The authors thank Dara Frank and Carrie Harwood for their generous contribution of strains. University of Wisconsin Milwaukee Research Foundation holds patent no. 8,354,451; with claims broadly directed to treating or inhibiting the progression of infection of a microorganism in a patient by administering a 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase-inhibiting compound such as 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). Inventors are Graham Moran and Pang He. This research was supported by the National Institutes of Health (R00-GM083147). The University of Washington P. aeruginosa transposon mutant library is supported by NIH P30 DK089507.

培養培地、抗生物質の調製、及び2- [2-ニトロ-4-（トリフルオロメチル）ベンゾイル] -1,3-シクロヘキサンジオン（NTBC） <ol><li>適切なボリュームにLBブロス（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、H 2 O中 0.25％のNaCl）、アリコートを行います。オートクレーブにより滅菌します。室温で保管してください。 </li><li> 250 mlのフラスコに100 mlのLB寒天培地（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、0.25％のNaCl、H 2 O中の1.5％寒天）を作ります。室温でオートクレーブとストアによって滅菌します。寒天プレートに注ぐ前に溶けていることを確認します。 注：LB寒天100mlを含有するフラスコを4板が得られます。 LB寒天培地の量は、アッセイに必要なプレートの数に対応するように変更することができます。 </li><li> PBS（137mMの塩化ナトリウム、2.7のKCl、10mMのの Na 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4）16ください。室温でオートクレーブまたは濾過し、ストアによって滅菌します。 </li><li>ゲンタマイシンのための抗生物質のストック溶液を準備し、カナマイシン、Dトブラマイシン。 <ol><li> Pの適切な抗生物質ストック濃度を準備100 mg / mlのゲンタマイシン、30 mg / mlのカナマイシン、および10mg / mlのトブラマイシンを含む緑膿菌菌株 。 4℃の水、フィルター滅菌し（0.2ミクロン）、および店舗での抗生物質を溶解します。研究細菌に応じて抗生物質および濃度を変更します。 </li></ol></li><li> NTBCストック溶液を準備します。 DMSOの400μlのNTBC 10mgを溶解します。これは、75.9 mMのNTBCの濃度が得られます。 -20℃で保存NTBC原液。必要に応じて室温でソリューションを解凍します。 注：NTBCの異なるソースは、溶解度の差があります。メーカーの推奨に基づいて、NTBCを溶解し、それに応じてステップ1.5を調整するためにする適切な車両を決定します。 </li></ol>細菌株の2 NTBC滴定<ol><li>テストされる株の一晩培養を設定します。 16×150 mmの試験管に2 mlのLBブロスを加えますS（1株あたり1）と、各株から1に単離したコロニーを接種します。空気インキュベーター中で組織培養回転子に通気しながら37℃で一晩インキュベートします。 </li><li>次の日は、LBブロス中でNTBCの滴定を準備します。異なる株がNTBCに対する感受性の違いを持っ​​ているので、0から900μMNTBCの初期範囲を使用してください。 <ol><li> 1株あたり4〜5本の試験管（16×150ミリメートル）に1ミリリットルのLBブロスを追加します。 </li><li>濃度の範囲内で試験管（16×150ミリメートル）にNTBC原液（75.9 mm）を追加します。 LBブロスの1mlに追加するには、NTBCの濃度とそれに対応する株式ボリュームについては、表1を参照してください。 </li></ol></li><li>一晩培養物のOD 600を測定します。培地中に存在pyomelanin排除するためにOD 600読み取りを行う前に、文化を洗ってください。 <ol><li> 2分間16,000×gで微量に1mlの培養物を遠心分離することによって培養液を洗います。上清を除去し、持つ任意の緩くペレット化した細胞ピペットとは、1ミリリットルのLB固体細胞ペレットを再懸濁</li></ol></li><li> OD 600 0.05で滴定チューブを接種します。チューブに接種するために必要な洗浄文化の量を計算します。 注：pyomelaninが存在してはならないので、予防接種のための洗浄の文化を使用してください。 </li><li>空気インキュベーター中で組織培養回転子を用いて通気しながら37℃で約24時間滴定チューブをインキュベートします。 </li><li>滴定チューブを撮影し、MICおよび酸化ストレスアッセイのために使用するNTBCの量を決定するために、内および系統間で色素産生を比較します。無細胞培養上清中pyomelaninの量を決定し、細胞密度を決定するために、OD 600測定値を使用します。 注：細胞の培養上清中のpyomelaninのOD 600比は、NTBCで処理した後pyomelanin生産の違いを定量化するために計算することができます。 </li></ol> 3.抗生物質の最小Inhibi96ウェルプレートでトリー濃度（MIC）アッセイ<ol><li>し、NTBCないLBにテストされる株の一晩培養を設定します。 注：このプロトコルは、300μMのNTBCの代表レベルを用いて説明します。使用されるNTBCの適切なレベルは、ステップ2.6で決定されます。 <ol><li> 2ミリリットルのLBに300μMのNTBCを追加無NTBC条件の2ミリリットルのLBにビヒクル（DMSO）の同等のボリュームを追加します。 </li><li>滅菌爪楊枝を使用して、細菌のつの単離されたコロニーをチューブに接種。 NTBCと1つの培養し、各株についてNTBCせずに1つの培養があります。空気インキュベーター中で組織培養回転子を用いて通気しながら37℃で一晩インキュベートします。 </li></ol></li><li>次の日、MICアッセイを設定するためのLB + NTBCし、LB + DMSOマスターソリューションを作ります。接種物は、300μMの最終濃度を得、追加されたときに、これは2倍に希釈されるように、600μMの濃度でNTBCを追加します。 <ol><li> 1 antibiをテストするには1株について、耳、2ミリリットルのLBに600μMのNTBCを追加し、NTBCマスター溶液を作製するために混ぜます。 2ミリリットルのLBにビヒクル（DMSO）の等量を追加し、何のNTBCマスター溶液を作成しないように混ぜます。抗生物質の原液を作成するだけでなく、96ウェルプレート中の希釈系列を設定するため、これらのソリューションを使用してください。 注：マスター溶液製剤は、ピペッティングの誤差を考慮して余分な溶液が得られます。試験した抗生物質および株の数に応じて必要に応じてマスターソリューションは拡大または縮小することができます。 </li></ol></li><li> LB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューションの抗生物質溶液を調製します。 注：これらの溶液中の抗生物質濃度は、二重の最終的な所望の濃度にする必要があります。十分な溶液を、96ウェルプレートの4ウェルに100μlのを転送するようになされるべきです。 <ol><li> 64μgの/ mlのゲンタマイシン+/- NTBC原液を準備します。この溶液を作製するために、450にゲンタマイシン株式（100 mg / mlの）の0.288μlを添加しますμlのLB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューション。 注：Pのゲンタマイシンの最大濃度緑膿菌 PAO1は、32μgの/ mlです。 </li><li>カナマイシン+/- 256 / mlのでNTBC原液を作ります。この溶液を作製するために、450μlのLB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューションにカナマイシンストック（30 mg / mlの）の3.84μlを添加します。 注：Pのカナマイシンの最大濃度緑膿菌 PAO1は、128μgの/ mlです。 </li><li>トブラマイシン+/- 8 / mlのでNTBC原液を準備します。この溶液を作製するために、450μlのLB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューションにトブラマイシンストック（10mg / ml）の0.36μlを添加します。 注：Pの緑膿菌 PAO1、トブラマイシンの最大濃度は、4 / mlのです。 注：細菌を試験するために、抗生物質との濃度を調整することができます。 </li></ol></li><li> 96ウェルプレートの4つのウェルにそれぞれ2倍の抗生物質溶液100μlを追加します。 examplの行Aにこれらのソリューションを配置しますeは、ゲンタマイシンがA4を通じてA1に配置する必要があり、カナマイシンはA8を通じてA5に配置する必要があり、およびトブラマイシンはA12を通じてA9に配置する必要があります。セットアップ、96ウェルプレートの図については、図1Aを参照してください。 注：複数の抗生物質は、一枚のプレートで試験することができるが、唯一の1株は他の株からの交差汚染の可能性を排除するために、プレートごとにテストする必要があります。 </li><li> 96ウェルプレートのHを通じて行BにLB + NTBCまたはLB + DMSOマスター溶液50μlを追加します。一方のプレートは、LB + NTBCであることを確認し、一方のプレートは、LB + DMSOです。 図1Aを参照してください。 <ol><li> LB + NTBCにおける抗生物質のためのLB + NTBCを使用してください。 LB + DMSO中の抗生物質のためのLB + DMSOを使用してください。 </li></ol></li><li>マイクロピペットを使用すると、ピペットチップを変更、Bのミックスにソリューションを行ごとにAから溶液50μlを転送することにより、抗生物質の2倍連続希釈を行い、のためのC.繰り返しを行ごとにBから溶液50μlを転送remainingの行。行Gを希釈した後、その行から溶液50μlを除去し、廃棄します。細菌の増殖のための抗生物質のないコントロールとしてH列を使用してください。 図1Bを参照してください 。 注：Gを通じて行Aの各ウェルは現在の2倍でLB + NTBCまたはLB + DMSO中の抗生物質、50μlの最終的な所望の濃度が含まれています。 H列は、抗生物質なしでLB + NTBCまたはLB + DMSOが含まれています。 </li><li>一晩培養物のOD 600を測定します。培地中に存在pyomelaninを排除するためにOD 600読み取りを行う前に、すべての文化を洗ってください。 <ol><li> 2分間16,000×gで微量に1mlの培養物を遠心分離することによって培養液を洗います。ピペットで上清を除去し、1mlのLBに細胞ペレットを再懸濁</li></ol></li><li> LBの中で2.75x10 5 CFU / mlに一晩培養を希釈 注：1 OD 600ユニットは、Pの 1×10 9 CFU / mlと同等であると仮定緑膿菌 。 CFU / mlの変換へのODは、Dすることができます他の細菌でifferent。 </li><li>適切なウェルに希釈した細菌培養物の50μlのを追加します。 注：NTBCで増殖させた培養物は、DMSO中で増殖させ、培養物NTBCを含むウェルに添加されるべきではDMSOを含有するウェルに添加されるべきです。 図1Bを参照してください 。 <ol><li>各菌株と抗生物質濃度のための3つのウェルに細菌を追加します。細菌汚染のための対照として機能する第四ウェルにLB50μlのを追加します。 図1Bを参照してください 。 </li><li>井戸を接種するために、マルチチャンネルピペットを使用してください。近隣の井戸の汚染を防止するために、接種材料を追加する際にピペットチップは、ウェルの底近くにあることを確認してください。 注：ウェルに細菌培養を追加すると、抗生物質とNTBC濃度2倍に希釈します。 </li></ol></li><li>パラフィルムを有する96ウェルプレートを覆い、37℃で約24時間インキュベートします。空気インキュベーター中、静的96ウェルプレートをインキュベートします。 </li><li>調べウェル中の細菌増殖のためのプレート。 MICには、細菌の増殖を、各株のすべての3つの複製のために見ていないされている抗生物質の最低濃度です。 <ol><li>視覚的な成長のためにプレートを調べたり、OD 600に設定し、プレートリーダーを用いて読み取ります。 </li></ol></li></ol>酸化ストレス応答4.スポットプレートアッセイ<ol><li>ステップ3.1で説明したようにNTBCとないLB中でテストされる株の一晩培養を設定します。 </li><li>翌日、酸化的ストレッサーとしてH 2 O 2を含有する LB寒天プレートを調製します。 0〜1 mMのからのH 2 O 2濃度の範囲は、良い出発点です。 <ol><li> LB寒天フラスコを溶かします。室温で約50℃に冷却するメディア。 </li><li>所望の濃度の冷却媒体に直接H 2 O 2 を追加します 。スワールフラスコを混合します。 H 2 O 2の濃度は 、表2を参照そして濃縮し、H 2 O 2のボリュームが追加されます。これらの値は、LB寒天100mlのに基づいています。 </li><li>すぐにH 2 O 2を添加した後 、プレートを注ぎ、気泡を除去するために表面を火炎。収率はLB寒天の100ミリリットル当たり4板です。マーク・H 2 O 2濃度でプレート。 </li><li>プレートから余分な水分を除去するために、30分間実行しているファンとの生物学的な流フードで明らかになったプレートを置きます。 注：プレート、それらが用意されている同じ日に使用します。そうしないと、一貫性のないデータになることがあります。 注：例えば、パラコートなどの酸化ストレスは、このアッセイにおけるH 2 O 2の代わりに用いることができます。他の酸化ストレスのために使用される濃度は、H 2 O 2のために使用されるものと異なってもよいです。 </li></ol></li><li>洗浄ステップ3.7で説明したように一晩培養のOD 600を測定します 。 </li><li>すべて一晩のcuのOD 600を正規化テストされている株のセットの最低値にltures。P.緑膿菌は、一般的に 、LB + NTBCまたはLB + DMSO中で一晩増殖させ、約2.5のOD 600を持っています。 <ol><li> 1ミリリットルの全容量で最低のOD 600に文化を希釈するために必要な培養物の容量を決定します。例えば、培養物がOD 3の600を有しており、株のセットのための最小のOD 600が 2.5であり、次の計算実行する場合：（2.5）（1ミリリットル）=（3）（X）。 X = 0.833ミリリットル。文化の0.833ミリリットルをマイクロチューブ内に配置されます。 </li><li> 1mlに培養容量をもたらすために必要なLB + NTBC（300μM）またはLB + DMSOの量を計算します。ステップ4.4.1の例では、LB + NTBCまたはLB + DMSOの量は0.167ミリリットル（ - 0.833ミリリットル文化1ミリリットル総容量）になる培養液に添加。 LB + NTBCし、LB + DMSOのストック溶液は、すべての株を希釈するために必要な量に基づいて、これらの希釈液に使用するようにしてください。 </li><li>文化とLB + Nを混ぜますボルテックスによってTBCまたはLB + DMSO。 </li></ol></li><li> NTBCまたはDMSOの一定濃度で培養を維持するために、PBS + NTBCまたはPBS + DMSO中の正規化された一晩培養の10倍連続希釈を行います。 <ol><li> PBS + NTBCし、PBS + DMSOのストック溶液を作ります。 1株についての希釈液の1セットでは、720μLの総容量を得るために、PBSで300μMのNTBCまたはDMSOの等量を混ぜます。テストされてどのように多くの株に応じて上下にこれらの株式をスケール。 </li><li> 10 -7の連続希釈10〜-1のラベルマイクロチューブ。適切なチューブにPBS + NTBCまたはPBS + DMSO90μlのを追加します。 LB + NTBCで成長した株について、PBS + NTBCを使用し、LB + DMSO中で成長した株をPBS + DMSOを使用しています。 </li><li>適切な10 -1希釈チューブに文化の10μlのを追加します。ボルテックスで混合し、10 -2希釈チューブに10 -1希釈液10μlを移します。すべての希釈はperfoされるまで繰り返しますrmed。希釈液の間にピペットチップを変更します。 </li></ol></li><li>各株の重複でLB + H 2 O 2のプレートに10 -7希釈液を10〜-3のスポット5μlの。スポットがメッキされている場合は、ほとんどが少なくとも希（10 -7〜10 -3）に希釈から1ピペットチップを使用してください。液体がプレートに乾燥するまでプレートを傾けたり、傾けたりしないでください。 </li><li>歪みに応じて、37℃（空気インキュベーター）で24〜48時間、プレートをインキュベートします。 注：P。緑膿菌 PAO1は、インキュベーションの24時間後に、LBの良いサイズのコロニーを持つことになります。それらがコロニーをPAO1とほぼ同じ大きさになるまで株を培養します。 </li><li> transluminator上にCCDカメラを用いてプレートを撮影。必要に応じて、同じサイズとは対照的と作物のために写真を編集します。酸化ストレスに対する感受性の変化を決定するために各スポットにコロニー数をカウントします。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

The NTBC titration method described in this protocol will allow the user to determine if NTBC can reduce or eliminate pyomelanin production in bacteria, and determine the concentration of NTBC required. The most critical step in the NTBC titration assay is determining the range of NTBC concentrations to use in the assay. Different strains of P. aeruginosa have different sensitivities to NTBC, and laboratory strains may be more sensitive to NTBC than clinical isolates12 (Figure 2). Therefore, it is necessary to test a range of NTBC concentrations for each strain being assayed. It is advisable to start with lower concentrations and increase to higher concentrations as needed because the user will most likely want to determine the lowest concentration of NTBC that inhibits pyomelanin production in a particular strain. Our titration assay describes a qualitative method to determine inhibition of pigment production. Depending on the objective of the study, it may be necessary to determine pyomelanin levels. This could be accomplished through HPLC3 or electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy19, which could be used to detect the presence of pyomelanin in the samples. Melanin produces a characteristic EPR spectrum, and samples lacking melanin should not produce that spectrum20.
Modifications can be made to the titration assay by using minimal medium supplemented with tyrosine instead of LB. If a minimal medium (such as Defined minimal media21) is used, tyrosine must be supplemented in the medium since pyomelanin production will not occur in the absence of tyrosine. Minimal medium supplemented with tyrosine provides the advantage of having a defined concentration of tyrosine in the media and may eliminate some variation between biological replicates. The titration technique works quite well when one is looking for a change in pigment production, but will not work if the bacterium does not produce pigment. Other compounds could be substituted for NTBC in a titration series, provided there is a visual output to determine if the compound has an effect on the bacteria, such as reduction or enhancement of pigment production. In our assay, once the concentration of NTBC needed to eliminate or reduce pyomelanin production has been determined it is possible to use this concentration in other assays, including antibiotic MICs and oxidative stress response, in order to test the effects of NTBC on other bacterial phenotypes.
The antibiotic MIC method described in this paper will allow the user to determine antibiotic sensitivity of bacteria. Additionally, the incorporation of NTBC in the assay will allow the user to determine the effects of NTBC treatment on antibiotic sensitivity in pyomelanin producing bacteria (Table 3). Antibiotic sensitivity in bacteria can be quite variable and there are several techniques that can be used to determine MICs. Common techniques include agar dilution plates and large and small scale broth dilutions14. The microtiter plate broth dilution method described here is an easy way to determine MICs for various antibiotics, and it uses fewer resources than other methods since the protocol is designed to use small volumes. The most critical steps in the procedure are setting up the initial antibiotic stock solutions and performing accurate two fold dilutions in the 96-well microtiter plate (Figure 1A). It is important that the antibiotic stocks are two fold higher than the final desired concentration, since the antibiotics will be diluted two fold when the inoculum is added to the wells. The range of antibiotic concentrations used must be determined experimentally since different strains of bacteria have different sensitivities to antibiotics, and sensitivities are dependent on the antibiotic. The concentration of NTBC used in the assay must also be two fold higher than the final desired concentration since it will be diluted two fold when the inoculum is added. Accuracy in performing serial dilutions will help ensure that there is a two-fold difference in antibiotic concentration in each row of the plate.
The 96-well microtiter plate MIC assay can be easily modified to incorporate as many antibiotics or bacterial strains as needed. While more than one antibiotic can be tested in a plate, only one bacterial strain should be tested per plate to avoid cross contamination from other bacterial strains. No more than three antibiotics should be tested in one plate to allow for testing of one bacterial colony in triplicate with one control column containing medium only for each antibiotic (Figure 1B). The medium only column will test for contamination in the antibiotic stocks. It is also advisable to include an LB only row inoculated with bacteria in the plate to test for bacterial growth in the absence of antibiotics. This will ensure that the bacteria is growing properly and in the event that there is no growth in any of the antibiotic concentrations tested, the possibility that there was something wrong with the inoculum can be ruled out. In addition, this will provide a turbidity control for unimpaired growth, should a plate reader be used to determine the optical densities of each well. The majority of issues arise in determining the MIC, which is defined as the lowest concentration of antibiotic in which no growth occurs in all three technical replicates. It is possible that technical replicates may have slightly different MICs. Differences in MIC within technical replicates for a strain should be no more than two fold. We found that placing the pipet tips in the antibiotic containing medium while adding inoculum helps reduce some of the MIC differences for technical replicates, as it eliminates some of the potential for inoculum splashes into adjacent wells. The MIC assay should be done with at least three biological replicates to determine that the MICs and trends are consistent between replicates. The assay as described gives a very clear method for setting up a 96-well plate with different antibiotics and strains of bacteria. A large range of antibiotic concentrations can be tested, as well as a variety of different antibiotics, which can be adapted as appropriate to the bacterium being tested. This technique can be modified to test the antibiotic sensitivities of a large range of bacteria, as well as to test sensitivities to non-antibiotic compounds.
Several oxidative stress response assays have been described in the literature, including viable counts after exposure to oxidative stress1 and disc diffusion assays15. The spot plate assay described here determines bacterial sensitivity to oxidative stress when the oxidative stressor is in an agar plate. This technique allows low concentrations of H2O2 to be tested instead of the high concentrations typically used in the other assays. The spot plate technique has less variation between biological replicates than viable counts and disc diffusion methods. Trends in the spot plate assay tend to be very consistent, although there is still some variability between biological replicates. The variability is usually seen as slight differences in the H2O2 concentration that allows a clear difference in bacterial growth and sensitivity to oxidative stress to be observed. Sources for these inconsistencies are likely due to either pipetting errors when adding H2O2 to the plates or natural variations in sensitivity to oxidative stress in different colonies of bacteria. Technical replicates consistently show the same results. It is important that a range of H2O2 concentrations be tested, as different strains of bacteria may have different sensitivities to oxidative stress (Figure 3). It is also critical that the same dilutions be plated for all conditions so comparisons can be made between strains and test conditions. Additionally, a plate containing no H2O2 must be included as a control to ensure that a proper dilution series was created and to provide a comparison for bacterial growth in the absence of oxidative stress. If bacteria are treated with a compound, such as NTBC, it is necessary to include a no treatment control so a comparison can be made between the two conditions. This will allow the user to determine if the compound has an effect on oxidative stress response (Figure 3).
The spot plate protocol can be modified to include other oxidative stressors such as paraquat. However, the type of oxidative stress to be generated in the bacteria must be determined before adding the oxidative stressor, since different compounds generate different types of oxidative stress. This assay could also be modified to test bacterial sensitivity to other compounds. In that case, the compound would be included in the agar plates at various concentrations and the bacteria would be spotted onto the plates as described in the protocol. Differences in colony numbers and size in different dilutions compared to a control plate without the compound would indicate sensitivity to the compound.
We describe three methods to test the effects of NTBC on pyomelanin producing strains of bacteria. First, we use a titration containing various concentrations of NTBC to determine if NTBC will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria, and then determine the minimum concentration of NTBC necessary to do so. The concentration of NTBC that eliminates or reduces pyomelanin production will be used in other assays to determine the effects of NTBC on antibiotic MICs and oxidative stress response. The MIC assay will allow the user to test the effects of NTBC on antibiotic sensitivity. Finally, the spot plate oxidative stress response assay will be used to test the effects of NTBC on sensitivity to oxidative stress.

Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacterium that produces a variety of pigments including pyomelanin, a red-brown pigment that helps provide protection from oxidative stress1-4 and binds a variety of compounds, including aminoglycoside antibiotics5-7. Pyomelanin production is caused by a defect in the tyrosine catabolism pathway4,8, either through deletions or mutations of the gene encoding homogentisate 1,2-dioxygenase (HmgA)1,9 or through imbalances in the various enzymes in the pathway10. Homogentisate accumulates due to inactivation of HmgA, and is secreted and oxidized to form pyomelanin11. Production of pyomelanin can be abolished or reduced in a dose dependent manner through treatment with the herbicide 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)12, which inhibits 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (Hpd) in the tyrosine catabolism pathway13. Hpd is required for the formation of homogentisate, and therefore pyomelanin11. 
We describe in detail three techniques that were important in our studies of NTBC treatment of pyomelanin producing strains of P. aeruginosa. These techniques include titration of NTBC to determine the concentrations that will abolish or reduce pyomelanin production in laboratory and clinical pyomelanin producing strains, determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotics when bacteria are treated with NTBC, and the resulting sensitivity to oxidative stress with NTBC treatment.
The titration assay we developed serves two purposes. First, the assay will allow the user to determine if NTBC can abolish or reduce pyomelanin production in the bacterium being studied and at which concentrations. This will allow the user to determine sensitivity to NTBC, since different strains of bacteria may have different sensitivities to this compound, as observed in P. aeruginosa12. Second, the NTBC titration assay will allow the user to determine the appropriate concentration of NTBC to use in subsequent assays, such as antibiotic MIC and oxidative stress response assays, if the goal is to abolish or reduce pyomelanin production and determine the effects of pigment reduction. 
The titration assay works because a visible difference in pyomelanin production can be seen in strains treated with NTBC and the differences in pyomelanin production are dose dependent12. Additionally, this technique can be applied to the study of other compounds that may eliminate or enhance pigment production in bacteria.
Antibiotic MICs are used to determine the sensitivity of bacteria to antibiotics. There are several methods to determine MICs, including agar dilution plates and broth dilutions14. Broth dilutions can be performed in small test tubes or in a 96-well microtiter plate. The microtiter plate method of MIC determination described herein will allow the user to test a wide range of antibiotics using a minimum of resources. The assay provides reproducibility as well as flexibility in the number of antibiotics and strains tested by this method. Additionally, with the incorporation of NTBC in the assay, the user can determine if elimination or reduction of pyomelanin production alters antibiotic sensitivity in bacteria that produce pyomelanin.
Bacterial response to oxidative stress can be tested in several ways. The most common methods described are either viable counts of bacteria subjected to oxidative stress for a period of time1, or oxidative stress disc diffusion assays15. These methods tend to use high concentrations of oxidative stressors to examine the effects of oxidative stress in bacteria and results can be quite variable between biological replicates. The viable count assay also tends to use more agar plates than the other methods. The spot plate assay we describe uses low concentrations of H2O2 and allows the user to test the oxidative stress response of multiple strains using a minimum of plates. The assay is also consistently reproducible between technical and biological replicates. As pyomelanin is involved in resistance to oxidative stress, the incorporation of NTBC in the assay allows the user to determine the effects of elimination of pyomelanin production on oxidative stress resistance.

<table><tbody><tr><td>2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0269-50mg</td><td>Also called nitisinone.&amp;nbsp; Soluble in DMSO.</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td>30 wt. % in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.&amp;nbsp; Stabilized.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gold Bio</td><td>G-400-100</td><td>Soluble in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.&amp;nbsp; Filter sterilize.</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Soluble in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.&amp;nbsp; Filter sterilize.</td></tr><tr><td>Tobramycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>Soluble in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.&amp;nbsp; Filter sterilize.</td></tr></tbody></table>

methods to inhibit bacterial pyomelanin production and determine the corresponding increase in sensitivity to oxidative stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

NTBC滴定 NTBCはP.でpyomelanin産生を減少させることができた場合にNTBC滴定を決定するために使用されました緑膿菌 、また、追加のアッセイにおける使用のためのpyomelanin生産性を排除または低減されるNTBCの濃度を特定します。そこ異なる複製で生産pyo​​melaninのレベルの変化であるが、一般的な傾向は一定のままであってもよいです。 NTBC滴定アッセイはまた、他の細菌に色素産生に影響を及ぼし得る他の化合物を試験するために変更することができます。視覚的に測定または定量することができる表現型の変化がある場合にのみ、しかし、動作します。 Pの pyomelanin産生株の治療NTBCと緑膿菌は、顔料製造12の用量依存性の減少をもたらした。 図2は 、Pの異なる株を示していますピョのレベルによって示されるように緑膿菌は 、NTBCに対する感受性の違いを持っていますメラニン産生。 NTBCのより高い濃度は、実験室株HMGA :: TN 18（ワシントン大学のPAO1トランスポゾン変異体ライブラリー）に比べて（ダラフランクから得た）臨床分離株のPA1111 17に生産をpyomelanin削減する必要がありました。 NTBC処置と色素沈着の変化を示さなかったpyomelanin [18（ワシントン大学のPAO1トランスポゾン変異体ライブラリー）は、TN（キャリーハーウッドから得た）PAO1 および HPD ::]を産生しない株。我々はpyomelanin生産は、実質的に実験室株HMGAに減少したため、我々のアッセイのために300μMのNTBCを使用することにしました:: TNを 、その濃度を使用して（0μMNTBCに300μMの比較します）。本研究で用いた全ての株は、15％グリセロール中で-80℃で保存しました。 抗生物質のMIC 抗生物質のMICは、いくつかの異なる方法を用いて試験することができます。ここで説明するマイクロタイタープレート法を使用することを可能にします抗生物質濃度の範囲をテストし、リソースの最小値を使用するには、r。結果は、簡単に複製され、アッセイは、試験されるべき生物の抗生物質感受性の差異を可能にするように修飾することができます。いくつかのバリエーションは、独立した実験の間に見ることができるが、傾向はかなり一致しています。技術的反復は同じMICを示すべきです。 表3は、異なるPの結果を示していますし、NTBC、様々なアミノグリコシド系抗生物質を含まない治療緑膿菌菌株 。三つの独立したコロニーを、以下に記載される方法、三連で試験しました。 MICはすべての3つの技術的反復で、細菌の増殖を阻害する抗生物質の最低濃度として記録しました。 NTBC処置は、試験した株についてのMICアミノグリコシド系に影響を及ぼさありませんでした。 酸化ストレススポットプレートアッセイ酸化的ストレスを試験するためのスポットプレートアッセイreproduciblを与えますeは結果他のアッセイにおいて使用されるものよりもH 2 O 2のより低いレベルを使用して。 H 2 O 2なしのプレートは、各株についての希釈系列の精度を決定するだけでなく、酸化ストレスに細胞をさらすことなく、コロニーの大きさおよび各スポットにおけるコロニーの数を決定するための制御板です。最初のスポットは、H 2 O 2を含まない培地上のコロニーの無数を持つことになりますしながら、適切な希釈系列では、最終的なスポットは、非常に少数のコロニーを持っている必要があります。希釈系列内の各スポットでのコロニー数の10倍の差があるはずです。試験した全ての株について、コロニーの同様の番号は、H 2 O 2を含まない対照プレート上の同じ希釈で見られるべきです。 以下のような細菌の異なる株は、酸化ストレスに対して異なる感度、2 O 2濃度は、試験されるべきであるHの範囲を有することができます。 H 2 Oの濃度を増加させ<suB&gt; 2は、細菌が、H 2 O 2による酸化ストレスに敏感であると仮定すると、各スポットでのコロニーサイズと数の減少によって示されるように、成長の減少量を示すべきです。異なる細菌株の成長特性は、特定のH 2 O 2濃度下で、酸化ストレスに対する感受性を決定するために比較することができます。このアッセイは、細菌は、酸化ストレスにさらされているときに、単一の細菌株に、例えば、NTBCのような特定の化合物または試薬の影響を決定するために修飾することができます。コロニーは、異なる実験条件間の単位を形成する細菌コロニーのパーセント減少を決定するためにカウントすることができます。 図3は Pの pyomelaninと非pyomelanin産生株のスポットプレートアッセイを示します緑膿菌 NTBCととせずに処理され、H 2 O 2誘発される酸化ストレスにさらされます。明確なdiffereがあります酸化ストレスに対する感受性のNCE生産菌をpyomelanin NTBCで処理し、また顔料を生成行うものに比べpyomelanin産生しない細菌の間でされています。自然に、または原因でNTBCの治療に、pyomelaninを生じなかった株は、pyomelaninを生産菌株よりも酸化ストレスに対してより敏感でした。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53105/53105fig1.jpg" /> 図1：最高開始濃度の2倍の抗生物質のセットアップ抗生物質のMICアッセイ96ウェルプレートの概略図（A）100μlをHを通じて行A.行Bにあるが、LB + NTBCまたはLB +のいずれかの50μlの充填されています抗生物質を含まないDMSO。 （B）2倍連続希釈液を各ウェルに2×の最終所望濃度に希釈された抗生物質の50μlの結果として、Gを介して行Aで行われます。行HはBのためによくコントロールです抗生物質を含まないacterial成長。 LBまたは接種物の50μlを、最終濃度の抗生物質に2倍に希釈し、適切なウェルに添加します。 LBは抗生物質で細菌汚染のコントロールとして機能します。 Gmは、ゲンタマイシン;キロ、カナマイシン;トブ、トブラマイシン。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53105/53105fig2.jpg" /> 図2：pyomelaninプロデューサとPの非生産者のNTBC滴定緑膿菌 。NTBCは、実験室および臨床pyomelanin生産において用量依存的にpyomelanin生産を減少させたが、pyomelaninを生成しない菌株で色素産生に影響を及ぼさありませんでした。参照12から変更されました。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53105/53105fig3.jpg" /> 図3：酸化ストレス応答のスポットプレートアッセイ細菌株は希薄でした。同じOD 600 D、連続10倍希釈し、H 2 O 2の様々な濃度を含有するLBプレート上にスポットしました。 0 mMのH 2 O 2のプレートの結果が異なる株に対して同じ希釈スポットのそれぞれにおけるコロニーの同様の番号で示されるように、すべての株が、適切に希釈したことを示しました。 H 2 O 2の濃度が増加するにつれて株は酸化ストレスに対してより感受性であったことをH 2 O 2を含有するプレートを示します。これは、無H 2 O 2状態、ならびにコロニーサイズの減少と比較して減少したスポットでのコロニー数によって示されます。参照12から変更されました。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NTBCの最終濃度（μM） </td><td> （μl）を追加するためにNTBC（75.9ミリモル）の巻 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 50 &lt;/ TD&gt; <td> 0.659 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 1.318 </td></tr><tr><td> 200 </td><td> 2.64 </td></tr><tr><td> 300 </td><td> 3.95 </td></tr><tr><td> 600 </td><td> 7.91 </td></tr><tr><td> 900 </td><td> 11.86 </td></tr></tbody></table> 表1：この表は、さまざまなNTBCの濃度とNTBC株式の対応する量を与え、LBで滴定を設定するためのNTBCの濃度は 1ミリリットルのLBに追加します<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Hの最終濃度2 O 2（MM） </td><td> 9.79 H 2 O 2（30％重量）の量追加する（μL） </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 0.2 </td><td> 2.04 </td></tr><tr><td> 0.4 </td><td> 4.09 </td></tr><tr><td> 0.6 </td><td> 6.13 </td></tr><tr><td> 0.8 </td><td> 8.17 </td></tr><html><tr><td> 1 </td><td> 10.21 </td></tr></tbody></table> 表2：H 2 O 2の濃度は、酸化ストレスのスポットプレートアッセイのためにLB寒天に追加するには、この表では、様々なH 2 O 2濃度、100mlのLB寒天に追加する濃H 2 O 2の株式の対応する量を指定します。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td class="xl63"></td><td class="xl65"> PAO1 - NTBC </td><td class="xl65"> PAO1 + NTBC </td><td class="xl66"> HMGA :: TN - NTBC </td><td class="xl66"> HMGA :: TN + NTBC </td><td class="xl66"> HPD :: TN - NTBC </td><td class="xl66"> HPD :: TN + NTBC </td><td class="xl65"> PA1111 - NTBC </td>L65 &quot;&gt; PA1111 + NTBC </td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td class="xl64"> 1 </td><td class="xl64"> 0.5 </td><td class="xl64"> 2 </td><td class="xl64"> 2 </td><td class="xl64"> 1 </td><td class="xl64"> 1 </td><td class="xl64"> 0.5 </td><td class="xl64"> 0.5 </td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td class="xl64"> 16 </td><td class="xl64"> 8 </td><td class="xl64"> 32 </td><td class="xl64"> 32 </td><td class="xl64"> 32 </td><td class="xl64"> 32 </td><td class="xl64"> 16 </td><td class="xl64"> 16 </td></tr><tr><td>トブラマイシン</td><td class="xl64"> 0.5 </td><td class="xl64"> 0.5 </td><td class="xl64"> 0.5 </td><td class="xl64"> 0.5 </td><td class="xl64"> 0.25 </td><td class="xl64"> 0.25 </td><td class="xl64"> 0.5 </td><td class="xl64"> 0.5 </td></tr></tbody></table> 表3：抗生物質のMICの結果 3つの独立したコロニーをそれぞれストラ3連で試験しました。インチ参照12からの許可を得て再印刷。

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Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

細菌Pyomelanin産生を阻害し、酸化ストレスに対する感受性の増加に対応を決定するための方法

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.1K ビュー.  University of Wisconsin Milwaukee. Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

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Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

遺伝子にコードされた蛍光センサーを用いた毒性酸化ストレスの評価へのアプローチをイメージング

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

がん研究

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

C2C12 細胞によるトランス プラズマ膜電子輸送特性の測定

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

生化学

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

培養色素脱失活動の定量化

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1 receptor, a Gs-coupled signaling protein found on the surface of melanocytes. Mc1r stimulates adenylyl cyclase and cAMP production which, in turn, up-regulates melanocytic production of melanin in the skin. In order to study the mechanisms by which Mc1r signaling protects the skin against UV injury, this study relies on a mouse model with "humanized skin" based on epidermal expression of stem cell factor (Scf). K14-Scf transgenic mice retain melanocytes in the epidermis and therefore have the ability to deposit melanin in the epidermis. In this animal model, wild type Mc1r status results in robust deposition of black eumelanin pigment and a UV-protected phenotype. In contrast, K14-Scf animals with defective Mc1r signaling ability exhibit a red/blonde pigmentation, very little eumelanin in the skin and a UV-sensitive phenotype. Reasoning that eumelanin deposition might be enhanced by topical agents that mimic Mc1r signaling, we found that direct application of forskolin extract to the skin of Mc1r-defective fair-skinned mice resulted in robust eumelanin induction and UV protection 1. Here we describe the method for preparing and applying a forskolin-containing natural root extract to K14-Scf fair-skinned mice and report a method for measuring UV sensitivity by determining minimal erythematous dose (MED). Using this animal model, it is possible to study how epidermal cAMP induction and melanization of the skin affect physiologic responses to UV exposure.

Epidermal melanin is induced by topical application of forskolin in a murine model of the fair-skinned UV-sensitive human. Pharmacologic manipulation of cAMP levels in the skin and epidermal darkening strongly protect against UV-mediated inflammation (sunburn) as measured by the minimum erythematous dose (MED) assay.

ヒト化マウスモデルにおける表皮のメラニンと保護に対する日焼け薬理学的誘導

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

医学

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative stress by measuring total reactive oxygen species (ROS) using 2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) staining in colorectal cancer cell lines as an example. This protocol describes detailed steps including preparation of DCFH-DA solution, incubation of cells with DCFH-DA solution, and measurement of normalized intensity. DCFH-DA staining is a simple and cost-effective way to detect ROS in cells. It can be used to measure ROS generation after chemical treatment or genetic modifications. Therefore, it is useful for determining cellular oxidative stress upon environment stress, providing clues to mechanistic studies.

Here, we present a protocol to detect total cellular reactive oxygen species (ROS) using 2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). This method can visualize cellular ROS localization in adherent cells with a fluorescence microscope and quantify ROS intensity with a fluorescence plate reader. This protocol is simple, efficient and cost-effective.

2',7'-ジクロロジドロフルオレセイン・ジアセテート染色による接着性細胞中の全活性酸素種の検出

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Adsorptive Bioprocess Improves Yield of Melanin from Pseudomonas stutzeri

Melanins are natural pigments, and the presence of indole ring and numerous functional groups makes melanin an ideal choice for many applications such as UV protective agents, skincare, cosmetics etc. A marine Pseudomonas stutzeri produces melanin without the addition of tyrosine. The feedback inhibition was observed by melanin in the culture of a melanin-producing marine bacterium, Pseudomonas stutzeri. Melanin also demonstrated microbial growth inhibition. The Han-Levenspiel model-based analysis identified uncompetitive type product inhibition of melanin on the cell growth. Tyrosinase enzyme, which produces melanin, was inhibited by melanin. The double reciprocal plot of the enzymatic reaction in the presence of different melanin concentrations revealed uncompetitive product inhibition. An adsorbent-based adsorptive bioprocess was developed to reduce the feedback inhibition by melanin. Different adsorbents were screened to select the best adsorbent for melanin adsorption. Dosage amount and time were optimized to develop the adsorptive bioprocess, which resulted in an 8.8-fold enhancement in melanin production by the marine bacteria Pseudomonas stutzeri (153 mg/L to 1349 mg/L) without supplementation of tyrosine and yeast extract.

Adsorptive Bioprocess Improves Yield of Melanin from Pseudomonas stutzeri

Here we present a protocol on adsorptive bioprocess to produce a biological product, especially a pigment that inhibits its own biosynthesis and inhibits the growth of the microorganism that produces it.

Melanins are natural pigments, and the presence of indole ring and numerous functional groups makes melanin an ideal choice for many applications such as ...

工学

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

生物学

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

睡眠美容トランスポゾントランスポゾントランスフェクトヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導と分析

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient production of ROS in situ efficiently activates cell proliferation in stem cell niches and stimulates tissue regeneration as strongly manifested through the acceleration of burn healing and hair follicle growth processes. The protocol is based on a regulatable photodynamic treatment that treats the tissue with precursors of the endogenous photosensitizer protoporphyrin IX and further irradiates the tissue with red light under tightly controlled physicochemical parameters. Overall, this protocol constitutes an interesting experimental tool to analyze ROS biology.

The aim of this protocol is to induce transient in vivo production of nonlethal levels of reactive oxygen species (ROS) in mouse skin, further promoting physiological responses in the tissue.

切り替え可能なプロトポルフィリンIX依存性活性酸素種のin situ光生成によるマウス皮膚における幹細胞ニッチの刺激と組織再生

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

A Spot Plate Assay for Evaluating Oxidative Stress Responses in Bacterial Strains

Source: Ketelboeter, L. M. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/53105">Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates a spot plate assay tailored to assess the oxidative stress responses of bacterial strains. Some strains produce pyomelanin, an antioxidant pigment. Conversely, strains treated with a test agent, leading to reduced pyomelanin production, exhibit increased susceptibility to oxidative stress, resulting in decreased cell viability compared to pyomelanin-producing strains.

細菌株の酸化ストレス応答を評価するためのスポットプレートアッセイ

1. Preparation of Culture Media, Antibiotics, and 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)

	Make Luria-Bertani (LB) broth (1% ...

細菌Pyomelanin産生を阻害し、酸化ストレスに対する感受性の増加に対応を決定するための方法

要約

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この動画の章

遺伝子にコードされた蛍光センサーを用いた毒性酸化ストレスの評価へのアプローチをイメージング

C2C12 細胞によるトランスプラズマ膜電子輸送特性の測定

培養色素脱失活動の定量化

ヒト化マウスモデルにおける表皮のメラニンと保護に対する日焼け薬理学的誘導

2',7'-ジクロロジドロフルオレセイン・ジアセテート染色による接着性細胞中の全活性酸素種の検出

Adsorptive Bioprocess Improves Yield of Melanin from Pseudomonas stutzeri

、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量

睡眠美容トランスポゾントランスポゾントランスフェクトヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導と分析

切り替え可能なプロトポルフィリンIX依存性活性酸素種のin situ光生成によるマウス皮膚における幹細胞ニッチの刺激と組織再生

細菌株の酸化ストレス応答を評価するためのスポットプレートアッセイ

細菌Pyomelanin産生を阻害し、酸化ストレスに対する感受性の増加に対応を決定するための方法

要約

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遺伝子にコードされた蛍光センサーを用いた毒性酸化ストレスの評価へのアプローチをイメージング

C2C12 細胞によるトランス プラズマ膜電子輸送特性の測定

培養色素脱失活動の定量化

ヒト化マウスモデルにおける表皮のメラニンと保護に対する日焼け薬理学的誘導

2',7'-ジクロロジドロフルオレセイン・ジアセテート染色による接着性細胞中の全活性酸素種の検出

Adsorptive Bioprocess Improves Yield of Melanin from Pseudomonas stutzeri

、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量

睡眠美容トランスポゾントランスポゾントランスフェクトヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導と分析

切り替え可能なプロトポルフィリンIX依存性活性酸素種のin situ光生成によるマウス皮膚における幹細胞ニッチの刺激と組織再生

細菌株の酸化ストレス応答を評価するためのスポットプレートアッセイ

C2C12 細胞によるトランスプラズマ膜電子輸送特性の測定