The authors would like to acknowledge Drs. Jonathan Reichner and Angle Byrd for cell experiment insight. The National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) supported this work.

1. 3次元金型設計と部品<ol><li>モールド<ol><li>作業を始める前に、シリコーンエラストマーキット、ライブセルイメージング室、22ミリメートルのガラスカバースリップ、および寸法10.07ミリメートルX 3.95ミリメートルX 5.99ミリメートルで加工アルミニウム金属キューブを得ます。下のホルダーにカバースリップを配置し、ベンダーの指示どおりに、チャンバの残りの部分を組み立てることにより成形用ライブセルイメージング室を準備します。 </li><li>次に、ピンセットを用いて、生細胞イメージング室ハウジングの中央にし、カバースリップの上に機械加工されたアルミニウム金属キューブを配置し、その後、脇に置きます。 </li><li>エラストマーを5mlにする製造業者のプロトコルに従ってシリコーンエラストマー溶液を混合します。 </li><li>使い捨ての実験用へらを使用して、生細胞イメージング室セットアップにシリコーンエラストマー溶液を注ぎ、置か機械加工アルミニウム金属キューブを移動しないよう保証します。硬化させるための安全な場所のO / Nで、実験台の上にシステムを配置します。 </li><li>翌朝、解体ライブセルイメージング室、メーカーが推奨する鉗子を使用して金型を引き出しています。鉗子を使用して、慎重に金型から機械加工されたアルミニウム金属キューブを抽出します。シンクに移動し、脱イオン水で金型をすすぎます。乾燥するためにペーパータオルの上に金型を配置します。 </li><li>乾燥したら、金型を介してスリットをカットし、趣味のカッターナイフを使用して、シリコーン型の内側に、それぞれの長手方向の端部から離れて2.34ミリメートルの間隔を置いて配置。あなたは、実験のためのシステムを構築する準備が整うまで、安全で乾燥した場所で、金型の滞在を確認してください。 </li></ol></li><li>親水性および疎水性ガラスカバースリップの準備<ol><li>コラーゲンマトリックスは、表面に付着できるようにするには、親水性のカバーガラスを作成します。 <ol><li>使い捨てピペットを用いて、3-アミノプロピル - トリメトキシシラン150μlのを測定し、50mlチューブ内の溶液を注ぎます。第二の使い捨てピペットを用いて50 mlチューブに100％エタノール30mlを加え、蓋を閉じます。完全な混合を確実にする、2分間溶液をボルテックス。 Pガラスシャーレ内の当社のソリューション、脇に置きます。 </li><li>第シャーレに100％のエチルアルコール15mlのを注ぎ、脇に置きます（料理を標識することを確認してください）​​。 </li><li>新しい使い捨てピペットを用いて、脱イオン水30mlを測定し、50mlチューブに溶液を注ぎます。次に、グルタルアルデヒドの1,875μLを新しい使い捨てピペットの尺度を使用して、同じ50ミリリットルチューブに溶液を注ぎ、ふたを閉じます。完全な混合を確実にする、2分間溶液をボルテックス。第三のペトリ皿に混合物を注ぎ、脇に置き。 </li><li>鉗子を使用して、1 22ミリメートルラウンドカバーガラスを取り出し、使い捨てピペットを用いて100％エタノール混合物で両面をすすぎます。 </li><li> 100％エタノール溶液皿30mlで3-アミノプロピルトリメトキシシランにリンスガラスカバースリップを置き、5分間、溶液中に座ってすることができます。 </li><li>ピンセットで、カバーガラスを取り出し、使い捨てピペットと100％のエタノール溶液で再度洗い流します。 </li><li> 1,875にすすぎ、カバーガラスをドロップグルタルアルデヒドのμlの脱イオン水の混合物の30ミリリットルと30分のために確保さ。 </li><li> 30分後、ピンセットでカバーガラスを除去し、脱イオン水ですすぎ、室温で乾燥させるために、乾燥組織O / Nの上に置きます。 </li><li>カバーガラスの浸漬を繰り返し、同じ生成ソリューションを必要な数のカバースリップのために移動します。 </li></ol></li><li>指定されたプロトコルによって、疎水性カバースリップを行います。 <ol><li>トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル500μlの酢酸100μlの2分間、50mlのチューブ、ボルテックスでヘキサン19.4ミリリットルを追加します。ガラスシャーレ内の溶液を注ぎ、脇に置きます。 </li><li>きれいな鉗子を使用して、一方のガラスカバースリップを取り出し、2分間調製した混合溶液中にドロップします。 2分が経過した後、ピンセットでカバーガラスを取り出し、室温で乾燥させるために、乾燥組織O / N上に使い捨てピペットと場所カバースリップを使用して、脱イオン水ですすいでください。使用するまでプラスチックペトリ皿に保管してカバースリップ。 </li><li>繰り返しカバースリップDIPPると同じ生成ソリューションを必要な数のカバースリップのために移動します。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.金型アセンブリ<ol><li>金型を使用する前に、使い捨てピペットを用いて、化学廃棄物容器の上に90％のエチルアルコールで金型をすすぎます。次に、脱イオン水で満たされたペトリ皿に金型を配置し、O / Nに座ることを可能にします。 </li><li>ピンセットを用いて溶液から金型を取り、型アセンブリを開始する前に、空気乾燥したタオルの上に置きます。 </li><li>金型は、空気乾燥であるが、高精度ダイヤモンドスクライブツールを使用して3.95ミリメートルX 5.99ミリメートルよりも若干大きく2つの長方形の中に正方形の親水性のカバーガラスをカット。シリコーン型にカットスロットにそれぞれカット矩形カバースリップをスライドさせます。 </li><li>逆さまに金型を反転し、使い捨てピペットを用いて、シリコーン型の底部に沿って真空グリースを塗布してください。次に、バック右サイドアップ型を反転し、円形の親水性のガラスカバーの上に型の底を押してくださいシールを作成するために、リップ。 </li><li>使い捨て手袋を使用すると、組み立てられた金型をピックアップし、使い捨てペトリ皿にした後、バイオフード内に配置します。実験が発生する前に金型を滅菌するために1時間UVバイオフードランプをオンにします。 </li></ol> 3.コラーゲン混合物と3Dマトリックス<ol><li>コラーゲン混合物、汚れを調製し、標準的なプロトコル28による撮像のための細胞を調製する前に。 </li><li>バイオフード内で、標準的な実験技術およびプロトコル29,30を使用して、所望の化学誘引物質濃度の15mlチューブに細胞培地および化学誘引物質を混ぜます。ピペット5〜15 mlのチューブに特異的な細胞メディア化学誘引物質濃度の溶液のmlおよび加熱された水浴中にソリューションを移動します。 </li><li>ピペットを使用して、顕微鏡実験のために溶液を加熱するために加熱された水浴中に第15mlチューブと場所にだけ細胞培地を5mlを抽出します。 </li><li>バイオフードでは、ピペット10×リン酸緩衝液30μlマイクロ遠心チューブにED溶液（PBS）。 15秒間同じマイクロ遠心管と渦の中に1 N水酸化ナトリウム（NaOH）の6μlを添加します。 </li><li>冷蔵庫からコラーゲンIラット尾液を取得し、標準的な実験技術およびプロトコル29を使用して、バイオフードに移動します。コラーゲンはまだ寒いであることを確認してください。同じマイクロ遠心分離管にコラーゲンの168.3μLをピペット。 </li><li>次に、同じマイクロ遠心チューブにピペットを用いて、黄緑色の蛍光カルボン酸で修飾された微小球の18μlを添加します。ボルテックスで30秒間、すべてのソリューションをマイクロ遠心管。 </li><li>マイクロ遠心管に所望の細胞培地-細胞混合物（約2×10 6細胞/ mlの濃度）の77.7μlを添加して、20秒間ピペットチップを使用して混合します。必要に応じて、蛍光ビーズと細胞生存率の表 （ 表1）の添加のために適合カスタムコラーゲンの混合物を、以下によりマトリックス密度を変化させます。 </li><li>ピペット300＆＃181;準備金型組立体の中央ウェルにコラーゲン - 細胞混合物のL（ウェル＃2）。使い捨てペトリ皿の上に金型を置き、5％CO 2で37℃で20分間の標準的なインキュベーターに移動します。 </li><li>インキュベーターからシステムを削除し、バイオフード内に戻し入れます。鉗子を使用して、各カバースリップの上部にクランプして離れて型から引き上げるとの両方によって疎水性のカバーガラスを取り外します。 </li><li>コラーゲンモールド側が平面状の拡散勾配を可能にするためにまっすぐにまだあることを確認することが望ましい顕微鏡および画像に、システム全体を移動します。 </li><li>まだ顕微鏡システム、100μlのシングルチャンネルピペットを用いて、ウェル＃1に細胞培地の100μlを添加します。次に、100μlのシングルチャンネルピペットを使用することはよく＃3に所望の化学誘引物質濃度の細胞培地の100μlを添加します。 </li><li>すぐに両方のウェルにソリューションを追加した後、撮影を開始。 </li></ol> 4.イメージングと拡散モデリング<ol><li>一つは、特定の濃度を算出するための特定のコラーゲン密度のための拡散係数を検索したい場合は、以下の手順に従ってください。 <ol><li>代わりに、所望の化学誘引物質濃度で細胞培地を生成する、標準的な計算およびプロトコル30を使用して、15mlチューブに5μMローダミンを作る」、コラーゲン混合物と3Dマトリックス」というタイトルの上に特定のプロトコルに従ってください。 </li><li>共焦点画像システムを用いた3次元コラーゲンマトリックスは、蛍光を捕捉するために、アルゴンレーザー（488 nm）を用いて、倒立顕微鏡に取り付けられました。画像を最大7時間毎に2または3秒。 </li></ol></li><li>拡散モデルの場合：以下に示す数学的モデルを使用して、これらの一般的な手順で処理及び分析のための計算ソフトウェアのコードを記述します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq1.jpg" /><ol><li>最大INTENによる再スケーリングおよび正規化のための計算ソフトウェアにインポートするイメージsity。エッジを選択するには、画像のグレーカラーマップに画像を変換します。中央の右、中央の左側に、画像の中心に沿って軸をピックします。 </li><li>計算ソフトウェアコードを使用して、真の強さと両者の差とともに、規格化強度をプロットします。 </li><li>フィッティング（濃度、時間、及び長さ）のために必要な次に、入力パラメータ。 </li><li>時間に対する正規化濃度とデータへの多項式フィットを使用して、x軸の両端の濃度プロファイルをプロットします。 </li><li>計算ソフトウェアコードを使用して拡散係数を計算します。 </li></ol></li></ol> 5.実験測定<ol><li>拡散方程式に戻って、以下に示すように、システム内の任意の位置での特定の濃度を見つけるために方程式を書き換えます。 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq2.jpg" /> ここで、 目のL =長さEコラーゲンマトリックス 調査中のx =場所 拡散のD =係数 T =経過時間</li><li>走化性実験の間、瞬間ケモカインがシステムに追加された特定の時刻を記録するために確保します。細胞移動の動きが検出されると、共焦点タイムラプス撮影を記録し、撮影が発生したエッジから特定の時間と場所をメモすることを確認します。 </li><li>データ分析の間に、拡散や細胞実験の両方のためのコラーゲン内の任意の点での正規化された特定の濃度を見つけるために、式に特定のセルのために注目の経過時間、場所及び拡散係数を差し込みます。 </li></ol> TFMを利用6.追跡細胞の遊走<ol><li> TFM / DVC法は、以下のプロトコルに従う使用して細胞の移動を追跡します。 <ol><li>よく＃3への所望の化学誘引物質の濃度を添加した後、反転MICRに搭載された共焦点システムと3Dコラーゲンマトリックスを画像化開始調査するセルを見つけるoscope。 </li><li>移動する細胞が検出されると、視野の中央にセルを配置し、（z軸における画像）が、圧電モーターを利用し、画像毎に1または2分。 </li><li>細胞力発生と変形を計算するために、TFM / DVCプロトコル31次蛍光ビーズの変位を見つけるために、計算コードを生成します。 </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

細胞の有無にかかわらず成功した拡散実験のための最も重要な手順は次のとおりです。正しくモールドアセンブリを設定します。疎水性のカバーガラスの抽出時の損傷を防止するために必要な手先の器用さを開発します。正しく拡散係数を算出するための非常に良好な直線スタートラインを見つけることを保証します。コラーゲンと化学誘引物質の両方の実験的な計算を修正。正しく乾燥しない行列を確保するために、ライブセルイメージングシステムの使用;と滅菌、健全な文化を維持します。 拡散実験を行う場合には、拡散プロットは線形拡散モデル（ 図4）の伝統的な形状と一致していることを確認することが不可欠です。 Taの中に報告されているように、各サンプルについて、いくつかの異なるX位置での解析を実行し、それは、コラーゲンの様々な濃度のローダミンための拡散係数の平均値を計算することが可能です<html> BLE 2。コラーゲンの濃度は、マトリックス中の気孔率の増加による減少としてこれらの結果は、コラーゲンゲルの減少を介して拡散の先行研究係数と一致しています。 定常状態での拡散モデル式によれば、一つはxの値を横切る直線濃度プロファイルを有することを期待します。ポイントへの一次関数をフィッティングすることにより、彼らは、実際には、すべての線形であることがわかります。 3コラーゲン濃度に最適なラインのそれぞれのための線形トレンドラインを当てはめるのR 2値は0.92で、または上回りました。すべての外挿されたプロットにおける残差のノルムは、良好なフィット感を示し、0.0227でした。この線形関係は、解析解と一致します。イメージングは​​、コラーゲンサンプルのエッジで直接開始していないため、濃度は、予想されるように、100％で開始されません。それは完全にイメージングを校正することは不可能です。 _contentは &quot;&gt;さらに、我々は結果を比較するゲル中で拡散を見た他の論文を参照することができました。シェノイとローゼンブラットは、2.2×であることが30 mg / mlのスクシニル化コラーゲン溶液にBSA（半径= 4 nm）での拡散係数を発見しました10 -7 cm 2の /秒32。ローダミンの半径は、コラーゲン24を通じて速く拡散時間を説明0.78 nmである。拡散の研究では、分子を比較するための半径を利用するのが一般的である。半径が増加するにつれて、分子量また増加する。ラマヌジャンら 4.72×10 -8 cm 2の /秒24であることが重合の20％コラーゲンゲル（2.0 mg / mlの濃度でゲルに相当）にデキストランの拡散係数（= 6nmの半径）を発見した。この場合も、我々は考慮に分子サイズの差を取る場合、これは、（D = 1.28×10 -6 cm 2で/秒）我々は2.0 mg / mlの濃度のゲルについて観察された拡散係数に匹敵する。LeddyとGuilakスタッド関節軟骨33を介してデキストランの拡散をIED。関節軟骨の質量の約2/3は、ポリマー、コラーゲン（主にタイプII）であるので、コラーゲンマトリックスを通って関節軟骨を通って拡散するのを比較することが可能です。 LeddyとGuilakは6-10×10 -7 cm 2で/秒33の間になるように、関節軟骨を介して3 kDaのデキストランの拡散係数を発見しました。システムが正常に動作していることを知って、私たちはその後、のこぎり波と過渡システムの熱伝達モデルを使用して、システム内の任意の場所の特定の濃度を算出することができました。この追加のメトリックは、細胞濃度の理解と傾斜勾配を追跡するために細胞実験の間に使用することができます。 我々のアプローチを使用した場合の実験の持続時間が制限要因であり得ます。したがって、マトリックスが乾燥しないようするために、生細胞イメージングシステムのためのカバーを使用することが重要です。 experimen中にカバーを使用してTSは、我々が正常にゲル乾燥アップなしの細胞実験中に7時間と4時間までのローダミンの拡散を監視することができました。 1カバーを使用しない場合、ゲルはより速く乾燥し、大幅に細胞の拡散および移動に影響を与える可能性があります。 本明細書に記載のプロトコルは、走化性中の3D環境で細胞の力を測定することができるように十分に制御された平面状の拡散モデル/システムを使用します。ここでは、TFM / DVC実験に利用することができる新しく開発されたシンプルなシステムを提案します。このシステムを使用して、研究者はことができるようになります。解析式にデータをフィットさせることにより、1）が正常に3Dコラーゲンマトリックスを介して拡散をモデル化して検証し、その平面勾配拡散システム、細胞を播種した場合には、走化性およびないケモキネシスを促進すべきです。 2）5異なる濃度のコラーゲンのための拡散係数を算出します。および3）が正常にディ内の化学誘引物質の特定の濃度を見つけますffusion室。これが近づくと、人はさらに多面システムや複雑な拡散勾配の面倒なアプローチがないわけではない、簡単かつ容易に利用可能な特定のメトリックを持つ細胞走化性を調べることができます。

走化性として知られている濃度勾配に向かう細胞の好ましい運動は、体内の病理学的および生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。このような例は、皮膚および粘膜創傷治癒1、形態形成2、3、炎症、および腫瘍増殖4,5です。また、癌細胞の両方の個々と集合細胞遊走戦略6を通って移動することができることが示されています。また、拡散不安定機構は腫瘍体/オブジェクトから単一またはクラスタ化された細胞の分離を誘導することができ、その後、栄養源に向かって移住し、したがって、より広い領域や組織7に侵入することができます。 また、多様な移動機構が原因で接着分子8の異なる役割に、2Dおよび3Dで活性であることが示されています。 measureablで細胞の運動性を調査するin vitroアッセイにおける生理学的に関連するので、移動e及び簡単な方法は、細胞運動現象9の理解に重要です。残念ながら、細胞の移動を分析することの困難は、総合的な定量化可能な走化性アッセイは、通常、公平な細胞の運動性と輸送現象モデルの測定に設立され、長い骨の折れる方法を、必要とします。 細胞走化性を調査する過去の実験的アプローチは、Boydenチャンバー10と下のアガロースアッセイ11を含みます。しかし、これらの初期のアッセイ内で、細胞遊走実験は、時間に対しての動きを監視していませんでした。もっと、重要なのは、実験に用いた濃度勾配が十分に定義されていないか、わずか数時間を超えないためのシグナリングを維持しつつ、完全に理解しました。また、初期の走化性チャンバーの試みは2次元に細胞移動を制限し、1つは、移行12の動態を監視することはできませんでした。 Boydenチャンバーを見ると、エンドポイントアッセイ研究者が視覚的に移行を観察することができず、直接ケモキネシス（ランダム移動）から走化性（方向性）を区別することができませんでした。また、孔径、厚さ、いくつかの変数の違いを容易に再現することは非常に困難チャンバ膜が製およびケモカイン13,14への細胞の移住反応を隠し。 マイクロフルイディクスの新しい理解して、新しいチャンバ及びマイクロデバイスは、間質流動条件または走化性15,16の下のセルの移動を調査する手段として研究されてきました。これらの新しいデバイスの下では、新しいセルのメトリクスを導入し、細胞17,18のせん断応力の影響のように、調査しました。残念ながら、過去と現在のマイクロ流体走化性チャンバー2D基板 - 腫瘍細胞の浸潤や転移を含む多くの生物学的プロセス、以来重要な後退に細胞移動の研究を制限され、イム胸細胞の移動は、3D移動を伴います。 直接観察室、化学誘引物質溶液が細胞を含む三次元ゲルと接触しても、また19,20が報告されています。これらのチャンバは、2つの区画、化学誘引物質および細胞を含むいずれかを含むものを持って、互いに水平方向に21または同心円状のリング22と横に結合されています。これらのシステムは、正しい方向に指摘されているが、長期間走化性システムを保持しません。 さらに、研究者はまた、透析細胞、ならびに静水圧23〜25にかけコラーゲンサンプルを介してトレーサー分子の拡散にコラーゲン膜を通した拡散性を検討しました。コラーゲンゲルの一部の拡散実験は、磁場および化学取込み26を用いたゲルの物理的および化学的修飾に依存しています。コー​​ラで拡散をモデル化するための一般的な方法genous組織が連続点光退色の蛍光イメージングに依存しています。この方法は、指向膠原組織における高分子の拡散係数に異方性を明らかにしました。しかし、光退色は、関節軟骨ではなく、コラーゲンマトリックス中で使用されています。類似の間、必要なモデリング実験は、具体的にコラーゲンゲルの拡散係数を理解することを通して実施しなければなりません。さらに重要なことに、システムは、セル力発生を測定するための方法を利用しません。 マトリックスを通して細胞トラッキング、走化性因子と拡散勾配の理解を可能にする、再現性の容易さと、比較的簡単なセットアップ、の最小化：残念ながら、ほとんどのシステムでは、理想的なシステム用に1つまたは2つの重要な要素が欠けているように見えます細胞-細胞相互作用、および定量化のための寸法の単位を測定する能力（ 例えば 、速度、力、特定の濃度）。 Moghe ら。 </eM&gt; 図27は 、細胞を最初にゲル全体に分散よりもむしろフィルタ表面に濃縮されたこれらの要件のほとんどを満たしシステムを提案したが、セルが生成する力を測定することは困難でした。 この目的のために、我々は細胞を測定するために、画像解析技術を用いて結合された1つは、タイムラプス顕微鏡検査に基づいて、既存のアッセイの現代の拡散室の制限を克服することを可能にする3次元コラーゲンマトリックスに走化性を調査する平面勾配拡散システムを提示します3D環境の力。このプロトコルは、異なるセル内の3D走化性を研究するために使用することができる単純な3D拡散室を作成するシンプルで革新的な方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>Silicone elastomer kit</td><td>Dow Corning Corp</td><td>182 SIL ELAST KIT .5KG</td><td>a two-part misture with a 10:1 mix</td></tr><tr><td>Live cell imaging chamber</td><td>Live Cell Instrument</td><td>CM-B18-1</td><td>CMB for 18&amp;nbsp;mm round coverslips</td></tr><tr><td>22&amp;nbsp;mm Glass Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0180281</td><td>Neuvitro Corp. cover slip 22&amp;nbsp;mm 1.5</td></tr><tr><td>Machined aluminum metal cube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hobby utility knife</td><td>X-Acto</td><td>X3201</td><td></td></tr><tr><td>3-(aminopropyl) trimethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00216A-10</td><td>Glutaraldehyde, EM Grade, 8%</td></tr><tr><td>50 ml tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Standard floor model and tabletop centrifuges</td></tr><tr><td>Glass Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A</td><td>Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15&amp;nbsp;mm)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td>Fine Point Forceps</td></tr><tr><td>Cover glasses</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-105A</td><td>Rectangle; 30 x 22&amp;nbsp;mm; Thickness No. 1</td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Acetic acid ACS reagent, &amp;ge;99.7%</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td>anhydrous, 95%</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof, for molecular biology</td></tr><tr><td>High-precision diamond scribing tool</td><td>Lunzer</td><td>PV-081-3</td><td>Straight extended tip scribe, .020&quot; (.50&amp;nbsp;mm) diameter by .200&quot; (5.0&amp;nbsp;mm) tip length</td></tr><tr><td>Vacuum grease</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5C</td><td>High-Vacuum Grease</td></tr><tr><td>15 ml tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface</td></tr><tr><td>10x phosphate buffered solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td>1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer</td></tr><tr><td>1&amp;nbsp;N sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38215</td><td>Sodium hydroxide concentrate</td></tr><tr><td>Collagen I, rat tail</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>Rat tail&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micro centrifuge tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-332</td><td>Volume: 2.0 ml; &lt;br /&gt;O.D. x L: 13&amp;nbsp;x&amp;nbsp;40&amp;nbsp;mm; &lt;br /&gt;sterile; single-wrapped</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Carboxylate-modified microspheres</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;F-8813</td><td>Carboxylate-modified microspheres, 0.5 &amp;micro;m, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids</td></tr><tr><td>Rhodamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83689</td><td>Rhodamine B for fluorescence</td></tr></tbody></table>

planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3d collagen matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

正確に細胞の遊走を評価するために、このアッセイの能力は、システムの良いセットアップに依存しています。したがって、それは正確に拡散系の金型を設計し、 図1に示すように、疎水性および親水性の両方のカバーガラスを配置することに細心の注意を払うようにしてください非常に重要です。システムが適切に設計されており、非常に見つけることが確実に拡散モデリング段階でされている場合良好な直線スタートライン、一つは素晴らしい達成することができるシステムの普及を分析するために、 図2に示すように、画像を蛍光を発します。 成功した細胞走化性分析するための鍵は、拡散をモデル化し、計算ソフトウェア生成されたコードを介して拡散し、特定の濃度の方程式の係数を見つけるために、一般的な拡散方程式を解いています。計算ソフトウェアに画像をインポートし、分析（ 図3）を実行した後、拡散係数（ 表2）を評価することができる。 図4を 5試験したコラーゲン濃度を通してローダミンの拡散のプロットを表します。拡散プロットの形状が直線状の拡散モデルの伝統的な形状と一致しています。これは、ローダミンの拡散がコラーゲン低いコラー​​ゲン濃度速い拡散の濃度に反比例することがわかります。コラーゲンのこの濃度は、より高い気孔率を有し、これは、予想されます。 1.5ミリグラム/ mlの（ 図4B）の濃度のコラーゲン拡散プロットにおける水平線は単にトレーサー信号の飽和オーバーの結果です。 図4に示すように、さらに重要なことは、それぞれの行は、時間正規化濃度は決して化学のない反転がないことを示す、同じ時間（DT）における前の点を超えない増加し、一方に、コラーゲン内部の特定点（x、y）を表します。これは、CHEの重要な特性でありますmotaxis室が逆流することなく、化学誘引物質の直接的な流れを可能にします。 各x位置で最後の10の画像を調べることで、一箇所の各々でローダミンの定常状態濃度のプロットを生成することができます。サンプル全体を見るために試料全体の長さ（ 図5）、1缶全体に外挿することによって。これは、線形拡散勾配が細胞実験（ 図6）のために利用することができるサンプル全体の長さ、全体で一貫していることを示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52948/52948fig1.jpg" /> 図1：生細胞イメージングチャンバー内の平面勾配拡散システム型アセンブリの概略 （1）（下から上へ）から成る、完全なシステムのコンピュータ表現を底部ハウジング（C）親水性の22ミリメートルのカバーガラス、金型、。トップハウジングと、ガラスカバー。 （2）MOの寸法<html> （a）は、インサートカットLDが示されています。 （3）（b）の各側に疎水性のカバーガラスは、3ウェルシステムを作成するために、切断されたインサートに滑り込ませると、コラーゲンマトリックスと金型。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52948/52948fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52948/52948fig2.jpg" /> 図2：コラーゲンにおけるローダミン顕微鏡画像の例 1.0 mg / mlのコラーゲン濃度を有する平面勾配拡散システムでは、同じz軸位置で、ローダミン拡散実験中に撮影した代表的な画像。 （a）は、0分（B）3分間（c）は7分である、および（d）ローダミン後15分がチャンバに追加されたスケールバー=500μmです。矢印は、コラーゲンマトリックスを介してローダミンの拡散の方向を示しています。e.com/files/ftp_upload/52948/52948fig2large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52948/52948fig3.jpg" /> 図3：初期（DT = 0）画像の解析および2.5 mg / mlのコラーゲン濃度の計算ソフトウェア·コードによって生成された拡散計算の要約の例（A）黒と白のレンダリングは、分析のための計算ソフトウェアにアップロードしました。強度比較のための拡散計算のためにユーザによって選択された（B）特定の点（X、Y軸はピクセル単位です）。 （C）各ラインは、定常状態でのコラーゲンマトリックス全体ローダミンの画像B.（D）の濃度プロファイルの赤い点に相関コラーゲンマトリックス全体ローダミンの拡散プロファイル。平滑化されたデータとの間の（E）の比較（ブルーレイ平滑化と真の（緑の点）との差に拡散実験（赤い点）から電子ドット）と真のデータ。 （F）真（赤点）の正規化濃度と嵌（緑の点）実験を通して計算ソフトウェアコードからのデータ。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52948/52948fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52948/52948fig4.jpg" /> 図4：異なる点で平面勾配拡散方式を用いたコラーゲンマトリックスを介して拡散プロファイルの例は、各行は、ユーザが計算ソフトウェアコードから選択される異なる選択されたデータ点を示しています。 （A）は1.0mg / mlの（B）1.5 mg / mlの（C）2.0 mg / mlの（D）2.2 mg / mlのとの密度でコラーゲンマトリックス（E </st<html>栄&gt;）の2.5mg / mlである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52948/52948fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52948/52948fig5.jpg" /> 図5：定常状態での平面勾配拡散方式を用いたコラーゲンマトリックス全体ローダミン濃度（正規化）プロファイルの例サークルは、ユーザが計算ソフトウェアコードかかわらず選択された特定のデータポイントです。赤い線は、全体のコラーゲンマトリックス全体ローダミン濃度を表示するためにデータポイントを使用し、（図示R 2の値で）ベストラインフィットを外挿する構築しました。 （A）は1.0mg / mlの（B）（C）が2.0mg / mlの（D）2.2 mg / mlとし、（E）2.5 mg / mlの1.5ミリグラム/ mlの密度でコラーゲンマトリックス。2948fig5large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52948/52948fig6.jpg" /> 図6：細胞遊走実験の例 3D平面勾配システムに移行する好中球のZスライス顕微鏡画像。好中球は、星は、実験開始時の細胞の初期位置を示す化学誘引物質勾配（白矢印は勾配の方向を示し、三角形は、その濃度プロファイルを示している）、に向かって移動します。サブプロットは、矢印は次時刻の方向を示す3次元空間内のセルを示しています。 =10μmのスケールバー。画像間のDT = 5分（ すなわち、A-B）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52948/52948fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspaciNG = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> コラーゲン細胞密度 </td><td> PBS </td><td> 蛍光ビーズ </td><td> のNaOH </td><td> コラーゲンIラットテール </td><td> メディア </td></tr><tr><td> 2.5 mg / mlの</td><td> 10％ </td><td> 6％ </td><td> 2％ </td><td> 70.20パーセント</td><td> 11.80パーセント</td></tr><tr><td> 2.2 mg / mlの</td><td> 10％ </td><td> 6％ </td><td> 2％ </td><td> 61.70パーセント</td><td> 20.30パーセント</td></tr><tr><td> 2.0 mg / mlの</td><td> 10％ </td><td> 6％ </td><td> 2％ </td><td> 56.10パーセント</td><td> 25.90パーセント</td></tr><tr><td> 1.5 mg / mlの</td><td> 10％ </td><td> 6％ </td><td> 2％ </td><td> 42.10パーセント</td><td> 39.90パーセント</td></tr><tr><td> 1.0 mg / mlの</td><td> 10％ </td><td> 6％ </td><td> 2％ </td><td> 28.10パーセント</td><td> 53.90パーセント</td></tr></tbody></table> 表1：カスタムC蛍光ビーズと細胞生存率の付加のために適合ollagen混合物。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr><td> コラーゲンゲルの濃度 </td><td> 拡散係数（cm 2の /秒） </td></tr><tr><td> 2.5 mg / mlの</td><td> 1.03×10 -6 2.54×10 -7± </td></tr><tr><td> 2.2 mg / mlの</td><td> 1.28×10 -6 3.53×10 -7± </td></tr><tr><td> 2.0 mg / mlの</td><td> 6.48×10 -6 1.66×10 -7± </td></tr><tr><td> 1.5 mg / mlの</td><td> 1.05×10 -5 2.04×10 -7± </td></tr><tr><td> 1.0 mg / mlの</td><td> 1.39×10 -5 1.06×10 -7± </td></tr><tr><td>水</td><td> 1.50×10 -5 </td></tr></tbody></table> 表2：拡散係数 。

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Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

3Dコラーゲンマトリックス中の走化性を調査するために、平面グラデーション拡散システム

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K ビュー.  California State University, Long Beach. Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

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Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

生物工学

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

同心円状のゲルシステムは、3D細胞移動に対するマトリックスの微小環境の生物物理役割を研究する

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil migration and chemotaxis owing to their advantages in real-time visualization, precise control of chemical concentration gradient generation, and reduced reagent and sample consumption. Recently, a growing effort has been made by the microfluidic researchers toward developing integrated and easily operated microfluidic chemotaxis analysis systems, directly from whole blood. In this direction, the first all-on-chip method was developed for integrating the magnetic negative purification of neutrophils and the chemotaxis assay from small blood volume samples. This new method permits a rapid sample-to-result neutrophil chemotaxis test in 25 min. In this paper, we provide detailed construction, operation and data analysis method for this all-on-chip chemotaxis assay with a discussion on troubleshooting strategies, limitations and future directions. Representative results of the neutrophil chemotaxis assay testing a defined chemoattractant, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), and sputum from a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patient, using this all-on-chip method are shown. This method is applicable to many cell migration-related investigations and clinical applications.

This article provides the detailed method of performing a rapid neutrophil chemotaxis assay by integrating the on-chip neutrophil isolation from whole blood and the chemotaxis test on a single microfluidic chip.

血液滴からの迅速な好中球走化性解析のためのオールオンチップ法

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

免疫・感染学

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

化学的集団移動のためのマイクロ流体学と統合された牽引顕微鏡

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a chemical. Chemokinesis and chemotaxis are fundamental for the mobilization and deployment of immune cells. For example, chemokines (chemotactic cytokines) can rapidly recruit circulating neutrophils and monocytes to extravascular sites of inflammation. Chemoattractant receptors belong to the large family of G protein-coupled receptors. How chemoattractant (i.e., ligand) gradients direct cell migration via G protein-coupled receptor signaling is not yet fully understood. In the field of immunology, neutrophils are popular model cells for studying chemotaxis in vitro. Here we describe a real-time two-dimensional (2D) chemotaxis assay tailored for mouse resident macrophages, which have traditionally been more difficult to study. Macrophages move at a slow pace of ~1 &#181;m/min on a 2D surface and are less well suited for point-source migration assays (e.g., migration towards the tip of a micropipette filled with chemoattractant) than neutrophils or Dictyostelium discoideum, which move an order of magnitude faster. Widely used Transwell assays are useful for studying the chemotactic activity of different substances, but do not provide information on cell morphology, velocity, or chemotactic navigation. Here we describe a time-lapse microscopy-based macrophage chemotaxis assay that allows quantification of cell velocity and chemotactic efficiency and provides a platform to delineate the transducers, signal pathways, and effectors of chemotaxis.

Here we describe methods using time-lapse, phase-contrast microscopy to image mouse resident peritoneal macrophages in a chemotactic complement C5a gradient. The protocols can be extended to other immune cells.

マウスマクロファージ・ケモタクシスのタイムラプスイメージング

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

神経系発達中の軸の成長と挙動を解析する3Dコラーゲンベースのヒドロゲルの生成

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

神経科学

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

イメージングGタンパク質共役型受容体媒介走化性及び好中球様HL60細胞におけるそのシグナル伝達のイベント

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...