この作品は、とShanghaiTech大学、上海、中国（DP1CA174426カルロスF.バルバスへ）（JL）の国立衛生研究所によってサポートされていました。分子グラフィックスはPyMOLをを使用して生成された。

1.クローニング<ol><li>をpET-28の発現ベクター系にサブクローン化し、要求（PET-2F-ZIF）承りますされてきたアラニン置換二本指ZIFドメインを取得します。34 </li><li> PCRはプライマーを用いて、プラスミドエメラルド-のpBADからEmGFPを増幅5 &#39;のXmaI-EmGFP（5&#39;-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3&#39;;太字でXmaIで I部位）および3 &#39;のSacI-EmGFP（5&#39;-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3&#39; ;太字のSacI部位）。 <ol><li>蒸留/脱イオン水で構成された残りの容量は100μlの溶液中で鋳型DNA 5ngの、10×ポリメラーゼバッファー、Taq DNAポリメラーゼの1単位（U）、0.2mMの10μlの各dNTP、各プライマー、0.2μMを使用。サイクル条件を使用してください：95℃、5分間。 1分30秒、72℃30秒間、55℃、95℃の30サイクル; 10分間72℃である。ゲルextractiによってPCR産物を精製し上とABS 260×50 / mlの測定分光光度計を用いてDNA濃度を決定する。 </li></ol></li><li>ダイジェストをpET-2F-ZIFおよび1μgのDNAあたりの酵素10 Uを使用して、37℃で3時間のための推奨バッファ内の制限酵素XmaIで IとSacIでEmGFPをコードするインサート。臭化エチジウム等の蛍光インターカレート色素を用いたアガロースゲル電気泳動によりDNAを可視化する。 </li><li>ゲル抽出キットによって消化されたDNAを精製し、腹筋260×50 / mlのを測定する分光光度計でDNA濃度を決定する。 </li><li> RTで少なくとも1時間のT4 DNAリガーゼの1 Uを用いたPET-2F-ZIFの50-100 NGに精製されたEmGFPをコードするDNAを連結。 1のインサート·ベクターのモル比：最高の結果を得るには、6を使用してライゲーション反応を行う。 </li><li>氷の上の任意の化学的にコンピXL-1ブルー大腸菌細胞50μlを解凍し、連結し、pET-2F-ZIF-EmGFPの10-20 NGで軽く混ぜる。 </li><li> 3氷上で保管してください0分。 90秒間、42℃でヒートショックの混合物を、振とうしながら37℃で1時間、異化代謝産物抑制（SOC）とスーパー最適ブロスの2ミリリットルで細胞を回収する。 </li><li> 50μg/ mlのカナマイシンを含むLB培地（LB）寒天プレート上に回復培養物100μlを広げ、37℃でO / Nインキュベートする。 </li><li>翌日、スーパーブロス（SB）または50μg/ mlのカナマイシン、37℃でLB寒天プレート培養O / Nから1つのコロニーとを含むLB培地6mlの接種。 注：コロニーPCRプライマー5 &#39;のXmaI-EmGFPおよび3&#39;を用いてのSacI-EmGFPをミニプレップする前に、陽性クローンを同定するために使用することができる。 </li><li>ミニプレップによりたpET-2F-ZIF-EmGFPを精製し、T7プロモーターを用いてDNA配列決定によりプラスミドを確認し（5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;）。 </li></ol> 2.発現および精製<ol><li>化学的にコンピテントBL21 E.50μlの解凍氷の上で大腸菌の細胞およびPLをpET-2F-ZIF-EmGFP 100ngので軽く混ぜるasmid。ステップ1.7から1.8に記載されているように変換します。 </li><li>翌日、単一コロニーを50μg/ mlのカナマイシンを含むLB培地10mlに接種し、振盪しながら37℃でO / Nを成長させる。 </li><li>翌日、50μg/ mlのカナマイシン、0.2％グルコースおよび100μMのZnCl 2を補充したLB培地1L中にO / N培養物を10mlに希釈。 0.8の600nmで（OD 600）での光学密度に振とうしながら37℃で培養物を成長させ、2 mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を用いてタンパク質発現を誘導する。 37℃での増殖の6時間後に、4℃で10分間、5000×gでの遠心分離により収穫細胞。 注意：誘導条件は非常に可変であり、発現しているタンパク質の安定性に依存します。 0.8のOD 600に達するまでOD 600を 30分ごとに監視します。 </li><li>溶解緩衝液5ml（50mMトリス-HCl、500mMのNaCl中で細胞ペレットを再懸濁し、100μMのZnCl 2を 、1メートルMジチオスレイトール（DTT）、1mMのMgCl 2、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、および10 mMイミダゾール、pHは8.0）。溶解以下の設定で超音波処理することにより氷上で細胞：/ 10秒オフの間隔で5秒で50％の電力出力、4分の処理時間。ソリューションの過熱を防ぐ。 </li><li> 4℃で30分間25000×gで細胞溶解物を遠心分離し、新鮮な収集チューブに上清を移す。最良の結果を得るには、4℃でのすべての次の手順を実行します。 </li><li>平衡化されたNi-NTAスラリーの1ミリリットルで予め充填したカラムに上清を実行します。洗浄緩衝液を20ml（50mMトリス-HCl、500mMのNaCl、100μMのZnCl 2、1mMのDTT、1mMのMgCl 2、30 mMイミダゾール、pH8.0）で樹脂を洗浄する。 </li><li>溶出緩衝液5ml（50mMトリス-HCl、500mMのNaCl、100μMのZnCl 2、1mMのDTT、1mMのMgCl 2、300 mMイミダゾール、pH8.0）でタンパク質を溶出する。 </li><li>バッファは、ストレージ·バッファーで溶離したタンパク質（50mMの交換をトリス-HCl、500mMのNaCl、100μMのZnCl 2、1mMのDTT、1mMのMgCl 2、10％グリセロール、pH8.0）で、製造業者の説明書に従って遠心分離によってスピン濃縮器を用いて、少なくとも40μM、タンパク質を濃縮する。 </li><li> BCAやBradfordアッセイによりタンパク質濃度を決定します。 、2μlの2×SDS-PAGEローディング色素で精製タンパク質を2μlを混合し、10分間95℃で沸騰した後、タンパク質純度（ 図2）を評価するために、4％-20％トリス-グリシンSDS-PAGE上で解決する。 </li></ol> 3.タンパク質貯蔵<ol><li>濃縮タンパク質、-80℃で液体窒素とストア内のフラッシュ凍結アリコート。 EmGFP融合タンパク質については、光からタンパク質を保護するためにアルミホイルでチューブをカバーする。 </li><li>タンパク質溶液の凍結融解の繰り返しは避けてください。注意：ZIF融合タンパク質は、少なくとも1ヶ月間、これらの条件下で安定である。不適切または&gt; 4月のストレージがつながる可能性タンパク質沈殿またはEmGFPの光退色に。 </li></ol> 4.タンパク質導入<ol><li> 10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）および1％抗生物質-抗真菌37℃、5％CO 2に完全に加湿雰囲気中を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でHeLa細胞を維持する。 注：細胞は30倍以上のタンパク質導入のために推奨されていません継代した。 </li><li> 25℃で30から60分間ポリリジンを50μg/ mlの500μlのプレコート24ウェルプレート。ウェルあたり2×10 5細胞の密度で24ウェルプレート上にシード細胞。播種後24時間で、または細胞に一度80パーセント-90％コンフルエントの間にある、各ウェルから培地を除去し、予め温めておいた無血清DMEM（SFM）を500μlで洗浄する。 </li><li>各ウェルに、ZIF-EmGFPタンパク質及び100μMのZnCl 2の2μMを含むSFMの250μlを添加する。 1時間37℃で細胞をインキュベート。注意：ZIFドメインが細胞に入るPRimarilyエネルギー依存性機構であるマクロピノサイトーシス、34を介して。したがって、細胞は、効率的なタンパク質の内在化のために37℃でインキュベートされなければならない。 </li><li>細胞から培地を除去および0.5mg / mlのヘパリンを補足したカルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝食塩水（DPBS）500μlで3回洗浄する。注：ヘパリン下流分析を複雑にする可能性があり、表面に結合したタンパク質を除去する必要がある。 </li><li>強化された配信のための3回まで（オプション）を繰り返しトリートメント。 </li><li>すぐに2分間37℃で、0.05％トリプシン-EDTAを用いて消化することにより洗浄した後、ヘパリン処理した細胞を単離する。 1％FBSを補充したDPBS 0.5mlに剥離した細胞を再懸濁する。 </li><li>フルオレセインイソチオシアネート（FITC）チャンネル（ 図3）を用いてフローサイトメトリーにより35を 、各サンプルの蛍光強度を測定する。の人口を配置する前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）を調整異なる特性を持つ集団が相互に解決されることを保証する規模の利息、。 </li><li> SFMのみで処置した細胞にZIF-EmGFPで処理したHeLa細胞から36ノーマライズ蛍光を、各サンプル10,000ライブイベントを収集し、フローサイトメトリーデータ分析ソフトウェアを用いてデータを分析する。 </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+Aart,+a+designed+six-finger+zinc+finger+peptide,+bound+to+DNA.">Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA.</a> J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

ここでは、細胞透過性のジンクフィンガー（ZIF）ドメインを用いてタンパク質送達のためのステップバイステップのプロトコルが提供される。 ZIFドメインは、融合した、酵素貨物34の活性を低下させない。非修飾タンパク質で観察されるものとほぼ同じ収率でのタンパク質の産生および精製を可能にする。そして伝統的な細胞透過性ペプチドまたはタンパク質導入ドメインシステムを超える効率を有する広範囲の細胞型にタンパク質および酵素を輸送することができる。まとめると、これらの知見は、広範囲の用途のための細胞への直接タンパク質送達を媒介するためのZIFドメインの幅広い可能性を示している。 最大のタンパク質の送達は、以前より大きな正電荷を運ぶ3および4フィンガーZIFドメインの配列を延長にもかかわらず、唯一の二本指ZIFドメインを使用して達成された。これらの知見は、ZIF媒介細胞侵入、電荷、株式会社以外の要因によって影響されるかもしれないことを示すタンパク質の安定性または配座剛性をluding。 ZIFドメイン媒介性タンパク質の送達はまた、エネルギー依存性であることが見出され、従って、タンパク質で処置した全ての細胞を37℃でインキュベートされることを必要とした。様々なエンドサイトーシス経路の小分子阻害剤の使用を介して、マクロピノサイトーシス、およびより少ない程度のカベオリン依存性エンドサイトーシスに、ZIF媒介性細胞侵入のための主要な経路であると決定された。34は特に、他のタンパク質伝達システムとは異なり、ZIFドメインである効率的に、溶融高分子カーゴの細胞質ゾルデリバリーの高いレベルを媒介するためにエンドソームのエスケープ強固なタンパク質の送達を達成するためにこれらのドメインの可能性を強調することができる。 我々の経験では、細胞の播種密​​度は、タンパク質形質導入の高いレベルを達成するための重要なステップである。我々は、彼らが80％〜90％の密集度に達すると、細胞を治療し、以前に観察することをお勧めその&gt; 95％の集密度ショーのサブで播種細胞最適な形質導入能力、細胞は低密度で播種しながら（&lt;50％）のタンパク質によって誘導される毒性の影響を受けやすい。重要なことには、高い剥離傾向を有する細胞型のため、ポリ - リジンでプレコーティング細胞培養プレートを推奨している。ポリリジンは、負に荷電した細胞表面成分との静電相互作用を介して細胞接着を促進する。各ZIFドメインのαヘリックスDNA結合残基は、DNA認識のためのあらゆる可能性を排除するために除去されているが、ΒΒαのZIFドメインの折り畳みを安定させるためのZn 2+イオンとの調整システイン及びヒスチジン残基がそのまま残る。したがって、我々は、任意の記憶バッファは、タンパク質の完全性を維持するためのZnCl 2の少なくとも100μMで補足することをお勧めします。 ZIFドメインは以前に、様々な細胞型にタンパク質および酵素を提供することが示されたが、ZIF送達の効率は、両方のmacromoに依存する可能性があるキュラ貨物タンパク質濃度。例えば、細胞は、2つの指ZIF - ルシフェラーゼ融合タンパク質で処理した細胞は、二本指で処理しながら、より高い濃度で活性低下を、0.5μMタンパク質で処理したときに最大発光を示すことが観察されたEmGFP蛍光の用量依存的増加を示した8.0μMタンパク質まで、連続タンパク質トリートメントの際に強度。したがって、我々は、濃度範囲全体でそれぞれの固有のZIFドメイン融合の細胞透過能力を評価することをお勧めします。 まだ証明されていないが最後に、我々は、ZIFドメインの配信が細胞内に巨大分子の多様な配列を送達することができる、非常に柔軟なプラットフォームであることを期待しています。 DNAとRNAの両方が化学的に加水分解可能なリンカーを介してZIFドメインの表面上に官能化され、または一過ZIFドメインのカプセル化によって細胞にトランスフェクトするために、例えば、それが可能である。さらに、efficiZIFのタンパク質送達のencyはさらに表面電荷の最適化に焦点を当てた合理的な設計の努力によって高めることができる。

高効率と汎用性タンパク質の送達戦略は、多くの基礎研究および治療用途のために重要である。細胞への精製されたタンパク質の直接送達は、これを達成するための最も安全で簡単な方法のいずれかを表す。核酸からの遺伝子発現に依存する戦略とは異なり1,2、3-5タンパク質の送達は、挿入突然変異の危険をもたらすことはないとは無関係である細胞の転写/翻訳機構と即効することができます。しかし、タンパク質上に細胞透過活性の賦与するための簡単​​で一般化方法の欠如は、日常的に細胞への直接のエントリを混乱させる。細胞内タンパク質の送達を容易にするための現在の方法は、天然6-8または設計された細胞透過性ペプチド、9-12過給導入ドメイン、13,14ナノ粒子15およびリポソーム16ウイルス様粒子17,18発生の使用に基づいている</SUP&gt;とポリマーマイクロスフェア材料。19残念ながら、これらのアプローチの多くは、低細胞取り込み率、20,21安定性が悪く、22不注意細胞型特異性、23低いエンドソーム脱出特性24と毒性によって妨げられている。さらに、25、多くのタンパク質形質導入技術は、配信するタンパク質の生物活性を減らす。14 キメラ制限がプログラム可能なのCys 2 -His 2ジンクフィンガーDNA結合タンパク質とFokI制限エンドヌクレアーゼ26-28の切断ドメインからなるエンドヌクレアーゼ- -本質的に無細胞である私たちの研究室では、以前ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）のタンパク質があることを実証した透過性。29この驚くべき細胞透過活性はカスタム設計ジンクフィンガードメイン、ターゲットゲノムENのための強力なツールとして浮上しているDNA結合プラットフォーム固有の性質であることが示されたgineering、30-32およびタンパク質表面の6つの正に荷電した残基のコンステレーションの結果であると考えられる。実際、c-Junの及びN-DEKを含むいくつかのDNA結合タンパク質は、細胞膜を通過する先天的能力を有することが示されている。 図33は、さらに最近では、我々の研究室では、これらの結果に展開され、亜鉛の細胞透過活性のことを実証指（ZIF）ドメインは、細胞内のタンパク質送達のために活用することができた。従来の多くの細胞透過性ペプチド送達システムを超えた効率性を取り込むために導いた特定のタンパク質の貨物に一次元または二本指をZIFドメインのどちらかの遺伝子融合。34最も顕著、ZIF媒介送達が融合した、酵素貨物の活性を危うくし、促進しませんでした細胞質ゾルデリバリーの高レベル。まとめると、これらの知見は、タンパク質の効率的かつ容易な送達を促進するためのZIFドメインの可能性を実証し、潜在的により多様な種類のマクロ細胞内への分子、。 ここでは、哺乳動物細胞におけるタンパク質の送達のためのZIF技術を実装する方法の詳細なステップバイステップのプロトコルが提供される。我々は以前に一次元、二次元、三、四速、五起因αヘリックスDNA結合残基のそれぞれの置換を、DNAに結合する能力を欠いている6フィンガーZIFドメインのスイートを構築したが、セル34（ 図1）にタンパク質を送達することができる。二本指ZIFドメインを使用してHeLa細胞にエメラルドGFP（EmGFP）の産生および形質導入が記載されている。このプロトコルは、 大腸菌での可溶性発現が可能なほぼすべてのタンパク質、ほぼ任意の哺乳動物細胞型に拡張可能である。期待される結果を提供し、このシステムのパフォーマンスを最大化するための戦略もまた、議論されている。

<table><tbody><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156L</td><td></td></tr><tr><td>Expand High Fidelity PCR system</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells</td><td>Life Technologies</td><td>EC6028BOX</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Life Technologies</td><td>15224-017</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0391</td><td></td></tr><tr><td>Zinc Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-25</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-V3151&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose Resin</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td><td>EMO Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Flat Bottom Plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, No Calcium, No Magnesium</td><td>Life Technologies</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>Heparan Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4777</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Nano Drop ND-1000 spectrophotometer&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

direct protein delivery to mammalian cells using cell-permeable cys2-his2 zinc-finger domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

二本指ZIF-EmGFP融合タンパク質はE.で発現させることができる大腸菌 &gt; 95％の均質性及び高収率で（&gt; 25 mg / ml）で（ 図2）。一般的には、1次元と2本指のZIF融合タンパク質は、野生型非修飾タンパク質のものとほぼ同じ量で製造することができる。しかし、いくつかの文脈において、5員環及び6フィンガーZIF融合タンパク質は、下流の用途のために十分に高い収率で製造することができない。 37℃で90分間インキュベートしたHeLa細胞上に二本指ZIF-EmGFPタンパク質の直接適用は、EmGFP蛍光（ 図3A）の用量依存的な増加をもたらす。批判的に、蛍光はZIFドメインの非存在下で観察されない。我々は以前、細胞のほぼ100％が、わずか2μM二指ZIF-EmGFP蛋白質で処理した後、蛍光性であることが観察され、ZIF融合タンパク質で処理したHeLa細胞は、タンパク質濃度でEmGFP蛍光に関して陽性であることを<html> 0.25μM（ 図3B）と低い。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52814/52814fig1.jpg" /> 図1.構造とジンクフィンガータンパク質の配列。シングルジンクフィンガー（ZIF）ドメインの（トップ）の結晶構造。 。のZn 2+と調整の保存さCysおよびHis残基の側鎖は、イオンがスティック（PDB ID：2I13）として示しているZIFドメインの37（下）シーケンス。矢印とシリンダはそれぞれ、Βシートおよびαヘリックス二次構造を示している。アラニンで置換されたαヘリックスDNA結合残基はピンクの強調表示されます。正に荷電した残基は、水色をハイライト表示された細胞内在化を媒介すると予測している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52814/52814fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 「FO：キープtogether.withinページ= &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52814/52814fig2.jpg" /> 精製された一次元、二次元、三、四指ZIF-EmGFP融合タンパク質の、図2のSDS-PAGEは。ZIF-EmGFP融合タンパク質を大腸菌で発現させた大腸菌およびNi-NTAアガロース樹脂により精製した。溶出したタンパク質を4％~20％Tris-グリシンゲルを用いてSDS-PAGEにより純度を分析した。有意な劣化やZIF-EmGFP融合タンパク質の切断型は認められなかった。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52814/52814fig3.jpg" /> HeLa細胞に、図3 ZIF媒介タンパク質送達。 （A）は 、2つの指ZIF-EmGFPタンパク質の量の増加で処理したHeLa細胞の蛍光強度。 EmGFPタンパク質で処理したHeLa細胞は、単独で、未処理の細胞と完全にオーバーラップする。（B）2μMoを用いて連続的に処理したHeLa細胞の正規化蛍光強度F二本指ZIF-EmGFPタンパク質。蛍光強度は、フローサイトメトリーによって決定した。

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Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

ジンクフィンガードメインは、本質的に細胞透過性及び広範囲の哺乳類細胞型へのタンパク質の送達を媒介することができる。ここでは、細胞内タンパク質の送達のためのジンクフィンガーの技術を実施するための詳細なステップバイステップのプロトコルが提供される。

細胞透過性のCysを用いて哺乳動物細胞への直接タンパク質送達<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt;ジンクフィンガードメイン

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

direct-protein-delivery-to-mammalian-cells-using-cell-permeable-cys2

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

9.9K ビュー.  The Scripps Research Institute. ジンクフィンガードメインは、本質的に細胞透過性及び広範囲の哺乳類細胞型へのタンパク質の送達を媒介することができる。ここでは、細胞内タンパク質の送達のためのジンクフィンガーの技術を実施するための詳細なステップバイステップのプロトコルが提供される。 

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Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

植物の細胞や細胞小器官の壁を越え遺伝子やタンパク質を輸送するために、ペプチド由来方法

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

遺伝学

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

細胞内タンパク質間相互作用を研究するビオチン化セル透過ペプチド

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

生化学

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

生物工学

Engineering Intracellular Protein Sensors in Mammalian Cells

Proteins can function as biomarkers of pathological conditions, such as neurodegenerative diseases, infections or metabolic syndromes. Engineering cells to sense and respond to these biomarkers may help the understanding of molecular mechanisms underlying pathologies, as well as to develop new cell-based therapies. While several systems that detect extracellular proteins have been developed, a modular framework that can be easily re-engineered to sense different intracellular proteins was missing.
Here, we describe a protocol to implement a modular genetic platform that senses intracellular proteins and activates a specific cellular response. The device operates on intracellular antibodies or small peptides to sense with high specificity the protein of interest, triggering the transcriptional activation of output genes, through a TEV protease (TEVp)-based actuation module. TEVp is a viral protease that selectively cleaves short cognate peptides and is widely used in biotechnology and synthetic biology for its high orthogonality to the cleavage site. Specifically, we engineered devices that recognize and respond to protein-biomarkers of viral infections and genetic diseases, including mutated huntingtin, NS3 serine-protease, Tat and Nef proteins to detect Huntington&#8217;s disease, hepatitis C virus (HCV) and human immunodeficiency virus (HIV) infections, respectively. Importantly, the system can be hand tailored for the desired input-output functional outcome, such as fluorescent readouts for biosensors, stimulation of antigen presentation for immune response, or initiation of apoptosis to eliminate unhealthy cells.

Here, we present a protocol for engineering genetically-encoded intracellular protein sensor-actuator(s). The device specifically detects target proteins through intracellular antibodies (intrabodies) and responds by switching on gene transcriptional output. A general framework is built to rapidly replace intrabodies, enabling rapid detection of any desired protein, without altering the general architecture.

Proteins can function as biomarkers of pathological conditions, such as neurodegenerative diseases, infections or metabolic syndromes. Engineering cells ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the efficiency with which macromolecules penetrate the cytosolic space of cells. Recently, we have circumvented this problem by identifying the reagent dfTAT, a disulfide bond dimer of the peptide TAT labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine. We have generated a fluorescently labeled dimer of the prototypical cell-penetrating peptide (CPP) TAT, dfTAT, which penetrates live cells and reaches the cytosolic space of cells with a particularly high efficiency. Cytosolic delivery of dfTAT is achieved in multiple cell lines, including primary cells. Moreover, delivery does not noticeably impact cell viability, proliferation or gene expression. dfTAT can deliver small molecules, peptides, antibodies, biologically active enzymes and a transcription factor. In this report, we describe the protocols involved in dfTAT synthesis and cellular delivery. The manuscript describes how to control the amount of protein delivered to the cytosolic space of cells by varying the amount of protein administered extracellularly. Finally, the current limitations of this new technology and steps involved in validating delivery are discussed. The described protocols should be extremely useful for cell-based assays as well as for the ex vivo manipulation and reprogramming of cells.

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

エンドソーム溶解試薬dfTATとのインキュベーションによって生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不浸透性小分子の送達

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

エンジニアリング細胞透過性のタンパク質

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

生物学

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

ヒト細胞から分泌タンパク質の生産のための便利で一般式プラットフォーム

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

HEK 293F懸濁細胞における構造生物学のための組換えタンパク質の発現：小説とアクセアプローチ

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.

We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.

哺乳動物細胞におけるヒトグランザイムの高収量およびコスト効率の高い発現システム

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

効率的な哺乳動物細胞発現および結晶化のための細胞外糖タンパク質のシングルステップの精製

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

細胞透過性のCysを用いて哺乳動物細胞への直接タンパク質送達

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