Name: enrichment of bruch's membrane from human donor eyes
Uploaded: 2015-11-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
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著者は博士アイザックザンブラーノとヒトドナー眼組織の供給のためのマンチェスター眼科病院アイバンクのスタッフ、そしてH＆E染色された画像のためのライフサイエンス組織学施設の学部のミスター・ピートウォーカーを承認したいと思います。特別な感謝を顕微鏡で彼の助けのために氏ロジャー・メドウズに行きます。 SJCは、医学研究審議会（MRC）キャリア開発フェローシップ（MR / K024418 / 1）の受信者であると著者らはまた、視力（1866）と黄斑社会のために戦う、MRC（G0900538とK004441）から、他の最近の研究資金を認めます。

研究目的のために同意ヒト眼組織は、移植のために角膜の除去後マンチェスターロイヤル眼科病院アイバンクから入手しました。研究のためのヒト組織の使用は、ヒト組織法（2004）のガイドラインに従った、と大学の研究倫理委員会の承認を得て（11305を参照します）。 全体ブルッフ膜の1濃縮<ol><li> 1％の消毒剤（V / V）の周りと解剖顕微鏡下にワークスペースをきれいにした後、70％（v / v）のエタノールで拭いてください。 </li><li>次のことを確認し、手にしている：1つの新しい使い捨てメス、2滅菌細胞スクレーパー（一般的に、組織培養で使用される）とピンセットの3組（A、B、Cのようここに記載されているが、材料のリストを参照）。 </li><li>後で使用するために蓋を保持し、使い捨てペトリ皿に目の地球儀を置きます。新しい使い捨てメスを使用して、フラットなMOの作成に干渉する可能性がある、任意の残留視神経を削除組織のUNT。次に、第3部（黄斑ブルッフ膜の濃縮）に進む黄斑領域をカットしない場合は4切開が均等に、4つの象限を作成するために間隔をあけてください。 <ol><li>最も内側の感覚神経網膜（NSR）から、脈絡膜と強膜（白目）を通して - 切開は、眼組織の深さ全体を通って延びていることを確認してください。切開を視神経にアイカップのマージンから目のラウンドのすべての方法を継続します。これは、アイカップは、（ 図1B参照 ）を平坦化することができるようになります。 </li></ol></li><li>グリップに硝子体とその下のNSRを大きなピンセットBを使用し、中心に向かって移動し、周囲から始まる離れた網膜色素上皮（RPE）から、この組織を引っ張る、（脈絡膜剥離を防止するために）ピンセットAを用いて平坦化されたアイカップの1象限を開催開いたアイカップの、その後反対側へ。通常、常に硝子体とNSRの両方が一つと切り離しませ。 scalpeを使用してください視神経乳頭にアンカーの残留NSRを切除するリットル。 </li><li>ここでも、ピンセットAを使用して所定の位置に組織の1象限を保持しながら、ゆっくりとアイカップの内面全体からRPE単層を取り除くために、無菌の細胞スクレーパーを使用しています。これらの細胞は、容易に取り外し、暗褐色着色塊として見ることができます。優しくアイカップから離れて外れRPE細胞を洗浄するために、PBSですすいでください。 </li><li>次に、静かにすべての4目の象限から（ブルッフ膜および脈絡膜の両方を含む）上にある暗赤色の組織を剥離するためにピンセットAを使用しています。きれいな皿に切除した組織を置きます。 </li><li>優しく組織をこすりするために第2のスクレーパーを使用し、所定の位置に切除した組織を保持するために、1つのセルスクレーパーの平坦化エッジを使用しました。以上の組織を回して繰り返し、できるだけ多くの余分な材料を除去します。最終的には、半透明の膜が残ります。これはぞんざいに濃縮ブルッフ膜です。 20X倍率の少なくとも解剖顕微鏡の使用でありますブルッフ膜の脈絡膜と充実の除去を助けるのに不可欠。 </li><li>パスツールピペットを使用して、簡単に1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに膜を配置する前に残留脈絡膜および血液を除去するために、超純水でブルッフ膜をすすぎます。 </li><li> （ 図2参照）を任意の汚染細胞物質を溶解を助けるために約1mlの超純水と渦簡単に（約15秒）で濃縮されたブルッフ膜を一時停止します。膜をペレット化し、上清をオフに吸引するために30秒間500×gでサンプルを遠心。 注：残りの濃縮ブルッフ膜は、後の使用のために-80℃で、今の可溶化のために準備（下のセクション2で説明したように）、またはストレージです。 </li></ol>全体エンリッチドブルッフ膜およびウェスタンブロット分析の2可溶化<ol><li> 500μlの8 Mウルの組織を浸漬することによって、濃縮されたブルッフ膜からタンパク質を抽出します1.5mlの微小管（ 図3A）で、室温で6時間EA。 </li><li>残りの細胞外物質をペレット化し、10分間10,000×gで遠心分離し、可溶化サンプル。上清を除去し、3500ダMWCO透析膜に転送し、その後、4℃で16時間透析をPBS 1Lにサンプルを配置します。 </li><li>各サンプルについて、タンパク質の分離ビーズの40μlを添加し、室温で30分間サンプル/ビーズミックス（回転ミキサーで20 rpm）を回転させます。 </li><li>ビーズをペレット化するため5分間万×gで遠心分離サンプル。上清を除去し、30μlの2倍のサンプルローディングバッファー（65.8 mMトリス塩酸、pHが6.8、2.1％SDS、26.3％（w / v）のグリセロール、0.01％ブロモフェノールブルー、3％のβメルカプトエタノール）中のビーズに結合したタンパク質を可溶化。 </li><li> 10分間100℃でサンプルをインキュベートした後、残りのビーズをペレットに5分間万×gで遠心します。 </li><li>プレキャストへの放出されたタンパク質が含まれている上清をロードし、SDS-タンパク質分離のためのページ勾配ゲル（素材リストを参照してください）​​。 </li><li> 例えば一般的な染色プロトコル、クマシーブルーを用いて分離されたタンパク質バンドを可視化。 <ol><li>簡潔には、ゲルにブリリアントブルー染色（0.1％ブリリアントブルー（w / v）で、50％メタノール、10％氷酢酸、40％水）の20 mLを加え、そして穏やかに撹拌しながら室温で30分間インキュベート。 </li><li>染色溶液を廃棄し、バックグラウンド染色は、染色されたタンパク質バンドの可視化を可能にするのに十分になるまで脱イオン水を用いて染色したゲルを洗浄します。 </li><li>以下に説明するように代替的には、転送は、ウェスタン分析のためにニトロセルロースへのタンパク質バンドを分離しました。 </li></ol></li><li>転送は、転送バッファにおける半乾燥転写装置（25 mMトリス、192 mMグリシン、10％[v / v]のメタノール）を用いて2.5時間、80 mAでニトロセルロース膜上のタンパク質バンドを分離しました。 </li><li> 10 mlのPBS、10％で膜をブロック目の前に4℃で16時間、ミルク、0.02％（w / v）のBSA（w / v）のタンパク質検出のための所望の一次抗体の電子付加。 注意：ここでは例として、図3Cは、補体カスケード、H因子様タンパク質1（FHL-1）のレギュレータをプローブ3つの別々のドナーからの可溶化ブルッフ膜の代表的なイムノブロットを示しています。 </li></ol> 3.濃縮黄斑ブルッフ膜の<ol><li>前述のように1.3 - 手順1.1に従ってください。 </li><li> NSRは、所定の位置にまだであるが、中央の黄斑領域（ 図4を参照）を表し、黄色の中心窩の着色を探します。無菌の6mm生検パンチを使用して、中心窩領域の上に置き、しっかりと黄斑にカット。 <ol><li>生検パンチ刃の端にアイカップの縁からメスで別々の切開を行い、所定の位置に生検パンチを維持した後、ピンセットBを用いて、きれいな生検を達成するために、周囲の目材をはがします。 </li></ol></li><li>ピンセットCを使用して、削除しますきれいなペトリ皿のふたにパンチと場所からの組織の6ミリメートルディスク。解剖顕微鏡下でペトリ皿の蓋と黄斑パンチを配置します。 </li><li> （生検の精度を推定するために黄色の中心窩の染色のために確認してください）​​薄いNSRディスクを取り出します。静かにRPE細胞を除去するために、無菌の細胞スクレーパーを使用してください。 </li><li>ピンセットAのチップを使用して強膜を介し黄斑ディスクを固定し、再びゆっくりとピンセットCを使用して、脈絡膜とブルッフ膜複合体を剥がし、ブルッフ膜から不要な脈絡膜および血液物質を除去するために、セルスクレーパーを使用しています。 </li><li> 1.5mlの微小管に黄斑ブルッフ膜を配置し、1ミリリットルの超純水に懸濁します。任意の汚染細胞物質を溶解するのに役立つ簡単にボルテックス（約15秒）。膜をペレット化し、上清をオフに吸引するために30秒間500×gでサンプルを遠心。 注：黄斑から単離された濃縮されたブルッフ膜は、現在のプロテオミクスのために使用することができるANユーザの好みの消化プロトコルを使用してalysis。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

ここでは、ウェスタンブロッティング11、質量分析および修正ウッシングチャンバー11,14を利用ブルッフ膜の拡散特性を含むその後の分析を可能にする、さらなる分析のためのブルッフ膜の濃縮を記述する。重要なステップは、a）は、眼の内面を徹底的に削れと洗浄がブルーフが崩壊させることなく、すべてのRPE細胞B）根底にある脈絡膜の繰り返しと慎重スクレイピングを除去し、超純水で切除したブルッフのC）の洗浄が含ま残留細胞の溶解を確実にします。濃縮されたブルッフ膜は、プロテオーム解析のために利用される場合さらに、尿素処理によるタンパク質の抽出は、例えば、機械的な均質化のような他の方法と比較して、この弾力性の組織を破壊するのに最も有効です。濃縮されたブルッフ膜の組織学は、脈絡膜毛細血管のECMは削除されませんを示しています。これは、元になることですpentilaminarブルッフ膜の外層としてpectedは脈絡毛細管内皮細胞の基底膜により形成されています。実際、変更が終末補体複合体/膜攻撃複合体（MAC）15の堆積を含む、AMDで、この中に発生すると脈絡膜毛細血管のECMは残っていることが有利で ​​あり得ます。それは強膜、脈絡膜、及びブルッフ膜の存在下で切断した場合ブルッフ膜の詳細な組織学的分析のために、その構造がよく保存されることに留意すべきです。実際、 図2に示す組織学は、単に、この原稿に記載された技術に起因する濃縮度を実証することを意図しています。 黄斑ブルッフの濃縮は、NSR、特に窩が損傷していないことを確認して、アイカップを慎重に解剖が必要です。それ以外の場合は、識別や黄斑のので、分離はできません。 TISSUの整合性Eはまた、このプロセスに重要であり、それが48時間、死後時間下のサンプルを使用することが推奨されます。必要な濃縮の程度は、ドナー間で変化し、ドナーの年齢、死後時間、および任意の眼病変の存在によって影響され得ます。濃縮という用語の使用がこのメソッドを使用して「精製」またはブルッフ膜の「分離」は、単純に不可能であるということで、技術の限界を認めるで意図的です。確かに、脈絡膜毛細血管のECMがブルッフ膜に合流完全な分離が不可能であることを考えます。 それぞれの眼組織の生化学的変化を理解することは、眼疾患の進行を理解する上で不可欠です。ブルッフ膜のこのユニークな濃縮は、このような理解を促進し、現在進行中の研究は、AMDの異なる段階で質量分析法を用いて濃縮された黄斑ブルッフ膜のプロテオームを検討していますAMDの分子病態の理解を改善するために、異なる遺伝子型を有する被験者から発信サンプルインチ既にここに記載の技術は、正常ブルッフ膜11における優勢な補体調節因子としてFHL-1を同定するために使用され、濃縮されたブルッフ膜上のさらなる研究は、AMDの分子病理学に多くの新たな洞察をもたらす可能性があります。

眼科研究の死後、人間の眼組織の使用は、眼疾患の病因の理解のための貴重な資源です。人間のドナーの目の分析は、西側世界1における失明の主な原因である加齢黄斑変性症（AMD）を、支える仕組みを見極めるために重要な貢献をしてきました。世界的に、AMDはすべての失明の約8.7％を占め、ますます高齢化と、それは2020年2によって1.96億人に影響を与えると予測されています。AMDは、中心視力の低下をもたらし、患者の自立と生活の質に大きな影響を持っています3。早期のAMDは、ドルーゼンの形成によって特徴づけられ、それは、地図状萎縮（時々「ドライ」AMDとも呼ばれる）、または脈絡膜血管新生に進行することができる（また、血管新生または「ウェット」AMDとも呼ばれます）。抗VEGF注射は血管新生AMDのそれの私の視力を安定させるか、改善することができる一方で治癒的じゃないし、現在では、何の治療は、地図状萎縮のために存在しません。 特定の遺伝的変異体は、AMDリスク4変更することが示されている一方で- 8を 、以下では、これらの変異体は、生化学的レベルでの黄斑にどのような影響を与えるかについては知られています。 AMDの病因に重要なサイトでは、ブルッフ膜です。このような構成と様々な研究内のドルーゼンのフォームは、AMD 9でブルッフ膜とその周辺補体活性化の証拠を提供しました。ブルッフ膜は、脈絡膜から網膜色素上皮（RPE）細胞を分離し、細胞外マトリックスのシートであり、約4ミクロンの厚さです。ブルッフ膜は、脈絡毛細管枝に合流する、有窓毛細血管及びこれへの外部を含んで脈絡膜の層は、より大きな血管10（ 図1A）を含む層です。 ブルッフ膜は、追加のpentilaminarシートであります細胞外マトリックス（ECM）、そしてこの方法は、主に脱細胞化および赤血球のない根本的な脈絡（以下、ブルッフ膜を豊かにするという）のECMとともに、ブルッフ膜を分離する方法について説明します。濃縮されたブルッフ膜は、次いで、ウェスタンブロッティング及び組織学の実験に使用しました。また、単に目の黄斑領域から、ブルッフ膜を豊かにするための方法論は、AMDの生化学的側面を調査したものに特に興味を持ってもらえるでしょうこれは、記載されています。

<table><tbody><tr><td>Auxillary objective 0.5X</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>3638</td><td>Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount</td></tr><tr><td>Biopsy Punch 6 mm</td><td>Oncall Medical Supplies</td><td>SCH-33-36</td><td>6mm Biopsy Punches</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Cell scrapers</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td>For membrane enrichment</td></tr><tr><td>CyroPure Cyrovials</td><td>Sarstedt</td><td>72.38</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpels</td><td>Fisher Scientific</td><td>12387999</td><td>Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.</td></tr><tr><td>Dual Gooseneck LED spot lights on 30 cm arms</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>0153</td><td>Flexible light source essential for dissection and imaging</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D8537</td><td>Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.</td></tr><tr><td>(A) Forceps</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>INS4280</td><td>(A) Fine (100 mm) and straight</td></tr><tr><td>(B) Forceps</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>INS4272</td><td>(B) Broad and blunt (150 mm). Useful for lifting large portions of sample</td></tr><tr><td>(C) Forceps</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>INS4323</td><td>(C) Straight fine points</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>G1345</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>GXCAM 5 digital colour camera &amp;amp; GT-Vision software</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>1122</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Sterilin</td><td>101VR20</td><td>90 mm, used as a dish for samples</td></tr><tr><td>Protein isolation beads (Strataclean resin)</td><td>Agilent</td><td>400714-61</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7X - 45X)</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>5595</td><td>Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

enrichment of bruch's membrane from human donor eyes

加齢黄斑変性症（AMD）は、先進国における視力障害の主な原因です。この疾患は、中心視力の喪失、黄斑と呼ばれる網膜の中心部の破壊によって現れます。初期のAMDは、このような地理的萎縮症（AMDを乾燥）または血管新生（滲出型AMD）などの後期AMDに進行させることができるソフトドルーゼンと呼ばれる小さな、黄色がかった病変が存在することを特徴とします。臨床変化は十分に記載されており、AMDのリスクを与えるの遺伝的影響の理解がこれまで以上に詳細になっていますが、主要な進歩を欠いている一つの領域は、遺伝的リスクの生化学的影響を理解することです。これは、ブルッフ膜、血液供給からの物質の生物学的フィルタおよび網膜色素上皮（RPE）細胞単層が存在する足場として機能し、非常に薄い細胞外マトリックスの生化学を理解する上で困難に部分的に起因しています。ドルーゼンFブルッフ膜及びその存在中にORMは、RPE細胞への栄養素の流れが中断されます。唯一の他のタンパク質は、それとの対話方法を実際にブルッフ膜のタンパク質組成を調査し、によって、研究者は、ドルーゼンの形成、AMDとその後の視力喪失の発展を支える生化学的機序を解明するために望むことができます。本稿では、それが下流の生化学的解析のために使用され、これはすでにブルッフ膜の生化学の理解をどのように変化しているかの例を提供することができるように、全体のブルッフ膜、または単に黄斑領域のいずれかからを豊かにするための方法論を詳しく説明します。

プロトコルは、ブルッフ膜の分離に富んでブルッフ膜の結果を生成するために、上記の脈絡膜毛細血管のECMおよびRPE（ 図2）の全てを含む細胞/細胞破片のほとんどが削除されます。水に濃縮されたブルッフ膜の洗浄は、残りの脈絡膜細胞を溶解における重要なステップです。脈絡膜の廃棄時に加わる圧力がブルッフ膜（ 図2B）のように定義された領域の中にいくつかの残りの細胞核の一部を圧縮するために表示されます。 濃縮されたブルッフ膜の可溶化は、タンパク質含有量の下流の分析を可能にします。 4使用して可溶化濃縮ブルッフ膜のタンパク質バンドの分離 - 12％勾配SDS-PAGEゲルを、タンパク質含有量を特定するために、それ自体で有用ではないながら、アーカンソー血液タンパク質を汚染最小化するためにこの技術の能力を実証ん電子非特異的に結合した（ 図3B）。この点において、タンパク質ゲルの実行から1顕著な不在は、そうでなければ、解釈するのブロッティング、その後の西洋のがより困難になる場合があり、ヒト血清アルブミン（〜66 kDaの）のかなりのバンドである。図2に示した濃縮されたブルッフ膜の組織学的分析もサポートしていますこの。実際、以前に11を説明し、作業の一環として、個々のドナーのシリーズからブルッフ膜は、ウェスタンブロッティング（ 図3C）を介して特異的な抗体を用いたタンパク質の数についてプローブした可溶化。ここに示す例では、補体因子H（FH）と呼ばれ、先天性免疫の155 kDaのレギュレータに対する抗体（OX23と呼ぶ）12が使用され、独立した3〜ブルッフ膜試料中の低分子量バンドの存在を実証しました。ドナー（ 図3C）。これは、その後、因子H様タンパク質1（FHL-1）であることが判明します、49 kDaのタンパク質FHに関連し、同じ遺伝子13のスプライス変化から生じます。 FHL-1は、ブルッフ膜11に存在する主要な補体調節因子であることが表示されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" /> ブルッフ膜の人間の眼と充実の図1解剖。（A）ブルッフ膜は、細胞外マトリックスの障壁です。脈絡膜は、連続的に（脈絡膜毛細血管と呼ばれる）ブルッフ膜に合流有窓毛細血管の層を含み、これらは、生理学的に光受容体細胞をサポートする網膜色素上皮（RPE）細胞単層から（大血管を含む）、脈絡膜の残りの部分を分離します神経感覚網膜（NSR）のヒトへのアイカップ（B）は、4つの切開部は、それがフラットマウントを作成するために開くことができるように作られています。ザ・硝子体は、ピンセットを用いて除去することができます。 NSRは、硝子体と一緒にオフに来るかもしれませんが、また、ピンセットを用いて除去することができます。細胞スクレーパーは、それがまだ脈絡膜や強膜に固定されている間ブルッフ膜からRPE細胞層を除去するために使用されます。ブルッフ膜/脈絡膜複合体を離れて強膜から剥離し、新しい細胞スクレーパーを使用して、外側の脈絡膜を除去することができることができます。超純水で最終洗浄は、残りの細胞物質を溶解する。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" /> 図2.超純ワシントン州ブルッフ膜及び洗浄から外側の脈絡膜構造を削り取るブルッフ膜と、（A）の前脈絡。H＆E染色した切片の組織学および後（B）濃縮されたブルッフ膜を生成するために、ター。スケールバーは20μmでを表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" /> タンパク質含量の分析について濃縮ブルッフ膜の図3.可溶化。（A）タンパク質をPBSに対して透析される前に、室温で6時間8 M尿素中でインキュベートすることにより、濃縮されたブルッフ膜から抽出することができます。ウエスタン分析のために、全体のブルッフ膜の透析液からのタンパク質は、タンパク質分離ビーズを用いて、サンプルローディング緩衝液を減少させるレムリで煮沸することによって溶出して単離することができる。（B）代表的なクマシーブルーニート希釈可溶化ブルッフ両方の膜を示す、SDS-PAGEゲルを染色（BM）方法Dを用いて。（A）に傍接した（C）3個々のドナーからの可溶化ブルッフ膜の代表的なウエスタンブロット（レーン1から3）。H因子様タンパク質1（FHL-1）についてプローブ<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" /> 黄斑から濃縮ブルッフ膜の図4の単離。黄斑領域が容易に黄色の上にある中心窩の着色、及び隣接する視神経乳頭への近さによって識別することができ、5mmの領域です。ガイドとして窩を使用して、6ミリメートル黄斑組織ブロックを切り出すために、フラットマウントされ、人間の目には6ミリメートルの生検パンチを配置します。その上のNSRを削除し、切除した黄斑からRPE細胞を削り取ります。残りのブルッフ膜/脈絡膜複合することができますnは離れて強膜から剥離され、徹底的に溶解超純水に浸漬することにより細胞材料を残り、脈絡膜を除去するための掻き取り。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

ヒトドナー目からブルッフ膜の濃縮

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

enrichment-of-bruch-s-membrane-from-human-donor-eyes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K ビュー.  University of Manchester. Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

ビデオ: Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic age-related macular degeneration (AMD) which represents 90% of the cases. Therapies are needed to slow or retard the development of geographic atrophy (GA), and understanding Bruch&#39;s membrane pathology is part of this process. Alterations in human Bruch&#39;s membrane precede the progression of AMD by contributing to the damage of retinal pigment epithelial (RPE) cells. Given the lack of sufficient animal models to study AMD, ex vivo models of aged human Bruch&#39;s membrane serve as a useful tool to study the behavior of RPE cells from immortalized and primary cell lines as well as RPE lines derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs). Here, we present a detailed method that allows one to determine the effects of RPE cell behavior seeded on harvested human Bruch&#39;s membrane explants from human donors, including attachment, apoptosis and proliferation, ability to phagocytize photoreceptor outer segments, establishment of polarity, and gene expression. This assay provides an ex vivo model of aged Bruch&#39;s membrane to assess the functional characteristics of RPE cells when seeded on aged/compromised extracellular matrix.

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

The goal of this protocol is to demonstrate the culturing of retinal pigment epithelial (RPE) cells on aged and/or diseased human Bruch&#39;s membrane. This method is suitable to study RPE cell behavior on a compromised extracellular matrix.

高齢者人間ブルッフ膜のEx Vivoモデルの網膜色素上皮細胞の培養

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

発生生物学

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニア リング

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately understood, thus impeding the establishment of defined treatments. Cell-based additive gene therapies for the increased expression of a protective factor are considered as a promising option to medicate neurodegenerative diseases, such as age-related macular degeneration (AMD). We have developed a method for the stable expression of the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF), which is characterized as a neuroprotective and anti-angiogenic protein in the nervous system, into the genome of primary human pigment epithelial (PE) cells using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Primary PE cells were isolated from human donor eyes and maintained in culture. After reaching confluence, 1 x 104 cells were suspended in 11 &#181;L of resuspension buffer and combined with 2 &#181;L of a purified solution containing 30 ng of hyperactive SB (SB100X) transposase plasmid and 470 ng of PEDF transposon plasmid. Genetic modification was carried out with a capillary electroporation system using the following parameters: two pulses with a voltage of 1,100 V and a width of 20 ms. Transfected cells were transferred into culture plates containing medium supplemented with fetal bovine serum; antibiotics and antimycotics were added with the first medium exchange. Successful transfection was demonstrated in independently performed experiments. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) showed the increased expression of the PEDF transgene. PEDF secretion was significantly elevated and remained stable, as evaluated by immunoblotting, and quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). SB100X-mediated transfer allowed for a stable PEDF gene integration into the genome of PE cells and ensured the continuous secretion of PEDF, which is critical for the development of a cell-based gene addition therapy to treat AMD or other retinal degenerative diseases. Moreover, analysis of the integration profile of the PEDF transposon into human PE cells indicated an almost random genomic distribution.

We have developed a protocol to transfect primary human pigment epithelial cells by electroporation with the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF) using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Successful transfection was demonstrated by quantitative polymerase chain reaction (qPCR), immunoblotting, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた初代ヒト色素上皮細胞のエレクトロポレーションに基づく遺伝子改変

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

医学

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

新しいヒトの言語性の高いレティナル文化技術の特徴付け

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

ヒト以外の霊長類モデルにおける変性網膜疾患の網膜色素上皮移植

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

AMD研究のためのヒトドナー眼のOCTベースマルチモーダルイメージング

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging could add prognostic value to laboratory findings. In this work, ex vivo OCT and MMI were applied to human donor eyes prior to retinal tissue sectioning. The eyes were recovered from non-diabetic white donors aged &#8805;80 years old, with a death-to-preservation time (DtoP) of &#8804;6 h. The globes were recovered on-site, scored with an 18 mm trephine to facilitate cornea removal, and immersed in buffered 4% paraformaldehyde. Color fundus images were acquired after anterior segment removal with a dissecting scope and an SLR camera using trans-, epi-, and flash illumination at three magnifications. The globes were placed in a buffer within a custom-designed chamber with a 60 diopter lens. They were imaged with spectral domain OCT (30&#176; macula cube, 30 &#181;m spacing, averaging = 25), near-infrared reflectance, 488 nm autofluorescence, and 787 nm autofluorescence. The AMD eyes showed a change in the retinal pigment epithelium (RPE), with drusen or subretinal drusenoid deposits (SDDs), with or without neovascularization, and without evidence of other causes. Between June 2016 and September 2017, 94 right eyes and 90 left eyes were recovered (DtoP: 3.9 &plusmn; 1.0 h). Of the 184 eyes, 40.2% had AMD, including early intermediate (22.8%), atrophic (7.6%), and neovascular (9.8%) AMD, and 39.7% had unremarkable maculas. Drusen, SDDs, hyper-reflective foci, atrophy, and fibrovascular scars were identified using OCT. Artifacts included tissue opacification, detachments (bacillary, retinal, RPE, choroidal), foveal cystic change, an undulating RPE, and mechanical damage. To guide the cryo-sectioning, OCT volumes were used to find the fovea and optic nerve head landmarks and specific pathologies. The ex vivo volumes were registered with the in vivo volumes by selecting the reference function for eye tracking. The ex vivo visibility of the pathology seen in vivo depends on the preservation quality. Within 16 months, 75 rapid DtoP donor eyes at all stages of AMD were recovered and staged using clinical MMI methods.

著者スポットライト:加齢性黄斑変性症の研究のためのヒトドナー眼のEx Vivo OCTベースのマルチモーダルイメージング  

Laboratory assays can leverage prognostic value from the longitudinal optical coherence tomography (OCT)-based multimodal imaging of age-related macular degeneration (AMD). Human donor eyes with and without AMD are imaged using OCT, color, near-infrared reflectance scanning laser ophthalmoscopy, and autofluorescence at two excitation wavelengths prior to tissue sectioning.

エクスビボ 加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のOCTを用いたマルチモーダルイメージング

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...

神経科学

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

地図状委縮の目の大きいモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

生物学

ヒト辺縁ニッチ細胞を分離、培養、および同定するためのプロトコール

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used for LNCs isolation. The tissue was divided into 12 pieces under aseptic conditions and digested for 18 h at 37 &#176;C in the cell culture incubator using collagenase A to obtain cell clusters with LNCs and limbal&#160;epithelial progenitor cells. The cell clusters were further digested for 15 min at 37 &#176;C using 0.25% trypsin-EDTA to obtain single cells and then cultured in modified embryonic stem cell medium (MESCM) on a plastic surface coated with 5% Matrigel. Cells were passaged upon 70% confluence, and LNCs were identified using immunofluorescence, real-time quantitative PCR (qPCR), and flow cytometry. Primary LNCs were isolated and passaged more than 12 times. The proliferation activity of LNCs from P4 to P6 was the highest. LNCs expressed higher stem cell markers than BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR, and PDGFR&#946;). Furthermore, results showed that P4 LNCs uniformly expressed VIM, CD90, CD105, and PDGFR&#946;, but not Pan-CK, which could be used as a marker for the identification of LNCs. Flow cytometric analysis showed that approximately 95%, 97%, 92%, and 11% of LNCs expressed CD73, CD90, CD105, and SCF respectively, while they were&#160;68%, 99%, 20%, and 3% in&#160;BMMSCs. The standard process for LNC&#160;isolation and identification could provide&#160;a reliable laboratory basis for the widespread use of LNCs.

著者スポットライト:広範なLNC研究をサポートするためのLimbal Niche Cell(LNC)の単離と特性評価の標準化(英語) 

Here, we present a protocol to isolate and identify the human limbal niche cells.

辺縁ニッチ細胞の単離と同定

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

ヒトドナー目からブルッフ膜の濃縮

要約

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高齢者人間ブルッフ膜のEx Vivoモデルの網膜色素上皮細胞の培養

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニアリング

眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた初代ヒト色素上皮細胞のエレクトロポレーションに基づく遺伝子改変

新しいヒトの言語性の高いレティナル文化技術の特徴付け

ヒト以外の霊長類モデルにおける変性網膜疾患の網膜色素上皮移植

エクスビボ加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のOCTを用いたマルチモーダルイメージング

エクスビボ加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のOCTを用いたマルチモーダルイメージング

エクスビボ加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のOCTを用いたマルチモーダルイメージング

地図状委縮の目の大きいモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植

辺縁ニッチ細胞の単離と同定

ヒトドナー目からブルッフ膜の濃縮

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高齢者人間ブルッフ膜のEx Vivoモデルの網膜色素上皮細胞の培養

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニア リング

眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた初代ヒト色素上皮細胞のエレクトロポレーションに基づく遺伝子改変

新しいヒトの言語性の高いレティナル文化技術の特徴付け

ヒト以外の霊長類モデルにおける変性網膜疾患の網膜色素上皮移植

エクスビボ 加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のOCTを用いたマルチモーダルイメージング

エクスビボ 加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のOCTを用いたマルチモーダルイメージング

エクスビボ 加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のOCTを用いたマルチモーダルイメージング

地図状委縮の目の大きいモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植

辺縁ニッチ細胞の単離と同定

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニアリング

エクスビボ加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のOCTを用いたマルチモーダルイメージング

エクスビボ加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のOCTを用いたマルチモーダルイメージング

エクスビボ加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のOCTを用いたマルチモーダルイメージング