著者はNJCに国立研究財団（NRF -NRFF2011-01とNRF2015NRF-POC0001-19）、国立医学研究審議会（/ 0005/2012 NMRC / CBRG）、およびナンヤン工科大学からのサポートを認めることを望みます

親水性固体支持体上に支持された脂質二重層の形成1。 <ol><li> 10 mg / mlの1,2- dioleoyl- SN -glycero -3-ホスホコリンの脂質ストック溶液を準備します（DOPC）および1 mg / mlの1,2- dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - （リサミンローダミンBそれぞれの脂質粉末を溶解することによりスルホニル）ロジウム（Rh-PE）は、（適切にイソプロパノール溶液中の分析物質収支）を事前に秤量しました。 </li><li>希釈し、最終濃度で、所望の脂質混合物を調製するために、イソプロパノール中ストック溶液を混合します。蛍光顕微鏡およびFRAP実験のために、0.5重量％のRh-PE脂質混合物中に含まれるべきです。 </li><li>それが満たされるまで、マイクロ流体チャネル内に、イソプロパノール中の脂質混合物を注入します。 </li><li>約10分間、ガラス表面上の脂質混合物をインキュベートします。 </li><li>徐々に非常に低い流量で、蠕動ポンプを用いて水または緩衝溶液と脂質溶液を交換（10〜50μL/分）。また、ピペッティングを繰り返すことにより、脂質混合物を交換してください。 </li><li>残留イソプロパノールを除去するために過剰の緩衝液で徹底的にチャンネルを洗い流します。 </li></ol>コレステロールに富む支持された膜の形成2。 注：固体表面（SiO 2）が小胞の融合をサポートしていますが、コレステロールに富む小胞は、高剛性30を曲げているため、膜組成物（高コレステロール）は、小胞融合を阻害します。 <ol><li>まずイソプロパノールで各粉末を溶解させて10 mg / mlのDOPCの脂質、10 mg / mlのコレステロール、および1mg / mlでのRh-PEを含むストック溶液を調製します。 </li><li>繰り返しは、ステップ2.1で調製したストック溶液を使用して、1.2から1.6を繰り返します。 </li></ol> 3.膜流動性アッセイ<ol><li> 10分間のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液（1％）でガラススライドを浸します。 </li><li>脱イオン水で十分にスライドを洗浄し、ウィットをすすぎますHエタノール。 </li><li>ブロー乾燥窒素の穏やかな流れを使用してスライドを。 </li><li>酸素プラズマチャンバ内で最大の高周波電力で30秒間酸素プラズマにスライドを露出させます。 </li><li>ピンセットを使用して、底なしの商用マイクロ流体チャンバー（ 図1A）の保護フィルムコーティングを外し、チャンバー（ 図1B）の粘着面上にスライドガラスを取り付けます。 </li><li>チャンバーの入口と出口の位置にコネクタとチューブを組み立て、顕微鏡ステージ（ 図1C）にマイクロ流体チャネルを配置します。 </li><li>蛍光標識されたフォームは、マイクロ流体チャネルの[希望する脂質組成物の有機溶媒中に0.5重量％のRh-PEを含む（ 例えば 、0.5 mg / mlのDOPC）を使用して、手順1を繰り返し]を脂質二重層を支持しました。 </li><li>画像をキャプチャするために、60X油浸対物レンズ（NA 1.49）との二層面の位置を確認します。 </li><li> 2つの事前漂白画像を撮影し、フォトブリーチ301; 532 nmで、100 mWのレーザービームで広い円形スポットをメートル。その強度が安定するまで退色する前に、レーザーを温めます。すぐに退色した後、漂白スポットの蛍光強度の回復を追跡するために、2分毎に1秒の一連の画像をキャプチャします。 </li></ol> 4.コレステロール定量アッセイ<ol><li>酸素プラズマチャンバ内で最大の高周波電力で30秒間酸素プラズマに二酸化ケイ素でコーティングされた水晶センサーチップを露出します。チャンバーからチップを取り出し、すぐに測定室にチップをマウントします。 </li><li>実験の前に、第一の適切な取り付けを確実にするために、空気中のセンサチップの周波数と損失を取得します。 <ol><li>商業Q-センスE1またはE4 QCM-Dの機器については、Q-ソフトのソフトウェアプログラムを実行し、「取得」をクリックして、「セットアップ測定」を選択します。 </li><li>表示される新しいウィンドウでは、3、5、7をご確認ください、9、11、13倍音[検索]をクリックしますと、共鳴スペクトルをチェックするために実行します。 24で温度を設定します °C。一つ以上の共振周波数が期待値と一致していない場合は、チップ実装を確認し、合意に達するまで、この手順を再度実行します。 </li></ol></li><li>蠕動ポンプを起動し、100μL/分の流速で測定室に（10mMのトリス、150mMのNaCl、pH7.5）に緩衝​​液を流します。 </li><li>ソフトウェアプログラムでは、「取得」をクリックして、共振周波数とエネルギー散逸信号を記録するために、「再起動測定」を選択します。安定したベースラインが周波数と消費のシフトのために取得されるまで、この手順を繰り返します。注：以下の手順については、時間の関数として記録することができ、追加の周波数と消費のシフトが存在することになります。 </li><li> 10分間（脂質なし）イソプロパノールを注入します。 </li><li>でDOPC脂質/コレステロールとの混合物を注入します10分間イソプロパノール中0.5 mg / mlの総脂質濃度が所望のモル比。 </li><li> 100μL/分の流速で20分間のバッファを注入します。 </li><li>周波数信号が安定した値に達するまで緩衝液（流速100μL/分）で調製した1mMのメチルβシクロデキストリン溶液（MβCD）を注入します。 </li><li> MβCD処理工程によって引き起こされる相対的な正の周波数シフトを測定し、[量Δm=のSauerbrey式を用いて質量値にΔfのCHOおよび ΔfのDOPCの値を変換することにより、コレステロールおよびDOPCの脂質の質量を計算- （C / N）× Δfを、C = 17.7 NG / cm 2であり、nは：倍音]。 </li><li>アカウントにDOPC脂質（786.1グラム/モル）及びコレステロール（386.6グラム/モル）の分子量を取って、SLB中のコレステロールのモル分率を計算します。 </li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

この作業では、溶媒交換手順は、アルコール中の脂質（イソプロパノール、エタノール、又はn-プロパノール）は、固体支持体と共にインキュベートし、次いでアルコールを直列に駆動するために、水性緩衝液に徐々に置換された提示され相転移の最終的ラメラ相の脂質二重層24を生成します 。この方法は、このような小胞融合法に難治性である金、などの表面上に支持された脂質二分子層の製造を可能にすることが示されています。 最適な脂質濃度範囲（0.1 - 0.5 mg / mlの）は、これまで試験された標準的な実験形式で完全な二層形成のための決定されました。二重層の0.1 mg / mlの、個別の、微小パッチ以下の脂質濃度で形成されました。一方、0.1 mg / mlのより高い濃度およびより低いで0.5 mg / mlの、完全かつ均一な二重層が形成されます。この範囲より上の脂質濃度で、流体二重層は依然としてverifiとして形成しましたFRAP解析により編、しかし、蛍光顕微鏡は、二層の上に追加の脂質構造の存在を明らかにする。驚くべきことに、これらの追加の脂質構造の形態は、QCM-D分析によって決定されるように、インキュベーション工程の間に使用したアルコールに依存しました。エタノールの場合には、比較的高ΔFおよびΔDシフトが吸着小胞の層に対して得られたQCM-Dの署名に似ています。イソプロパノール又はn-プロパノールの代わりに使用した場合ΔDがかなり高かった、Δfは、二重層（-40ヘルツまでの間-30 F最終Δ）が期待値よりもわずかに高かったです。このようなQCM-D応答は、（場合によっては蛍光顕微鏡によって可視など）膜表面から外側に突出する延長脂質構造（例えば、蠕虫状ミセル）のために予想されます。 溶媒交換の速度は、エスペック重要であり得る別の重要なパラメータであります低い脂質濃度（例えば、0.1 mg / mlで）を使用しているときially。低脂質濃度で迅速な溶媒交換は、不完全な二重層の形成につながることができます。本論文では、QCM-D測定（Q-センスE4測定室）、約100マイクロリットル/分の流量のために使用される標準的な測定室では、再現性の高い完全な二重層形成に適していました。他の形状及び容積を有するフローセルの場合、最適な流量が変化してもよく、経験的に、本明細書に推奨される手順に基づいて決定されなければなりません。 小胞の融合に難治性である表面上に支持された脂質二重層を形成することに加えて、SALBにより複雑な組成を有する支持された膜の製造にドアを開け、破裂することができる脂質小胞の必要性を回避するために使用することができます。例示的な実施例の組成物として、コレステロールの高い割合を有する脂質混合物を調べました。コレステロールはmammの重要な構成要素でありますalian細胞膜、およびその画分は、（赤血球中など ）、膜脂質組成の45〜50モル％に近づけることができます。このように、人間の細胞膜を代表する脂質二重層であっても単純なモデルは、コレステロールを含むべきです。 小胞の融合のみ10-15％のコレステロールを含有する流体の脂質二重層を製造するために使用することができるが（QCM-Dの測定によって定量し、最大57モル％）、SALB方法は、コレステロールの高い画分を含む流体の脂質二重層を形成することができる36。コレステロールのレベルはさらに（63モル％まで）上昇したときしかし、ストライプ状の領域37を観察しました。共同既存のドメインは、空気 - 水界面におけるコレステロール/リン脂質単層の相図にβ地域で観察されたものを連想させる液体でした。 全体として、SALB方法は私は特に、サポートされている脂質二重層を形成するためのシンプルかつ効率的なアプローチであることが示されています従来のベシクル融合法の範囲を超えて、n個のケース。これまで、QCM-D法と蛍光顕微鏡検査は、主にSALB法により形成されたサポートされている脂質二重層を特徴付けるために使用されました。 、39,40、フーリエ変換赤外分光法41、X線42と中性子反射率43ができる表面プラズモン共鳴（SPR）38を含む技術は、前方表面感受性分析測定の広い範囲を見ると、原子間力顕微鏡（AFM）さらに特徴付け、単純および複雑な二層構成はSALB方法により調製研究するために使用されます。これらの新興の機能はシンプルで堅牢な実験プロトコルを利用することにより、人工細胞膜を探索することができます科学者のより多くの扉を開きます。

固体サポート脂質二重層1（SLB）は、二層の厚さ、二次元脂質拡散率、および膜関連生体分子をホストする機能として、生体膜の基本的な特性を保持する汎用性の高いプラットフォームです。 、天然の細胞膜の複雑さのために、この単純なプラットフォームは、ラフト形成2、4,5結合タンパク質結合3、ウイルスおよびウイルス様粒子のような膜関連プロセスの in vitro研究のための効率的なプラットフォームとして機能することが示されています、およびセル6シグナリング 。固体支持体に近接して形成され、SLBプラットフォームは、内部全反射顕微鏡（TIRF）、水晶振動子マイクロ散逸（QCM-D）、及びインピーダンス分光法のような表面に敏感な測定技術の範囲と互換性があります。 いくつかの方法は、気泡を含む、のSLBの異なるタイプを生成するために開発されていますサブミクロンサイズの脂質スポットのための崩壊7およびディップペンナノリソグラフィー8、スピンコーティング二重層スタックとラングミュア-ブロジェット（LB）10とフルスパン、単一の脂質二重層コーティングのための小胞融合（VF）11のために9。 VFの方法は、連続的な脂質二重層を形成するために、固体支持体とその後の自発的破裂および融合に小型単層小胞の吸着で構成されています。しかし、生理的条件下で、自発的な小胞の破壊は、主として二酸化ケイ素、ガラス、マイカなどのシリコン系材料に限定されています。また、小胞の破裂は、コレステロールまたは負に帯電した脂質の高い画分を含むもののような複雑な脂質組成物の小胞のために自然に発生しません。システムに応じて、小胞の破裂は、さらに、温度12、溶液pH 13、及び塩分14、浸透圧ショック15の実験条件を調整することによって誘導することができます</s圧力16、または例えばCa 2+などの二価イオンの添加アップ&gt;または17あるいは、膜活性AHペプチドはの範囲に小胞の破裂および二重層の形成につながる、吸着された小胞の膜を不安定化するために導入することができます表面18-22。 また、成功した二層の形成は、時間がかかり、特定の膜組成物を達成するの​​は困難であることができる、小さな単層小胞のよく制御集団の調製を必要とします。したがって、最適なケースでは、その高い効率にもかかわらず（例えば、小胞23の大規模な凍結融解の前処理後）、小胞の融合の一般的なアプリケーションは、適切な基板と膜の組成物の範囲によって制限されます。 溶剤補助脂質二重層（SALB）メソッド24-28脂質小胞を必要としない代替製造技術です。この方法は、堆積Oに基づいていますSLBの形成を誘発するために、水性緩衝溶液と、この溶媒の段階的な交換に続いて水混和性有機溶媒の存在下で固体表面へのF脂質分子。溶媒交換工程中に、脂質、有機溶媒、及び水の三成分混合物は、固体基板上にバルク溶液とSLBにおけるラメラ相構造の形成をもたらす増大水画分と直列の相転移を受けます。重要なことは、この自己組織化ルートは通常のSLBに吸着された小胞の形質転換のための律速段階である小胞の破裂、の必要性を回避します。プロトコルは、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、クロム、インジウムスズ酸化物、金を含む多種多様な表面に適用可能です。本稿でおよび添付のビデオで、SALBとベシクル融合法による脂質沈着の比較が示されています。特に、実験パラメータの影響を含む脂質濃度、流速、及びSALB法により形成された二層の品質に水混和性有機溶媒の選択は、説明されています。作製のSLBの分析的特徴付けは、（FRAP）技術を光退色後QCM-D、蛍光顕微鏡、蛍光回復することによって行われます。 QCM-Dの監視はケラーとKasemo 29によって行わ先駆的研究以来、広く定量的二重層の形成を研究するために使用されている、表面に敏感な質量測定法です。蛍光顕微鏡は、膜の均一性の検査だけでなく、膜ドメインの可視化を可能にします。 FRAP技術は、流体膜の本質的な特性であるSLB、中の脂質分子の横方向の移動性を決定するための標準的なツールです。 この研究の最初の部分は、二酸化ケイ素と金に二重層形成を試みるように適用SALBとベシクル融合法のQCM-Dの分析を含みます。第二部では、SALB方法でコレステロール濃度の範囲を含むサポートされている膜の調製および特性が示されており、その結果は、小胞融合法によって得られたものと比較します。

<table><tbody><tr><td>QCM-D silicon dioxide-coated substrates</td><td>QSense AB,&amp;nbsp; Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QCM-D gold-coated substrates</td><td>QSense AB,&amp;nbsp; Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Sense E4 module</td><td>QSense AB,&amp;nbsp; Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaner, PDC-32G</td><td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td><td>PDC-001 (115V)&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoethanolamine-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810150P</td><td></td></tr><tr><td>cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>673773</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>n-propanol</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>279544</td><td></td></tr><tr><td>Sticky-Slide I 0.1 Luer</td><td>IBIDI</td><td>81128</td><td></td></tr><tr><td>Male elbow 1/8&amp;rdquo;</td><td>Cole-Parmer</td><td>30505-70</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing 1.6&amp;#160;mm ID</td><td>IBIDI</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>71725</td><td></td></tr></tbody></table>

biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method

細胞膜を模倣するためには、サポートされている脂質二重層（SLB）は、固体基材に生体適合性および生物機能性を付与しながら、膜関連プロセスの in vitroでの調査に有効に魅力的なプラットフォームです。リン脂質小胞の自発的な吸着と破裂はのSLBを形成するための最も一般的に使用される方法です。しかし、生理的条件下で、小胞融合（VF）は、脂質組成物および固体支持体のサブセットのみに限定されます。ここでは、小胞を必要としないのSLBを形成するために、溶剤支援脂質二重層（SALB）の形成法と呼ばれるワンステップの一般的な手順を説明します。 SALB方法は、水混和性有機溶媒 （例えば、イソプロパノール）とSLBの形成を誘発するために、水性緩衝液とのその後の溶媒交換の存在下で固体表面上に脂質分子の堆積を伴います。連続溶媒交換ステップはのアプリケーションを可能にします表面感受性バイオセンサーの広い範囲を使用して、二重層の形成とその後の変化を監視するのに適したフロースルー構成の方法。 SALB方法は、小胞融合に難治性であるものを含む疎水性固​​体表面の広い範囲でのSLBを製造するために使用することができます。また、ベシクル融合法を用いて調製することができない脂質組成物からなるのSLBの製造を可能にします。ここで、我々は2つ​​の例示的な親水性表面、二酸化ケイ素と金のSALBと従来のベシクル融合法を用いて得られた結果を比較します。 SALB方法により調製高品​​質の二重層を調製するための実験条件を最適化するために、成膜工程における有機溶媒の種類などの様々なパラメータの効果は、溶媒交換の速度、および脂質濃度は、トラブルシューティングのヒントと一緒に説明されています。コレステロールの高い画分を含む支持された膜の形成も悪魔です膜構成の広い範囲のためのSALB技術の技術的能力を強調し、SALB方法でtrated。

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Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

私たちは、脂質小胞を使用せずに、固体基板上にサポートされている脂質二重層を形成するための実験プロトコルを提示します。我々は、様々な生物学的用途のためのコレステロールに富むドメインと脂質二酸化ケイ素と金の二重層と同様に支持された膜を形成するために、一段階法を示しています。

溶剤アシスト脂質二重（SALB）法による生体膜の作製

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

biomembrane-fabrication-solvent-assisted-lipid-bilayer-salb

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

14.8K ビュー.  Nanyang Technological University. 私たちは、脂質小胞を使用せずに、固体基板上にサポートされている脂質二重層を形成するための実験プロトコルを提示します。我々は、様々な生物学的用途のためのコレステロールに富むドメインと脂質二酸化ケイ素と金の二重層と同様に支持された膜を形成するために、一段階法を示しています。 

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Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

生物工学

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

ミトコンドリア膜動態を再構成するためのモデル膜プラットフォーム

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

生化学

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

ポリジメチルシロキサン薄膜を用いた自動化された脂質二重膜の形成

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions under various membrane lipid compositions. Among them, the droplet interface bilayer has gained popularity; however, the large membrane size hinders the recording of low electrical background noise. We have established a contact bubble bilayer (CBB) method that combines the benefits of planar lipid bilayer and patch-clamp methods, such as the ability to vary the lipid composition and to manipulate the bilayer mechanics, respectively. Using the setup for conventional patch-clamp experiments, CBB-based experiments can be readily performed. In brief, an electrolyte solution in a glass pipette is blown into an organic solvent phase (hexadecane), and the pipette pressure is maintained to obtain a stable bubble size. The bubble is spontaneously lined with a lipid monolayer (pure lipids or mixed lipids), which is provided from liposomes in the bubbles. Next, the two monolayer-lined bubbles (~50 &#181;m in diameter) at the tip of the glass pipettes are docked for bilayer formation. Introduction of channel-reconstituted liposomes into the bubble leads to the incorporation of channels in the bilayer, allowing for single-channel current recording with a signal-to-noise ratio comparable to that of patch-clamp recordings. CBBs with an asymmetric lipid composition are readily formed. The CBB is renewed repeatedly by blowing out the previous bubbles and forming new ones. Various chemical and physical perturbations (e.g., membrane perfusion and bilayer tension) can be imposed on the CBBs. Herein, we present the basic procedure for CBB formation.

Here, we present a protocol for the formation of lipid bilayers using a contact bubble bilayer method. A water bubble is blown into an organic solvent, whereby a monolayer is formed at the water-oil interface. Two pipettes are manipulated to dock the bubbles to form a bilayer.

パッチ取り付けの連絡先バブル膜脂質二分子膜実験

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

溶剤アシスト脂質二重（SALB）法による生体膜の作製

要約

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この動画の章

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

ミトコンドリア膜動態を再構成するためのモデル膜プラットフォーム

平面支持された二分子層上の単一分子蛍光顕微鏡

ポリジメチルシロキサン薄膜を用いた自動化された脂質二重膜の形成

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

パッチ取り付けの連絡先バブル膜脂質二分子膜実験

溶剤アシスト脂質二重（SALB）法による生体膜の作製

要約

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スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

ミトコンドリア膜動態を再構成するためのモデル膜プラットフォーム

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

ポリジメチルシロキサン薄膜を用いた自動化された脂質二重膜の形成

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

パッチ取り付けの連絡先バブル膜脂質二分子膜実験

平面支持された二分子層上の単一分子蛍光顕微鏡