We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).

<ol>
	<li>Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins+in+bacteria+and+eukaryotes:+evolutionary+conservation+and+divergence.">Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).</li><li>Ricci, D. P., Silhavy, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bam+machine:+A+molecular+cooper.">The Bam machine: A molecular cooper.</a> Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).</li><li>Hagan, C. L., Silhavy, T. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex.">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li><li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+(SONICC).">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

βバレルのOMPは、グラム陰性菌、ミトコンドリアと葉緑体中で重要な役割を果たし、これらのそれぞれの細胞小器官の外膜に不可欠な分子メカニズムに関する豊富な情報を提供する構造解析のための重要な標的です。しかし、構造分析のための十分なサンプルを生成することは必ずしも簡単ではないので、一般的なパイプラインを詳細に結晶に構築物からの処理を説明するための、構造決意に対する目標βバレルのOMPの十分な量の生産のために提示されています。これらのプロトコルは、テストの結果、グラム陰性菌から、ほとんどのOMPのために働くことが判明しているが、それには限界が発現および精製のための他の方法が必要になる場合があり、特にミトコンドリアと葉緑体のためのいくつかのターゲットは、ありますがあります。このように、ここでの方法は、ほとんどのグラム陰性細菌からのOMPを伴うプロジェクト、まだ発現レベルのために適用可能であるべきです精製試料の量は、ターゲットOMPに依存して変化します。 構造研究のためのβバレルのOMPの発現のために、2つの一般的なアプローチ、（1）in vivo発現は、外膜とのin vitroリフォールディングのための封入体への（2）式に直接あります。 in vivo発現のアプローチについては、βバレルのOMPは、Eの外膜を標的とします彼らはネイティブに折り畳まれ、膜から直接単離されている大腸菌 。目標が適切に折り畳まれる可能性が高いので、膜への発現が好ましいアプローチです。このアプローチは、通常、全体のタンパク質の低いレベルをもたらすが、それは時々 、in vitroでのリフォールディングに関連する合併症を回避することができます。多くのβバレルのOMPが正常構造の決意4,5,11のために、この方法で表現されています。成功は、しばしば促進T7から低レベルの構成的発現に依存しているシステムを使用して達成されますRが、発現のための誘導に依存している他のシステム（ すなわち、IPTG、アラビノース）も、日常的に成功を収めて使用されています。 直接外膜に発現がペリプラズムに新生βバレルOMPの分泌のために、秒のトランスロコンにリボソーム - 新生鎖複合体を導くN末端シグナル配列を有するように標的タンパク質を必要とします。シグナル配列は内膜のペリプラズム側で切断されるので、シグナル配列は、任意のN末端タグをターゲットに追加先行することが重要です。新生βバレルOMPは、その後、外膜2,3に挿入するためのBAM複合体にペリプラズムを通じてシャペロンに護衛されています。 膜中に過剰発現させることができないターゲットの場合、別のアプローチは、in vitroで 28から30をリフォールディングするための封入体への発現です。このアプローチは、一般的に高レベルと強い発現のOになります標的タンパク質F。リフォールディングは、非効率的であることができるしかし、リフォールディング条件を同定するために挑戦することができます。ターゲットβバレルOMPが正しく折り畳まれたときに加えて、アッセイに困難な場合があります。それでも、成功したのOmpA 31、Ailの19、のOmpF 32、およびVDAC 33を含む構造研究のためにリフォールディングされたタンパク質の多くの例があります。 （ネイティブまたは封入体の中に）すべてで発現するかまたは発現するが、膜（ネイティブ）に正しく組み立てられていないされていないクローンの場合、1は、より密接Eのことを似せ ​​てβバレルを突然変異試みることができます大腸菌 34,35。バレルドメインのβ-信号中のアミノ酸配列は、著しく目標βバレルOMP 11,34の両方の適切な生合成および発現レベルに影響を与えることができるβ-シグナル配列でBAM錯体及び変動による認識およびアセンブリのために重要です、35。 β-Barrの目標を適切に統合エルOMPは膜分画および熱修正可能アッセイ続い洗剤抽出性についてスクリーニングすることによってモニターすることができます。 界面活性剤ミセルの存在下での膜タンパク質の結晶化は最も古い技術であり、従来の可溶性タンパク質の結晶化装置と戦略を簡単に適応することができます。界面活性剤分子と膜埋め込 ​​み領域をマスクすることにより、タンパク質は可溶性タンパク質（ 例えば、結晶化母液と混合し、タンパク質液滴の遅い脱水を引き起こす蒸気拡散装置で囲まれた）と同様に処理することができる濃縮しました。コンセプトはシンプルながら、洗剤の特徴および特性は、通常の結晶化の課題の上に複雑の重要な層を追加します。具体的には、界面活性剤の分子の文字は、経験的にミセルのサイズ、ヘッド基の極性（アニオン性、カチオン性、非イオン性、または含む所与の標的タンパク質に合わせて調整されなければなりません両性イオン性）、炭化水素鎖の長さ、これらの各々は、溶液中の標的膜蛋白質の安定性に影響します。このアプローチの欠点は、非ネイティブの化学的環境、結晶の接点を形成することができる表面領域の潜在的な隠蔽、および界面活性剤濃度の問題があります。 バイセルは、細胞36,37に見られる膜に似た二層構造を模倣する個々の粒子に集合脂質および両親媒性物質（ 例えば、界面活性剤または短鎖脂質）の混合物です。両親媒性物質マスクそれは界面活性剤結晶化ミセルと同様に、その縁部に露出され、この二重層の疎水性コア。これは、標的タンパク質の安定化を助けるために、よりネイティブのような環境を提供します。 膜タンパク質の標的もまた、脂質立方相（LCP）法38を用いて結晶化することができます。 LCPはで、脂質と水との混合により形成された中間相であります連続的な二重層は、溶媒チャンネルの二つの非交差ネットワークが浸透しています。この三次元構造は、主に天然様環境における脂質埋め込まれた膜タンパク質の拡散を可能にし、結晶接触がタンパク質の疎水性および親水性表面の間に形成することができ、それらの順序を高めながら、結晶の全体的な溶媒含量を減少させます。 1990年代に導入されて以来、LCP技術は39,40とのGPCR 41-43をロドプシンなど、多くのとらえどころのない膜タンパク質標的の構造を決定する上で非常に重要となっています。ハイスループットスクリーニングにおけるLCPの使用は、従来のナノリットルの液体処理によって処理することはできません一般的にLCPのために使用される厚さのモノオレインのような特別な規定（ すなわち、LCP固有のロボット、ガスタイトシリンジ、LCP調剤ツール、サンドイッチ結晶化プレートなど）が必要ですロボット。 ゲル濾過クロマトグラフィーは、非常に重要なステップであります一般に、膜タンパク質の結晶化のためには、選択された界面活性剤を安定化することはクロマトグラムによって可視化することができる膜タンパク質ターゲット、のためのものである方法に関する情報が得られるからです。空隙容量、保持時間、およびピークの形状に試料の量を比較することにより、サンプルの全体的な安定性、単分散性にアクセスすることができます。理想的なサンプルは、ボイドボリュームで失われていないサンプルと非常に少ないだろうとガウス分布を持つ単一の対称溶出ピークを持っているでしょう。洗剤C 8 E 4（0.8％）、OG（1.0％）、およびLDAO（0.05％）が日常的に成功を収めβバレルのOMPの結晶化に使用されて開始するには良いものですされています。理想的には、小規模の実験は、結晶化のために最も適切であるかを決定するために界面活性剤のいくつかの界面活性剤またはそれらの混合物の比較が行われます。最も安定であることが判明しているものは、その後、β-BA標的の大規模調製のために使用されますrrelのOMPと結晶化試験のために。 結晶をターゲットβバレルOMP、リード最適化で形成された後（ すなわち、添加剤スクリーニングは、クライオスクリーニング、洗剤添加スクリーニングなど ）および可溶性タンパク質標的と同様の他の技術は、いくつかの違いを用いて追跡することができます。しかし、膜タンパク質を操作するときに非常に便利ですいくつかの最近の進歩があります。具体的には、膜タンパク質の結晶は、多くの場合、様々な理由のために彼らの母液内で検出することが難しいことができます。膜タンパク質は、多くの場合、比較的小さな結晶を形成し、偽陽性は、結晶の最適化を誤った方向に行くことができます。 LCPの特に技術に存在する追加の課題は、結晶が成長する高粘性、多くの場合、不透明な環境を与えられました。これらの問題に対処するための戦略は、天然蛍光タンパク質結晶を区別Fできるように、光顕微鏡と組み合わせて紫外線顕微鏡（UV）の使用を含みますROMには、非蛍光性の塩および界面活性剤結晶（ 図7）。課題は、沈殿剤の分野内で形成タンパク質結晶の陽性同定に、しかし、残っています。フェムト秒の走査レーザーパルスによって撮像されたときSONICC技術44によって実装される結晶はまた、大部分のキラル結晶の周波数倍増効果を利用することによって検出することができます。この高解像度、高コントラスト技術は、条件を不明瞭からサブミクロンの結晶を区別するために使用することができます。 収穫膜タンパク質は、特に界面活性剤とバイセルの結晶化のため、標準的な結晶化技術を用いて行われます。ループは、低倍率顕微鏡と結晶取り付けループ（ すなわち、ナイロン繊維、ワイヤ、またはポリマー）を用いて手で行われます。 βバレルOMP結晶を採取する際に前の極低温液体で凍結急落する過剰な溶媒および凍結保護のウィッキングすることも、標準的な手順です。しかし、収穫LCP成長した結晶のingは結晶がアクセスすることは困難であるとして、サンドイッチプレートから直接採取し、簡単に顕微鏡で観察されないことがあります場合は特に、特定の問題を提示します。 LCP混合物を簡単にループ内で分離することができないため、また、LCPに成長した結晶は時々大量に収穫されなければなりません。 βバレルのOMPのためのデータ収集はわずか数その他の事項も考慮した可溶性タンパク質の結晶を有するように行うことができます。洗剤とバイセル方法によって成長した結晶の大きさは、多くの場合、可溶性タンパク質を用いて成長させたものと同等であるが、LCP法により成長した結晶は、ほとんど有意に小さいです。 LCPマトリクスから採取試料がしばしば観察することが困難である複数の結晶を含むために加えて、1体系diffraに基づく結晶の位置を特定するために、ループ全体をスキャンすることができ、ミニビームとループラスター能力を有するシンクロトロン源を利用する必要がありますction（ 図7）。 LCP結晶の小さなサイズは、放射線損傷にそれらを特に受けやすくなります。従って、複数の結晶からのデータは、多くの場合、完全なデータセットを収集するためにマージされます。 一度十分に回折する結晶が得られ、完全なデータセットが収集され、βバレルのOMPのための構造の決意は、膜タンパク質の結晶は、一般に、より高い溶媒含有量を示すことを念頭において、可溶性タンパク質の場合と同じ手順を用いて達成することができます。すべての結晶学の目標と同じように、可溶性タンパク質または膜タンパク質かどうか、それぞれが独自の課題を提供していますし、その理由のために単一のパイプラインは、直接すべてのターゲットに適用することはできません。したがって、それは彼/彼女のプロジェクトの成功を確実にするために、それに応じてこれらの一般的なプロトコルを調整するための主要研究者（複数可）の仕事です。

βバレルのOMPは、ミトコンドリア、葉緑体、およびグラム陰性菌1-3の外膜で見つけることができます。彼らはαヘリックスタンパク質と同様の役割を果たしているが、彼らはそれぞれの鎖が密接に隣接する二つの鎖に接続されて8月26日、反平行のβ鎖に至るまで中央の膜に埋め込まれたβバレルドメインからなる非常に異なる倍を持っています（ 図1及び2）。 βバレルドメインの最初と最後のストランドは、その後、周囲の膜からβバレルドメインを閉じて密封するために、（ミトコンドリアVDACを除く）反平行にほぼ独占的に、互いに相互作用します。すべてのβバレルのOMPは、これらのループは、時々そのようなプロ結合ナイセリアトランスフェリンにおいて見出されるような75残基と同じ大きさで、リガンド相互作用および/またはタンパク質 - タンパク質接触に重要な役割を果たして変化配列および長さの細胞外ループを有しますテインA（のTbpA）4。 βバレルのOMPは、タンパク質の機能的な目的（ 例えば、バマ5-7、FimD 8,9、ファドル10）のような追加のドメインを果たすN末端 ​​またはC末端ペリプラズム拡張機能をも持つことができます。 βバレルのOMPの多くの種類が11存在するが、より一般的なタイプの2は、フィールド、（1）TonB依存トランスポーター及び（2）オートトランスポーターとあまり慣れているため、例として、以下に記載されています。 TonB依存トランスポーター（ 例えば、FEPA、のTbpA、のbtuB、Cirの、 など ） は 、栄養のインポートのために不可欠であり、C末端の22本鎖β-内側に隠れて発見された〜150残基からなるN末端 ​​プラグドメインを含みますバレルドメインは、外膜12（ 図3）の中に埋め込 ​​まれました。このプラグインのドメインを自由にバレルドメインを通過する基板を防ぎながら、基質結合は、プラグドメイン番目の内のコンホメーション変化を誘導しますリードで（プラグ転位によって、またはプラグの部分的/完全な排出のいずれかによって）、その後ペリプラズムに外膜を横切って基板搬送を容易にすることができる形成を細孔します。 TonB依存のトランスポーターは、直接ヒト宿主タンパク質4,13,14から鉄などの栄養素をハイジャック特殊なトランスポーターを進化させてきたような髄膜炎菌などのグラム陰性菌のいくつかの病原性株の生存のために特に重要です。 オートトランスポーターは、グラム陰性菌のV型分泌系に属し、βバレルドメインからなるβバレルのOMP（ESTA及びESPPと同様に、通常、12ストランド）とで分泌または提示されているいずれかのパッセンジャードメインですセル15,16（ 図3）の表面。これらのβバレルのOMPは、多くの場合、サービングパッセンジャードメインと細胞の生存と病原性において重要な役割を果たしいずれかのプロテアーゼ、付着、および/または他のEFなどfectorそれは病因を媒介します。 このようなX線結晶学、NMR分光法、および電子顕微鏡（EM）、私たちは順番に、それらは、外膜内で機能する方法を正確に解読するために使用することができ、原子分解能でのOMPのためのモデルを決定することを可能にするような構造の方法。該当する場合は、この貴重な情報は、薬物およびワクチンの開発のために使用することができます。例えば、トランスフェリン結合タンパク質A（のTbpA）はナイセリアの表面上に見出され、それが直接ヒトトランスフェリンを結合し、その後抽出し、自身の生存のために鉄をインポートするため、病原性のために必要とされます。 TbpAがなければ、 ナイセリアはヒト宿主から鉄を除去することができず、非病原性にされます。 TbpA 4に結合したヒトトランスフェリンの結晶構造が解明された後、それは2つのタンパク質が関連するどのくらい鮮明になった、のTbpAのどの領域が相互作用を媒介、のTbpAによって鉄抽出のための重要な何であったか残基、およびどのように1はのTbpAを標的ナイセリアに対する治療薬を開発する可能性があります。したがって、生存と病原性グラム陰性細菌中のβバレルのOMPの重要性を与えられただけでなく、ミトコンドリアと葉緑体機能、および追加の構造膜タンパク質のこのユニークなクラスに関する情報とそれらが機能するシステムの必要性、一般的なプロトコルは、構造的な方法によって特徴づけのために高レベルでターゲットのOMPを発現させ、精製の全体的な目標が提示されています。

<table><tbody><tr><td>Crystallization Robot</td><td>TTP Labtech, Art Robbins</td><td>-</td><td>Any should work here, except for LCP crystallization</td></tr><tr><td>PCR thermocycler</td><td>Eppendorf, BioRad</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Media Shaker</td><td>New Brunswick, Infors HT</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>UV-vis spectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE apparatus</td><td>BioRad</td><td>1645050, 1658005</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE and native gels</td><td>BioRad, Life Technologies</td><td>4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)</td><td></td></tr><tr><td>AkTA Prime</td><td>GE Healthcare</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>AkTA Purifier</td><td>GE Healthcare</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (low-medium speed)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge (high speed)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>SS34 rotor</td><td>Sorvall</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Type 45 Ti rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Type 70 Ti rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homogenizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>06 435C</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex</td><td>Avestin</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing</td><td>Sigma</td><td>D9652</td><td></td></tr><tr><td>LCP tools</td><td>Hamilton, TTP Labtech</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>VDX 24 well plates</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>Sandwich plates</td><td>Hampton Research, Molecular Dimensions</td><td>HR3-151, MD11-50 (MD11-53)</td><td></td></tr><tr><td>Grace Crystallization sheets</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>875238</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep S300 HR column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1167-01</td><td></td></tr><tr><td>Q-Sepharose column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td></td></tr><tr><td>Crystallization screens</td><td>Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Gas-tight syringe (100 ml)</td><td>Hamilton&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

from constructs to crystals &#8211; towards structure determination of &#946;-barrel outer membrane proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

YiuRはペスト菌に対する推定上のワクチンの標的であるTonB依存鉄トランスポーターである。これは、本来、マイクロアレイアッセイを用いて同定しました。ここでは、X線結晶学を用いYiuRの構造を決定するために取られたステップは（ 図9）に概説されています。クローニングのため、YiuRのDNA配列（マイナスN末端シグナル配列）PCRは、ゲノムDNAから増幅し、N末端pelBシグナル配列およびTEVプロテアーゼ部位、続いて10×ヒスチジンアフィニティータグを含むベクターにサブクローニングしました。発現のために、YiuR含有プラスミド〜0.5 600 ODするBL21（DE3）コンピテント細胞を、5mlのスターター培養物を成長させるために使用される単一のコロニーを形質転換しました。 TB培地750 mlを含む十二のフラスコは、次に、スターター培養物1mlを接種し、20ºC（220 rpmで振盪しながら）で3日間増殖させました。次いで、細胞を、約150〜200を生成し、回収しましたフラッシュた全細胞ペーストgを、液体窒素で冷却し、使用するまで-80ºCで保存しました。 YiuRの精製の ​​ために、細胞を20 gの（1.8mMのKH 2 PO 4、2.7 mMの塩化カリウム、137mMの塩化ナトリウム、pH7.4中の10mMのNa 2 HPO 4）、DNアーゼIを用いて、室温で攪拌し、1×PBS 120mlに再懸濁しましたそして、AEBSFが追加されています。溶解は、ホモジナイザーを2回通過することにより行いました。次いで、溶解物を、（破壊されていない細胞と封入体をスピンダウンする）10分間12,000×gで遠心分離しました。上清を膜画分（YiuR）を含有するペレットで、60分間、235,000×gで再度遠心分離しました。次いで、膜をダウンスホモジナイザーを用いて1×PBS 100mlに再懸濁しました。 YiuRは4ºCで（16時間まで）一晩攪拌し、5％の最終濃度でElugentを使用して膜から抽出/可溶化しました。可溶化した膜は、その後suコマンドで、60分間、371000×gで再び遠心分離しましたYiuRを含む可溶化画分を含むpernatant。 YiuRを単離するために、IMACは、緩衝液A（1×PBS、0.1％DDM）及び緩衝液B（1×PBS、1 Mイミダゾール、0.1％DDM）、30~50ミリモルのイミダゾール濃度で洗浄し、250〜500 mMので溶出を使用して行きました。 N末端 ​​の10倍-ヒスチジンタグを削除するには、TEVとのインキュベーションは、HISプロテアーゼは、1×PBS緩衝液で透析中に4ºCで一晩行いました。次いで、試料を濃縮し、透析を介して、再度IMACカラムに流れを通過し、その後、50mMのトリス-HCl、pH7.5中のイオン交換カラム上で0〜1.0M NaCl勾配を用いてさらに分離しました。 YiuRを含有する画分を濃縮し、プールし、25mMのトリス-HCl、pH7.5で、200mMのNaCl、および0.05％のLDAOを用いたゲル濾過カラム上で実行しました。 YiuRを含有する画分をプールし、結晶化のためミリリットルの10mg /まで濃縮しました。 ブロードマトリックススクリーニングを実施したとの条件が決定しますそれは、いくつかの初期の回折結晶を生成しました。さらなる最適化は、天然のX線回折データを収集するために使用されたより大きな結晶をもたらしました。 図8に示された結晶は1つがここに提示される方法を用いて達成することができる結晶の代表的なものです。洗剤のスクリーニングおよびバイセルからの結晶は、通常、可溶性タンパク質のために得られた結晶の大きさであってもよいです。しかし、LCPからのものは、ほとんどの場合、はるかに小さいです。データは2.65Å分解能に決意を構築するために導いた分子置換に使用されるのに十分に良好でした。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig1.jpg" /> 図1. 完全に統合された膜タンパク質の2つのタイプは、αヘリックスとβバレルです 。 β2アドレナリン受容体（PDBコード2RH1、αヘリックス）およびTonB依存トランスポーターのbtuB（PDBコード1NQE、とそれぞれの例は、ここに示しますβバレル）。一番下の行は、膜の図を示しながら、一番上の行には、細胞外の図を示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig2.jpg" /> 図2β バレルのOMPは、多くの異なる機能を提供し、多様な構造を有することができます 。 αヘリックス膜タンパク質は、1つ以上の膜貫通ドメインを含めることができますが、βバレルのOMPは、8月26日ストランドの範囲と各鎖は密接に隣接鎖と相互作用します。溶媒と相互作用する内部残基は、典型的には、極性および親水性であるが、膜と相互作用する外側の残基は、典型的には疎水性です。一番上の行は、細胞外図を示し、中段は、膜の図を示し、下段はperiplasmiを示しCビュー。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig3.jpg" /> 共通のβバレルのOMPの2つのタイプの 3 例を 図 。左、TonB依存トランスポーターFEPA（PDBコード1FEP）の構造、細胞外（上）を示す、膜（中央）とペリプラズム（下）の景色。プラグドメインはマゼンタであり、一方βバレルドメインは緑色で示されています。右、オートトランスポーターESTA（PDBコード3KVN）の構造、細胞外（上）を示す、膜（中央）とペリプラズム（下）の景色。パッセンジャードメインは青色である間にβバレルドメインは金に示されている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig3large.jpg" target="_blank">より大きなversiを表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図の上。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig4.jpg" /> βバレルのOMPの生産のためのクローニングおよび発現のパイプラインの 図4 の回路図。リフォールディングのための封入体の中にネイティブの膜発現（左）または式いずれかによって、ターゲットOMPのクローンを作成し、表現するために使用されるパイプラインの回路図（右）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig4large.jpg" target="_blank">してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig5.jpg" /> βバレルのOMPの単離のための精製、パイプラインの 図5 の回路図。OMに直接発現されているのOMPの抽出に使用されるパイプラインの模式図。ここでは、ターゲットOMPは、抽出物である必要があります適切な洗剤で可溶化により膜から編、次にIMAC、イオン交換クロマトグラフィー、およびゲル濾過により精製した。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig6.jpg" /> βバレルのOMPの結晶を成長させるための結晶化のパイプラインの 図6 の回路図。3つの方法がβバレルのOMPの結晶化のために利用することができます 洗剤スクリーニング、バイセル、および脂質立方相（LCP）を含む。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig7.jpg" /&gt; 図 大幅βバレルのOMPの決意を構築するために貢献してきた結晶7.新しいツール 。例としては、キラル結晶（SONICC）視覚化（C）、ロボットパック/ロボット（D）の結晶化ロボット/ LCPロボット（A）、UV顕微鏡（B）、二次非線形イメージング、ラスタ/ベクタ/ヘリカルデータ収集方法（Eを含みます）、およびマイクロフォーカスビーム（F）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig8.jpg" /> プロトコルから得られた結晶の 図8. 代表的イメージが。洗剤スクリーニングおよびバイセルからの結晶は、結晶の大きさであってもよいです通常、可溶性タンパク質に対して得られました。しかし、LCPからのものは、ほとんどの場合、はるかに小さいです。スケールバー=100μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/53245/53245fig9.jpg" /> 、急行クローン、精製、結晶化、および構造を解明するための手順を示す、 ペスト菌 。YiuRの構造決意のために使用される全体的なパイプラインから推定されるワクチンターゲットYiuRための決意を構造化する結晶に構築物から 図9。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53245/53245fig9large.jpg" target="_blank">クリックしてください。ここで、この図の拡大版を表示します。</a>

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コンストラクトから結晶へ β バレル β バレル外膜タンパク質の構造決定に向けて |化学 |ビデオ

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

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13.4K ビュー.  Purdue University. β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

ビデオ: From Constructs to Crystals – Towards Structure Determination of β-barrel Outer Membrane Proteins

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

生化学

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

免疫・感染学

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Germinosomes と枯草菌胞子の内部の膜の可視化

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

生物工学

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to assess the purity of the bilayers. The OM has an increased overall density compared to the inner membrane, largely due to the presence of lipooligosaccharides (LOS) and lipopolysaccharides (LPS) within the outer leaflet. LOS and LPS molecules are amphipathic glycolipids that have a similar structure, which consists of a lipid-A disaccharolipid and core-oligosaccharide substituent. However, only LPS molecules are decorated with a third subunit known as the O-polysaccharide, or O-antigen. The type and amount of glycolipids present will impact an organism&#8217;s OM density. Therefore, we tested whether the membranes of bacteria with varied glycolipid content could be similarly isolated using our technique. For the LPS-producing organisms, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Escherichia coli, the membranes were easily isolated and the LPS O-antigen moiety did not impact bilayer partitioning. Acinetobacter baumannii produces LOS molecules, which have a similar mass to O-antigen deficient LPS molecules; however, the membranes of these microbes could not initially be separated. We reasoned that the OM of A. baumannii was less dense than that of Enterobacteriaceae, so the sucrose gradient was adjusted and the membranes were isolated. The technique can therefore be adapted and modified for use with other organisms.

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Gram-negative bacteria produce two spatially segregated membranes. The outer membrane is partitioned from the inner membrane by a periplasm and a peptidoglycan layer. The ability to isolate the dual bilayers of these microbes has been critical for understanding their physiology and pathogenesis.

アシネトバクターバウマンニの技術的調整によるグラム陰性細菌の細胞エンベロープの内膜および外膜分画への分離

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to ...

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and tumor development. The hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitution from different species can be stabilized in vitro. This is a feasible means to study MHC I of mammals, when the homologous &#946;2m is not available. Meanwhile, it is indicated that mammalian &#946;2m substitution does not significantly affect peptide presentation. However, there is limited summarization regarding the methodology and the technology for the hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m). Herein, methods to evaluate the feasibility of heterologous &#946;2m substitution in MHC I study are presented. These methods include preparation of expression constructs; purification of inclusion bodies and refolding of the MHC complex; determination of protein thermostability; crystal screening and structure determination. This study provides a recommendation for understanding function and structure of MHC I, and is also significant for T cell response evaluation during infectious disease and tumor immunotherapy.

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &#946;2-Microglobulin

The protocol describes experimental methods to obtain stable major histocompatibility complex (MHC) class I through potential &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitutions from different species. The structural comparison of MHC I stabilized by homologous and heterologous &#946;2m were investigated.

異種β 2-ミクログロブリンを有するコウモリ主要組織適合性複合体クラスIの安定性と構造

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

生物学

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

巨大リポソームの膜カーボンナノ チューブを引っ張ってください。

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Multi-pass Transmembrane Proteins and &#946;-barrels

In multi-pass transmembrane proteins, the polypeptide chain crosses the membrane more than once. The transmembrane polypeptide chain either forms an &#945;-helix or &#946;-strand structure. &#945;-Helix containing multi-pass transmembrane proteins are ubiquitous, whereas &#946;-strand&#160;containing ones are mainly found in gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts.
&#945;-Helix containing multi-pass transmembrane proteins 
Multi-pass transmembrane proteins such as G-protein-linked receptors (GPCRs) and bacteriorhodopsin contain multiple transmembrane domains. All GPCRs have seven transmembrane &#945;-helices, but each receptor has its specific extracellular domain and G-protein-binding site. GPCRs bind a ligand and activate membrane protein called G-protein. The activated G-protein then interacts with either an ion channel or an enzyme in the membrane.
Bacteriorhodopsin found in certain photosynthetic bacteria has seven transmembrane &#945;-helices. It is a light-driven proton pump that helps in ATP production by generating a proton gradient across the membrane.
&#946;-Strands containing multi-pass transmembrane proteins 
Some bacterial membrane proteins contain transmembrane &#946;-strands, which are arranged into a ring-like structure called the &#946;-barrel. A minimum of eight &#946;-strands are required to form the barrel-like structure where the edges of the two closely spaced &#946;-strands form hydrogen bonds together. The porin protein observed in the membrane of some gram-negative bacteria contains a transmembrane &#946;-barrel. Apart from bacteria, porin proteins are also found in mitochondrial and chloroplast membranes, which support the hypothesis that both mitochondria and chloroplast are evolved from prokaryotes.
Some part of this text is adapted from Openstax, Biology 2e, <a href="https://openstax.org/books/biology-2e/pages/9-1-signaling-molecules-and-cellular-receptors">Section 9.1: Signaling Molecules and Cellular Receptors</a>.

Multi-pass Transmembrane Proteins and &amp;#946;-barrels

マルチパス膜貫通タンパク質およびβバレル

In multi-pass transmembrane proteins, the polypeptide chain crosses the membrane more than once. The transmembrane polypeptide chain either forms an ...

細胞生物学

ユニット １

膜の構造と成分

KEY TERMS AND CONCEPTS

Structure of Porins

Mitochondria, chloroplasts, and gram-negative bacteria have transmembrane, beta-barrel proteins called porins to mediate the free diffusion of ions and metabolites across the membrane. Mitochondrial porin precursors contain conserved amino acid sequences called beta signals at their C-terminal. Beta signals have a&#160; motif of PoXGXXHyXHy (Po-Polar, X-Any amino acid, G-Glycine, Hy-LargeHydrophobic), which are crucial for precursor recognition to initiate precursor assembly. Beta-barrel precursors move through the TOM complex on the outer mitochondrial membrane into the intermembrane space. The precursors interact with TIM chaperones inside the intermembrane space and are guided to a trimeric complex called the Sorting and Assembly machinery complex or SAM complex.&#160;
SAM complex has three components: a beta-barrel core called the SAM50 and accessory proteins SAM35 and SAM37. SAM50 comprises 16-beta-strands that span the outer membrane and expose an N-terminal polypeptide transport-associated domain or POTRA domain in the intermembrane space. The POTRA domain functions as a receptor for beta-barrel precursors and facilitates beta-strand assembly. In contrast, SAM50 interacts closely with accessory proteins SAM35/SAM37 towards the cytosolic side to help fold the beta-barrel precursors entering the intermembrane space.

ポリンズの構造

Mitochondria, chloroplasts, and gram-negative bacteria have transmembrane, beta-barrel proteins called porins to mediate the free diffusion of ions and ...

βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ

要約

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透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

Germinosomes と枯草菌胞子の内部の膜の可視化

アシネトバクターバウマンニの技術的調整によるグラム陰性細菌の細胞エンベロープの内膜および外膜分画への分離

異種_{β 2-}ミクログロブリンを有するコウモリ主要組織適合性複合体クラスIの安定性と構造

蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）

巨大リポソームの膜カーボンナノチューブを引っ張ってください。

マルチパス膜貫通タンパク質およびβバレル

ポリンズの構造

βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ

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透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

Germinosomes と枯草菌胞子の内部の膜の可視化

アシネトバクターバウマンニの技術的調整によるグラム陰性細菌の細胞エンベロープの内膜および外膜分画への分離

異種β 2-ミクログロブリンを有するコウモリ主要組織適合性複合体クラスIの安定性と構造

蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）

巨大リポソームの膜カーボンナノ チューブを引っ張ってください。

マルチパス膜貫通タンパク質およびβバレル

ポリンズの構造

異種_{β 2-}ミクログロブリンを有するコウモリ主要組織適合性複合体クラスIの安定性と構造

巨大リポソームの膜カーボンナノチューブを引っ張ってください。