した船の重量を量ります。周辺機器など、中央およびその他のような1つの容器にラベルを付けます。 </li><li> 1.0分間、中央ラベル付き容器に中央ポートから出る廃液を収集します。 </li><li>中央の容器を再計量し、ステップ1.4.3で以下のように中央のポートからの流れの重量を計算します。 </li><li>繰り返しは、RF列のペリフェラルポートに取り付けられ、ステップ1.4.4で以下のように周辺の重みを計算されたFLDを出る流出物のために2.5.3に2.5.2を繰り返します。 </li><li>ステップ1.4.5で以下のように、中央と周辺機器ポートからの流れの割合を計算します。 </li><li>中央流と周辺の間のセグメント化率を確認流れは43:57（：末梢中央）です。中央流が43％以上である場合には、中央のポートの出口0.13ミリメートルIDチューブの長さを追加することによって、出る流量を減少させます。中央流が43％未満である場合には、中央のポートから0.13ミリメートルのチューブの長さを減少させます。 </li><li> 2.5.6への手順を繰り返し2.5.1 43:57（中央：周辺）のセグメンテーション比がまで達成されています。 </li><li> 0.7 mlの分、移動相ポンプの流量を設定-1。 </li><li> 0.1ミリリットル分で流れるように誘導体化ポンプを設定-1。 注：フルオレサミン試薬で設定RF列は現在、分析の準備ができています。サンプルは、現在注入されてもよいです。 </li></ol></li><li> ポスト実行停止条件 <ol><li>すべてのサンプルは、実行が終了したことを示す、注入された後、誘導体化ポンプを停止します。 </li><li>ペリフェラルポートとストッパから誘導体化ポンプ行を削除します。 </li><li>移動相中でカラムを平衡化しますそれは、移動相は1分ml -1の10分間でカラムを通過させることによって格納されます。 </li><li>移動相ポンプの流れを停止します。 </li><li>アセトニトリルでフルオレサミン試薬を交換し、誘導体化ポンプをパージします。 注：HPLCシステムは現在、シャットダウンすることができます。 </li></ol></li></ol> 4-Aminoantipyreneとフェリシアン化カリウムを用いたフェノール類の3検出<ol><li> 移動相の調製 <ol><li>ボリュームへの希釈前に5 M水酸化アンモニウムで9.0に溶液のpHを調整し、100 mMの酢酸アンモニウム溶液の1リットルを調製します。 </li><li> （：メタノールバッファー）5：95の予混合移動相を達成するために酢酸アンモニウム緩衝液にメタノール52.6ミリリットルを追加します。 </li></ol></li><li> HPLC機器の設定 <ol><li>移動相としてA線にプレミックス準備緩衝液を用いてHPLC機器を準備します。メーカーごとのように、ポンプをパージ」; sの要件。 </li><li> HPLC楽器のコンポーネントと、図4（b）に示すように、2つのさらなる試薬ポンプを設定します。 </li><li>試薬ポンプのそれぞれにパルスダンパーコイルを取り付けます。 </li><li> 500nmの波長で分析するために、UV-Visの検出器を設定します。 </li></ol></li><li> RF列の設定 <ol><li> HPLC機器へのRFカラムの入口を接続します。 </li><li> RF列の中央のポートをコンセントに0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの長さを接続します。 </li><li> 0.13ミリメートルのIDチューブの15cmの長さを使用して、UV-Visの検出器へのRFカラムの出口周辺ポートを接続します。 </li><li>各試薬（ すなわち 、4-aminoantipyreneとフェリシアン化カリウム）のRFカラムの出口上のペリフェラルポートへのポンプラインを接続します。 </li><li> 1 mlの分をHPLCポンプの流量をもたらす-1 100％の線Aに-の5％メタノールで予め混合100mMの酢酸アンモニウム緩衝液pH 9、。 </li><li>列Wの平衡内径4.6mm×100mmの長カラムの10分間の100％A線移動相i番目。この時間は、ユーザが使用することができる他の列の寸法に応じてスケーリングすることができます。 </li></ol></li><li> 4 aminoantipyrene試薬の調製 <ol><li>ステップ3.1.1に従うことによって、9のpHを有する酢酸アンモニウム緩衝液を準備します。 </li><li> 150mgの4- aminoantipyreneを秤量し、準備された酢酸アンモニウム緩衝液（pH 9）100mlに溶解します。 </li><li> 1分間超音波処理します。 </li><li>光への曝露を防止するためにホイルで覆います。 </li><li>メーカーの要件に従って準備された4-aminoantipyrene試薬と第1試薬ポンプをパージします。 </li></ol></li><li> フェリシアン化カリウム試薬の調製 <ol><li>フェリシアン化カリウム150mgのを秤量し、ステップ3.1.1に従って調製酢酸アンモニウム緩衝液（pH 9）100mlに溶解します。 </li><li> 1分間超音波処理します。 </li><li>光への曝露を防止することがホイルでカバーしています。 </li><li> PURGメーカーの要件に従って準備されたフェリシアン化カリウム試薬とE第2試薬ポンプ。 </li></ol></li><li> RF列のチューニング <ol><li>正確に2清潔で乾燥した船の重量を量ります。周辺機器など、中央およびその他のような1つの容器にラベルを付けます。 </li><li> 1.0分間、中央ラベル付き容器に中央ポートから出る廃液を収集します。 </li><li>中央の容器を再計量し、ステップ1.4.3で以下のように中央のポートからの流れの重量を計算します。 </li><li>繰り返しは、RF列のペリフェラルポートに取り付けられ、ステップ1.4.4で以下のように周辺の重みを計算されたUV-Visのを出る流出物のために3.6.3に3.6.2を繰り返します。 </li><li>ステップ1.4.5で以下のように、中央と周辺機器ポートからの流れの割合を計算します。 </li><li>中央流と周辺の流れの間のセグメンテーション比が50:50（：末梢中央）であることを確認してください。中央流が50％以上である場合には、減少アウトレット中央のポートに0.13ミリメートルのIDチューブの長さを追加することで、出て行く流れの量。中央流が50％未満である場合には、中央のポートから0.13ミリメートルのチューブの長さを減少させます。 </li><li> 3.6.6への手順を繰り返し3.6.1 50:50（中央：周辺）のセグメンテーション比がまで達成されています。 </li><li> 0.5ミリリットル分に4-aminoantipyreneポンプの流量を設定して-1。 </li><li> 0.25ミリリットル分にフェリシアン化カリウムポンプの流量を設定して-1。 注：二成分試薬を用いて設定したRF列は現在、分析の準備ができています。サンプルは、現在注入されてもよいです。 </li></ol></li><li> ポスト実行停止条件 <ol><li>一旦、全てのサンプルが実行が終了したことを示す、実行が終了した注入された、試薬ポンプの両方を停止します。 </li><li>周辺機器ポートから試薬ポンプ行を削除し、0.13ミリメートルチューブの15cmのピースに置き換えます。 </li><li> WHIで移動相でカラムを平衡化しますCHは移動相を1ml分でカラムに通過さ-1 10分間可能にすることによって格納されます。 </li><li> HPLC機器上で、移動相ポンプの流れを停止します。 </li><li>メタノールで試薬ポンプ上の試薬の両方を交換して、製造業者の要件ごとのような追加のポンプをパージします。 注：HPLCシステムは現在、シャットダウンすることができます。 </li></ol></li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phenols+in+Water+and+Wastewater+by+Post-column+Reaction+Detection+High-performance+Liquid+Chromatography.">Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+flow+chromatography+for+rapid+post+column+derivatisations:+The+analysis+of+antioxidants+in+natural+products.">Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products.</a> J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

RF-PCDは、バンドの広がりの影響を最小化し、分離性能を向上させる、反応コイルを使用することなくHPLC廃液ポストカラムで誘導体化試薬の効率的な混合を可能にします。 RF-PCD法はまた、検出方法に対する信号応答の改善を示しています。 Camenzuli ら 28は、エスプレッソコーヒー、試料中のROSの検出のためのDPPH•との反応流列の使用を初めて報告しました。彼らの研究は、種々のDPPH•試薬流量のDPPH•濃度の範囲を試験し、最高のパフォーマンスを達成するRF状態の分析および最適化を含みました。これは、0.1ミリグラムml -1の0.5ミリリットル分のDPPH•試薬の流量でのDPPH•濃度は-1 RF-PCDの下で改善された分離性能（ すなわち 、効率性と感度）のための最適であると結論しましたDPPH•誘導体化の従来のPCD法に比べて条件。 図5は、エスプレッソコーヒーサンプル中の抗酸化物質のDPPH•アッセイを利用して2つのクロマトグラムを示しています。特に興味深いの約5分の保持時間を有する高強度のピークがあります。従来のDPPH•誘導体化方法の典型である500μlの反応ループを使用する場合、単一のブロードなピークが観察できることが分かります。 RF-PCD法は、反応ループを必要とせずに使用した場合しかし、それは、単一のピークが500μlのループを使用して、実際には二つのピークで観察されていることが明らかとなります。 RF-PCDの設定を使用するときに更に、追加の詳細は、5.5分後に見ることができます。したがって、DPPH•、RF-PCDの技術を使用して、試料中のROSの分析のためのDPPH•を使用してROS分析する従来の方法よりも優れていることが判明しました。 RF-PCDとフルオレサミン試薬は、一次アミノ酸の分析のために利用され、フルオレサミン20とPCDの従来の形態と比較しました。廃液とフルオレサミン間の誘導体化は、紫外線を介してRFエンドフィッティングの外側領域に着手し、検出されたRFカラムエンドフィッティング多重検出のためのプラットフォームを提供し、またあるので、誘導体化されていない中央流は、UV-Visのを経由して監視しましたヴィス。 4個のアミノ酸を含有する試験規格一連の多重RF-PCDの条件で分析した。 図6は、PCD（ 図6A）とRF-PCD誘導体化を（検出（ 図6B）および誘導体化されていない（ 図の従来の方法のためのクロマトグラフィープロフィールとを比較します6C））のアミノ酸の一連の図7は、従来の PCDとRF-PCDを経て得られた二つのアミノ酸シグナルのオーバーレイである図 。ことが分かるTによるより効率的な観測分離彼は、反応ループの除去は全てのカラム流出物を誘導体化したという事実にもかかわらず、より高い信号応答をもたらしました。さらに、より効率的な誘導体化試薬混合方式はさらに、信号対雑音比を増加させる、より低いベースラインノイズをもたらしました。この効果は、表1において、従来のPCD法に比べてRF-PCD法について算出検出および定量の下限内で支持されている。この傾向はまた、DPPH•に抗酸化応答がために大きい、図5に見ることができます従来のPCD法に比べてRF-PCD法。有意なピークの低下は、従来のPCDの設定は、この方法の低い信号応答をもたらすに使用したクロマトグラムで観察することができます。 RF-PCD（両方誘導体化および非誘導体化ストリーム）と、従来のPCDによって分析すると、 図8は、トリプトファンのピークプロファイルを比較します。ピークプロファイルは、時間に対してプロットされている場合、ピーク幅は、全て（ 図8A）広く類似していると思われます。ピークプロファイルは、ピークボリューム（ 図8B）に対してプロットされている場合、従来のPCDと比較して、RF-PCDで見つかった改善点は明白です。ピーク体積に対してプロットしたとき、RF-PCDピークが誘導体化されていないピークに比べて劣化の少量を示している、分解は、しかしながら、従来のPCD法で観察されたものと比較して最小であることは明らかです。従来のPCDと比較して、RF-PCDの分離効率の向上は、従来のPCDとRF-PCDの両方により誘導体化した後、グリシンおよびロイシンのピーク形状を比較して、図7に例示されています。 RF-PCDモードで信号が2つのピークの間ずっと長い期間のベースラインであるとき、従来のPCDモードグリシンおよびロイシンピークはほとんどベースライン分離されていることがわかります。 アン従来のPCD法に比べてRF-PCDの追加の利点は、多重化された検出を可能にするRF列の中央のポートから誘導体化されていないの流出を監視する機能です。 RFエンドフィッティング内のフリットの設計は、半径方向中央領域における流れはエンドフィッティングの周辺領域の流れと混合することはできませんので、これは可能であり、したがっての外側領域から誘導体化されたストリームのモニタリングを可能にしますフィッティングだけでなく、中央のポートからの誘導体化されていないストリームの監視。 （280nmで）非誘導体化する場合、この機能は、フルオレサミン20によって誘導体化後の悪い信号応答を有することが知られている表1にトリプトファンについて得られた結果によって強調されるが、他のアミノ酸と異なり、それは、UV検出器の応答を示します。検出および定量の限界は比較的高かった両方の誘導体化システムでは、検出および定量のが限界はtについてはるかに低かったです彼はストリームを非誘導体化。両方の誘導体化および非誘導体化流出物を監視する能力を使用して検出パラメータは、各アミノ酸についての性能の最大レベルを与えるように最適化することができるストリーム。 RFエンドフィッティングのマルチポート設計は、デュアル誘導体化試薬の分析を可能にします。セリムら 23は、4 aminoantipyrene及びフェリシアン化カリウムを用いて、PCDの従来技術に比べてフェノール化合物の分析のためのRF-PCDの条件を使用して2つの試薬 ​​（4-aminoantipyrene及びフェリシアン化カリウム）の性能を調べました。 PCD技術のこのタイプは、2つのポンプを必要とし、DPPH•のための1つのポンプと反応ループとは対照的に、反応は、各誘導体化試薬のためにループします。種々のフェノール及びアルキルベンゼン化合物は、従来のRF PCD条件下で分析しました。事実は、未検出​​に興味深いことに、従来の方法で検出されなかった非フェノール化合物でしたデルRF-PCD条件。 図9は、UV-Visのクロマトグラフィーの応答と、標準的なテストミックスにRF-PCD比色応答を示しています。 図10で観察されるようにRF-PCDは分離性能を損なうことなく、計装の面で単純化PCD技術を提供する。RF-PCDによっても誘導体化せずに分析すると、 図10 は、p -cresolのピークプロファイルを比較します。 RF-PCDのクロマトグラムのピーク幅は、誘導体化されていないクロマトグラムと非常に類似していることがわかります。 2つのクロマトグラムの主な違いは、RF-PCDのクロマトグラムがベースで少し広くなっていることです。これは、RF-PCD法に少なく、ピーク分散体に存在することを示しています。同様の反応は、それだけではなく、その誘導体化されていないピークに比べてRF-PCDにより誘導体同様のピーク幅を有するp個の -cresolピークであることを示している。図9で観察したが、すべてのフェノール類とアルキル誘導体化方式に応答したlbenzenesは、これと同じ傾向を示しました。 2誘導体化試薬を用いてRF-PCDは、従来の非誘導体化法に類似した分離性能が得られ、が、RF-PCDは、非誘導体化された条件下では検出されなかった一つは、フェノール化合物の選択的検出のために許可されました。 RF-PCDは、従来のHPLC-PCD法の開発は、このような移動相組成物として一般的なHPLC法で使用可能なチューニング・ツールの全て及び流量であるため、注入量及び分析波長はRF-PCD法に適用可能です。さらに、このようなPCD試薬流量比ならびにPCD試薬組成物を移動相として、従来のHPLC-PCD法で使用可能なチューニング・ツールは、RF-PCD法に適用可能です。従来のPCD法では利用できない利用可能な追加のチューニングツールRF-PCDを使用して、中枢および末梢からの流れの比であり、列のポート。フローは、（中央のポートからの流れが検出されない場合、またはポストカラム）の長さおよび/または後検出器の内径を制御することにより、ライン毎に相対的な背圧を変えることによって制御されているチューブ。周辺の流れの中心の最適な比率は、中央ポートが検出されているか否か、問題の反応、ならびに他の要因に依存します。末梢および40％中央の60％の流量比は、多くの場合、良好な出発点です。 チューニングパラメータと同様に、RF-PCDのカラムを使用して生じ得る問題の多くは、従来のPCD法と共通です。クロマトグラファーが実行してRF-PCD分析する場合に注意する必要がある一つの特定のパラメータは、特に、その試薬ポンプ（複数可）の、システム内の流量と圧力の安定性です。システム内の流れが安定していない場合は、ベースラインの不安定性は、したがって減少引き起こし得ます信号対雑音比にし、定量および検出のその後限界。 RF-PCDクロマトグラフィーは、現代のHPLCカラムおよびシステムPCD反応を適応の困難を克服するために開発されました。従来のPCD法と比較して、RF-PCDの主な利点は、それがRFカラムのエンドフィッティング内のフリットの内部で行われているにより効率的な混合であり、この混合はわずかに高い背圧です。これは、最小化または多くの従来のPCDの方法において使用される大容量の反応ループも排除することを可能にします。ポストカラムデッドボリュームのこの最小化により、より高いクロマトグラフ分解能で、より効率的な分離を行うことができます。 RF-PCDモードは、従来のPCD法と比較してノイズの分離効率、ピーク形状および信号の改善をもたらしました。しかし、信号の改善が検出器に依存していることに留意することが重要です。例えば、検出器のための依存そのサンプル量は、従来の方法と比較してRF-PCD条件下での信号応答の増加を示さないかもしれません。従来の方法の下で、カラムサンプルの100％が検出されるので、RF-PCD条件下でカラムにサンプルのみを一定の割合を分割比に応じて検出された場合、これは、そうです。しかし、RF-PCDの反応は（限り、両方の試薬が同時に添加されているように）最小の再最適化PCD反応の任意の一つまたは二つの試薬に適合させることができるようになることが予想されるとの利点は、3つすべてについて観察されたものこれまでに試験された反応は、他のすべてのPCDの反応に変換します。

ポストカラム誘導体化（PCD）と結合された高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、分析研究室で多くの問題を解決するのに有用である強力なツールです。これは、利用可能な検出器1,2のスイートとさもなければ検出不能である化合物を検出し、選択的検出および定量3-5の下限を許可または標的分析物のシグナルを増加させることができることを避けるために、標的分析物を誘導体化マトリックス効果6。一般的に使用されるPCD反応は、9,10またはフルオレサミン11,12ニンヒドリン、2,2-ジフェニルと反応性酸素種（ROS）の誘導体をオルト-フタルアルデヒド7-9を有するアミノ酸などのアミンとの反応を含みます1- picrylhydrazilラジカル（DPPH•）13,14、または2,2&#39;-アジノ-ビス（3-ethylbenzothiazoline -6-スルホン酸（ABTS）15,16、および硫黄cを誘導体化するためにヨウ化アジド試薬の使用ontaining化合物17,18。 HPLCシステム6を有するPCD反応の使用には多くの欠点は、しかし、存在します。主にこれらの間混合し、8を発生するための反応時間を可能にする誘導体化試薬（単数または複数）の添加の時点と検出器との間の反応コイルの使用です。これらの反応は、多くの場合、HPLCシステム19の残りの部分の容積に比べて有意である500μlあるいはそれ以上の容積を有するループ。これらの大量の反応の使用は、反応ループの存在なしで観察されるものと比較して増加したピークの広がりをもたらすループ。これは、定量および検出の高い限界が短く、幅の広いピークになると負のクロマトグラフィー分解能をもたらす。1および図 2は 、様々なポストカラム反応ループのボリュームの追加に起因するピーク形状の悪化を強調表示します。この分析94％メタノールおよび6％のMilli-Q水の移動相組成を用いて行きました。移動相の流速は1ml /分であり、注入量は20μlであったと分析波長は265 nmでした。千μlに20μlのからデッドボリュームを変化させるコイルはPCD法における反応ループデッドボリュームの影響をシミュレートするために、カラムと検出器との間に挿入しました。これらのループは、0.5 mmの内径のステンレス鋼管から調製しました。実験は、コントローラ（SCL-10AVP）からなるHPLCシステム上で実施した、低圧グラジエントバルブ（FCL-10ALVP）、ポンプ（LC-20AD）、インジェクター（SIL-10ADVP）、およびPDA検出器（ SPD-M10ADVP）。移動相は、従来のHPLCシステムに導入する脱気装置を通してポンプ輸送しました。分離250ミリメートル×内径4.6 mm 5ミクロンカラムを用いて行きました。実験条件は、最近、文献に発表されているPCD反応の典型であるように選択しました。 ザ最も簡単なのは、最も一般的なポストカラム反応器の設定は、効果的に液体を流すことができ、反応が起こることができ、それを通して細長いチューブである非セグメント管状反応器と呼ばれます。このシステムピークに広がりがないだけで、システムに追加デッドボリュームだけでなく、飯島ら 8によって強調されているように、管の内径に依存しています。また、コイル形状が観察されたブランドの広がりで役割を果たしています。スチュワート20は、反応器の巻取りがデッドボリュームを最小化することができることを意味し、より良好な混合が得られ、二次流れのプロファイルを変更することを述べました。 21コイルニット開管を使用するときにピークの広がりが重要ではないことを述べました。ピークの広がりが大きすぎる場合は、反応器の他のタイプも20,22と考えることができます。これらは床反応器またはセグメント流反応器を含むことができます。これらの反応器は、そうでなければrequirだろう遅い反応のために特に有用です電子大きな反応がループします。非セグメント化された管状反応器は、PCDのアプリケーションで使用される原子炉の中で最も一般的なタイプであるため、この記事の残りの部分は、反応器のセットアップのこのタイプを扱います。 反応流（RF）列の設計は、移動相が外側に位置し、半径方向の中央列の領域または3のポートに配置された単一のポートのいずれかを介してカラムを出る（または入力）することを可能にするマルチポートエンドフィッティングを組み込んカラムの壁領域（ 図3参照 ）。これらの二つの流れを順番にカラム壁に張り出し、外側多孔質フリットに囲まれている不透過性のリングに囲まれている中央の多孔質フリットを含むエンドフィッティングを用いて分離されています。中央不透過性リングクロスフローに2多孔性領域の間では不可能です。 反応流クロマトグラフィーの間に、誘導体化試薬（複数可）は一つ又はTWに移動相の流れ方向に対してポンピングされます反応流列の外側ポートのO。カラム溶出液は、外側のフリットで誘導体化試薬（複数可）と混合し、無料の外側ポートを介して検出器に渡されます。反応流は、単一の試薬誘導体（誘導体化試薬のための1ポート、1ポートは、検出器とブロックされた1ポートに、カラム溶離液を通過させるように）またはデュアル試薬系誘導体化試薬とを1ポート（2ポートのいずれかのために使用することができます）検出器にカラム溶離液を通過させます。中央ストリームからの流れは、いずれかの誘導体化されていないカラム溶離液、効果的に多重化検出23、または無駄に渡さを検出するために使用することができます。 RF-PCDクロマトグラフィーを実行するときに利用可能である一つの主要なチューニング技術は、中央と周辺の流れの比率です。各誘導体化のための最適な比率は、中央フローが検出されたり無駄に渡されるかどうかなど、多くの要因に依存します。したがって、最適な比率が決定された後正確な流量比は、各ランが実行される前に達成されることが保証されるべきです。 フリットの使用が一般的にゼロデッドボリュームのTピースまたは低デッドボリュームを採用し、従来の混合技術と比較して、より効率的な混合でRF-PCD結果の列溶離液流と誘導体化試薬を混合することが見出されていますW-作品は、2つのストリームを混合します。これは、比較的小さな反応ループの使用、または全く反応ループのさえ排除を可能にしました。伝統的なポストカラム誘導体化法に比べてシャープなピークで反応ループサイズの結果の減少。これは、全てのカラム溶離液のが誘導体化されるという事実にもかかわらず、対雑音比より高いシグナルが観察され、したがって検出及び定量化の下限を達成することができる、ということを意味します。 反応流クロマトグラフィーは、PCD反応の適応の困難を克服するために開発されました現代のHPLCカラムやシステムへの、による大容量の反応ループを採用する必要性に起因する大規模なポストカラムデッドボリュームに広げるバンドに起因する効率の特に損失。従来のPCDと比較して、RF-PCDで、より効率的な混合プロセスは、より小さな反応ループ量が観測された分離効率の上昇につながる使用されてもよいことを意味します。さらに、RF-PCDクロマトグラフィーは両方の増加したシグナルを示し、従来のPCD法に比べて検出および定量の下限をもたらす従来のPCDの技術に比べ、ノイズを減少させました。従来のPCD法に比べてRF-PCDのさらなる利点は、RF列の中央のポートだけでなく、列の周辺領域から溶出する誘導体化されたストリームから溶出する非誘導体化ストリームを監視する機能です。 RF-PCDは、従来のPCDの方法に比べて多くの利点が表示され、比較的新しいが、有望な技術です。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HPLC instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Series HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional Pump(s) for derivatisation system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>LC-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF colum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-commercial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z227307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided with column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tube cutter</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z290882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale Balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4-point analytical balance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop watch</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-Scientific equiptment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eluent collection vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Small vial with a flat bottom will do e.g. HPLC vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Will depend on instrument used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessels for mobile phase and derivatisation solution(s)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Laboratory glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPPH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminoantipyrene&#160;</td>
			<td>Acros Organics BVBA</td>
			<td>AC103151000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferricyanide&#160;</td>
			<td>AnalaR</td>
			<td>B10204-30</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

post column derivatization using reaction flow high performance liquid chromatography columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

RF-PCDによる使用のために適合された第一のPCD法は、2,2-ジフェニル-1- picrylhydrazilラジカル（DPPH•）24を用いて、酸化防止剤の誘導体でした。この反応は、25。コーレバらによって導入された、広く以来使用されています。検出は、活性酸素種の存在下でDPPHラジカル•の脱色、観察された吸光度の低下で抗酸化物質の結果のそれ故に存在に依存しています。 DPPH•反応は、多くの場合、しかし、それは、RF-PCDカラムを使用時に反応ループを必要としないことがわかった、500μL以上13-15の大型反応ループを採用している。 図5は、使用して誘導体化リステロットコーヒーのサンプルの2つのクロマトグラムを示しています従来のPCDとRF-PCDの計測器の両方を使用して、DPPHラジカル•。 RF-PCDによる使用のために適合された第2のPCD法デアあります誘導体化試薬23としてフルオレサミンを使用して、4つのアミノ酸（グリシン、ロイシン、フェニルアラニンおよびトリプトファン）のivatization。この方法は、RF列で使用するために最適化された移動相の組成、フルオレサミン濃度およびフルオ流量でUdenfriend ら 11によって仕事から適応されました。従来の方法は、pH 9.0緩衝液を既にバッファされた移動相を利用したRF-PCD法一方、フルオレサミン試薬の添加前に、流出液流に加えた二試薬誘導体化システム、従って、単​​一の試薬誘導体化システムを利用しました必要とされました。この用途のために誘導体化されたストリームは、蛍光による検出のために使用される励起波長に相当するUV可視検出器を用いて390 ​​nmで分析しました。誘導体化されたストリームは、ノイズに大きなシグナルを与え、蛍光検出器を用いて検出し、したがって検出及び定量の下限することができitation、Udenfriend ら 11作品あたりとして。また、RF-PCDのセットアップの中心ポートからの溶離液は、第​​2のUV可視検出器を用いてモニターしました。 アミノ酸の誘導体化のためのRF-PCD法の性能は、従来のPCD法と比較した。 表1に、RF-PCDおよびPCD従来のモードの両方で分析したアミノ酸の各々について定量および検出の計算された限界。検出限界は、定量限界は10の信号対雑音比が達成された濃度であると定義しながら2の信号対雑音比が得られた濃度であると定義した。 図6は、4つのクロマトグラムを示しますアミノ酸は、従来のPCD法、RF-PCD法やRF-PCD法から誘導体化されていないストリームを用いて分析した。 図7は、エンドウ豆のために得られたシグナルの比較であります従来のPCD法やRF-PCD法の両方を使用して、グリシンおよびロイシンによるKS従来のPCD法、RF-PCD法及びRF-から誘導体化されていないストリームを用いて分析すると、 図8は、トリプトファンピークのピーク幅とを比較しますPCD法。 RF-PCD 26による使用のために適合された最終的なPCD法は、4つのフェノール類（フェノール、4-メトキシフェノール、p個の -cresolおよびトコフェロール）の誘導体です。この方法は、RF列で使用するための方法を最適化するために小さな変更を加えBigleyとグロブ27によって仕事から適応されました。この作品は、両方の4-amionantiprineとフェリシアン化カリウムの溶液は、RFカラムのエンドフィッティングでカラムの溶出液に添加した二成分誘導体化反応を利用しました。これは、反応に使用されるために必要な追加のポストカラム反応ループをRFカラムを使用していないときにすることが見出された。 図9は、ここでクロマトグラムの一例を示しています分離し、誘導体化および検出されたしない誘導体化方式およびいくつかの（黒のトレース）に対する応答を示すいくつかの成分を含有していた21成分試験サンプル。同じ混合物はまた、分離して比較（赤トレース）のための非誘導体化を検出しました。 図9において、RF-PCD応答が容易に視覚的な区別（取得した検出器応答が陽性であった）のための負の応答として表示されていた。 図10は、pのピーク形状の比較は-cresol両方RF-PCDカラムを使用し、誘導体化を示し非誘導体化。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53462/53462fig1.jpg" /> 図1. クロマトグラフカラムと検出器との間に追加された様々なデッドボリュームとHPLCシステムに注入ヘキシルベンゼンのオーバーレイ。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53462/53462fig1large.jpg" target="_blank">してください</a><html>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53462/53462fig2.jpg" /> 図2. トルエン、エチルベンゼンとカラムと検出器との間に追加された様々なデッドボリュームとHPLCシステムに注入プロピルベンゼンのクロマトグラフオーバーレイ。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53462/53462fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53462/53462fig3.jpg" /> 反応流列の設計図3.イラスト。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53462/53462fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> tp_upload / 53462 / 53462fig4.jpg &quot;/&gt; 図4.インストゥルメンタルは、RF-PCDの設定。（A）単一の試薬 ​​（ すなわち 、DPPH•またはフルオレスカミン誘導体化試薬）及び（B）デュアル試薬（ すなわち 、4-aminoantipyreneとフェリシアン化カリウム誘導体化試薬）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53462/53462fig4large.jpg" target="_blank">表示するには、こちらをクリックしてください。この図の拡大版。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53462/53462fig5.jpg" /> 2,2-ジフェニル-1- picrylhydrazilラジカル（DPPH•）を使用して、ポストカラム誘導体化後の検出とリステロットコーヒーの分離 図5 クロマトグラム。誘導体化は500μlの反応コイル（A）と、従来のカラムを用いて行きました反応流カラム（B </st<html> ）&gt;栄。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53462/53462fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53462/53462fig6.jpg" /> 後PCD試薬としてフルオレサミンを使用して、ポストカラム誘導体化によって検出された10〜1,000 ppmの範囲にわたって4個のアミノ酸（グリシン（G）、ロイシン（L）、フェニルアラニン（P）およびトリプトファン（T））の 図6 クロマトグラフのオーバーレイHPLCによる分離 。 （A）は、従来のPCD、（B）RF-PCD、および（C）RF-PCDから中央（非誘導体化）ポート：次のようにクロマトグラムは、 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53462/53462fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html> _upload / 53462 / 53462fig7.jpg &quot;/&gt; グリシン（最初のピーク）と、従来のPCD（赤のトレース）とRF-PCD（黒のトレース）からロイシン（第2ピーク）のために得られる信号の 図7 の比較。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53462/53462fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/53462/53462fig8.jpg" /> （A）保持時間および（B）ピークボリュームに基づいによるトリプトファンピークの図8.ピーク幅比較。黒のトレースは、従来のPCD法を示し、赤色のトレースは、RF-PCD法を示し、緑のトレースが示していますRF-PCD法の中心港から誘導体化されていないストリーム。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53462/53462fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 1 &quot;&gt;：&quot; =キープtogether.within-ページFO」10トン<img alt="図9" src="/files/ftp_upload/53462/53462fig9.jpg" /> 人工的なサンプルの 図9 クロマトグラフィー分離。成分は、フェノール（P）、4-メトキシフェノール（M）、p個の -cresol（C）およびトコフェロール（T）、ならびに多数のアルキルベンゼン、多核芳香族炭化水素、アニソール、phentanoleを含みますカフェイン、フェニルアラニンおよびベンズアミド。 IIのI、及びiiiラベルされたピークは、予想外に誘導体化方式に応答したアルキルベンゼンです。赤色トレースは500 nmで誘導体化された応答を表す黒のトレースを254nmでUV検出器を用いて誘導体化されていない応答を表します。誘導体化された応答が反転された映像の明瞭さのために注意してください。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53462/53462fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図10" src=「/files/ftp_upload/53462/53462fig10.jpg &quot;/&gt; p個の -cresolの 図10. クロマト応答赤いトレースは500 nmで誘導体化（RF-PCD）の応答を表している。黒のトレースは、254nmのUV検出器を用いて誘導体化されていない応答を表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53462/53462fig10large.jpg" target="_blank">の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。</a> <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="0.9in" rowspan="2" style="width:100px"> 反応型 </td><td colspan="2"> グリシン </td><td colspan="2"> ロイシン </td><td colspan="2"> フェニルアラニン </td><td colspan="2"> トリプトファン </td></tr><tr><td> LOD（PPM） </td><td> LOQ（PPM） </td><td> LOD（PPM） </td><td> LOQ（PPM） </td><td> LOD（PPM） </td><td> LOQ（PPM） </td><td> LOD（PPM） </td><td> LOQ（PPM） </td></tr><tr><td> RF-PCD </td><td> 6 </td><td> 25 </td><td> 10 </td><td> 100 </td><td> 25 </td><td> 250 </td><td> 50 </td><td> 250 </td></tr><tr><td> RF-PCD中央ポート（非誘導体化） </td><td colspan="2">検出されず</td><td colspan="2">検出されず</td><td colspan="2">検出されず</td><td> 1 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 従来のPCD </td><td> 10 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 500 </td><td> 50 </td><td> 500 </td><td> 100 </td><td> 500 </td></tr></tbody></table> HPLCによる分離後誘導体化試薬としてカミン使用して別のポストカラム誘導体化システムによって検出された四つの異なるアミノ酸の検出および定量の 表1 を制限します。

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Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

反応フロー高速液体クロマトグラフィー用カラムを使用したポストカラム誘導体化

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

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Nanyang Technological University

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14.9K ビュー.  University of Western Sydney. A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

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Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析（UPLC-MS）による血清中の大規模非標的メタボロームプロファイリング

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

化学

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

超高性能液体クロマトグラフィーによる組成解析のための細菌細胞壁の分離と調製

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

パラレル・セグメントフローカラムをチューニングし、多重化された検出のイネーブル化

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

カーテンフローカラム：効率の最適化と感度

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Synthesis of Programmable Main-chain Liquid-crystalline Elastomers Using a Two-stage Thiol-acrylate Reaction

This study presents a novel two-stage thiol-acrylate Michael addition-photopolymerization (TAMAP) reaction to prepare main-chain liquid-crystalline elastomers (LCEs) with facile control over network structure and programming of an aligned monodomain. Tailored LCE networks were synthesized using routine mixing of commercially available starting materials and pouring monomer solutions into molds to cure. An initial polydomain LCE network is formed via a self-limiting thiol-acrylate Michael-addition reaction. Strain-to-failure and glass transition behavior were investigated as a function of crosslinking monomer, pentaerythritol tetrakis(3-mercaptopropionate) (PETMP). An example non-stoichiometric system of 15 mol% PETMP thiol groups and an excess of 15 mol% acrylate groups was used to demonstrate the robust nature of the material. The LCE formed an aligned and transparent monodomain when stretched, with a maximum failure strain over 600%. Stretched LCE samples were able to demonstrate both stress-driven thermal actuation when held under a constant bias stress or the shape-memory effect when stretched and unloaded. A permanently programmed monodomain was achieved via a second-stage photopolymerization reaction of the excess acrylate groups when the sample was in the stretched state. LCE samples were photo-cured and programmed at 100%, 200%, 300%, and 400% strain, with all samples demonstrating over 90% shape fixity when unloaded. The magnitude of total stress-free actuation increased from 35% to 115% with increased programming strain. Overall, the two-stage TAMAP methodology is presented as a powerful tool to prepare main-chain LCE systems and explore structure-property-performance relationships in these fascinating stimuli-sensitive materials.

A novel methodology is presented to synthesize and program main-chain liquid-crystalline elastomers using commercially available starting monomers. A wide range of thermomechanical properties was tailored by adjusting the amount of crosslinker, while the actuation performance was dependent on the amount of applied strain during programming.

二段チオールアクリレート反応を使用してプログラム可能な、主鎖液晶エラストマーの合成

This study presents a novel two-stage thiol-acrylate Michael addition-photopolymerization (TAMAP) reaction to prepare main-chain liquid-crystalline ...

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.

高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）とグルコシノレートの抽出および分析のための簡単な方法

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and related diseases, but their precise measurement is still a challenge. Many protocols have been described for neurotransmitter measurement by a variety of instruments, including high-pressure liquid chromatography (HPLC). However, there are shortcomings, such as complicated operation or hard-to-detect multiple targets, which cannot be avoided, and presently, the dominant analysis technique is still HPLC coupled with sensitive electrochemical or fluorimetric detection, due to its high sensitivity and good selectivity. Here, a detailed protocol is described for the pretreatment and detection of catecholamines with high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ECD) in real urine samples of infants, using electrospun composite nanofibers composed of polymeric crown ether with polystyrene as adsorbent, also known as the packed-fiber solid phase extraction (PFSPE) method. We show how urine samples can be easily precleaned by a nanofiber-packed solid phase column, and how the analytes in the sample can be rapidly enriched, desorbed, and detected on an ECD system. PFSPE greatly simplifies the pretreatment procedures for biological samples, allowing for decreased time, expense, and reduction of the loss of targets. 
Overall, this work illustrates a simple and convenient protocol for solid-phase extraction coupled to an HPLC-ECD system for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters (norepinephrine (NE), epinephrine (E), dopamine (DA)) and two of their metabolites (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) and 3,4-dihydroxy-phenylacetic acid (DOPAC)) in infants' urine. The established protocol was applied to assess the differences of urinary catecholamines and their metabolites between high-risk infants with perinatal brain damage and healthy controls. Comparative analysis revealed a significant difference in urinary MHPG between the two groups, indicating that the catecholamine metabolites may be an important candidate marker for early diagnosis of cases at risk for brain damage in infants.

We present a convenient solid-phase extraction coupled to high-pressure liquid chromatography (HPLC) with electrochemical detection (ECD) for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters and two of their metabolites in infants' urine. We also identify the metabolite MHPG as a potential biomarker for the early diagnosis of brain damage for infants.

抽出と神経伝達物質カテコールアミン及びその代謝物の高速液体クロマトグラフィーによる分析のための便利な方法

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Continuous Flow Chemistry: Reaction of Diphenyldiazomethane with p-Nitrobenzoic Acid

Continuous flow technology has been identified as instrumental for its environmental and economic advantages leveraging superior mixing, heat transfer and cost savings through the &#34;scaling out&#34; strategy as opposed to the traditional &#34;scaling up&#34;. Herein, we report the reaction of diphenyldiazomethane with p-nitrobenzoic acid in both batch and flow modes. To effectively transfer the reaction from batch to flow mode, it is essential to first conduct the reaction in batch. As a consequence, the reaction of diphenyldiazomethane was first studied in batch as a function of temperature, reaction time, and concentration to obtain kinetic information and process parameters. The glass flow reactor set-up is described and combines two types of reaction modules with &#34;mixing&#34; and &#34;linear&#34; microstructures. Finally, the reaction of diphenyldiazomethane with p-nitrobenzoic acid was successfully conducted in the flow reactor, with up to 95% conversion of the diphenyldiazomethane in 11 min. This proof of concept reaction aims to provide insight for scientists to consider flow technology&#39;s competitiveness, sustainability, and versatility in their research.