The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.

摂食細菌の調製注：このセクションでは、給紙細菌（ 大腸菌株 OP50）の調製を記載する。 <ol><li> Eの単一コロニーを分離無菌的にLB培地（LB）寒天プレートとから大腸菌株 OP50は、オートクレーブしたLBブロス300mlに接種する。 </li><li>飽和状態に達するまでに接種培養は、200rpmで、37℃でシェーカーで一晩増殖させる。 </li><li> 6無菌、予め秤量した50ミリリットルコニカルチューブにOP50を転送します。 6000 RPM（5000 XG）で5分間遠心分離することによって細菌をペレット化。 </li><li>上清を捨て、滅菌したM9 50mlで細菌を洗う。二回繰り返します。 </li><li>第二回目の洗浄後何M9がチューブ内に残っていないことを確認して、残りのM9を削除します。 </li><li>細菌ペレットを含むチューブを計量することによってペレットの重量を測定し、50ミリリットルコニカルチューブの重量を差し引く。 </li><li>ペレットIを再懸濁nはM9に100mg / mlの濃度で。 </li><li>それはワーム培養に使用されるまで4℃でOP50ソリューションを保管してください。 </li></ol>線虫成長培地（NGM）ペトリ皿の調製注：このセクションでは、C.プレートであるNGMペトリ皿、の調製を記載elegansのワームは、日常的に研究室で維持されている。 <ol><li> NGM寒天培地をオートクレーブ。 </li><li>滅菌手順を使用して、蠕動ポンプを使用して6センチメートルペトリプレートにNGM寒天溶液17mlを分注する。 注：プレート内の寒天の一定量を別のプレートから切り替えるときに顕微鏡を再集束の必要性を低減。 </li><li>寒天が固化してみましょうと余分な水分を蒸発できるようにするため、使用前に2〜3日間室温でプレートにしておきます。 </li><li>無菌技術を用いたNGMプレートをシード。 OP50液体培養の1-2滴を適用し、ガラス棒を用いて拡散。ことを確認していないすべての道のプレートの端に細菌の芝生を広げます。 </li><li> OP50の芝生がワームを成長させるのプレートを使用する前に、室温で1〜2日間増殖することを許可する。 </li></ol>同期ワーム人口の調製注：Cのライフサイクル虫は胚段階、4幼虫期（L1-L4）と成人期から構成されている。このセクションでは、ワームの年齢同期人口の製造を記載し​​ている。漂白処理後の線虫と接触する全ての材料は、無菌でなければならない。 <ol><li> 1日目- 、妊娠ワーム人口の調製 <ol><li>ワームの人口の大半が飢餓のL1幼虫で構成されているNGMプレートを使用してください。 </li><li>滅菌ワームとのL1幼虫が選ぶ収集し、新鮮に6cm NGMプレートにそれらを転送するには、OP50を播種。ワームの大半は妊娠大人になるまで20℃で約65時間インキュベートする。へプレート過密を回避し、ワームは細菌を破壊することなく成長させる、各新鮮なNGMプレートにL1幼虫の1つまたは2つ以上のクラスタを転送しないでください。 </li></ol></li><li> 4日目-シンクロナイズドL1幼虫人口の確立 <ol><li> M9 1-2 mlのそれらを洗浄することにより、NGMプレートから妊娠ワームを収集し、円錐形の15ミリリットルチューブに転送。 </li><li>妊娠ワームは約5〜10分間15ミリリットルコニカルチューブの底に沈降してみましょう。ワームペレットを乱すことなく、上清を取り除きます。 </li><li> 2-4マイクロ遠心チューブにワームペレットを移し、漂白剤/ NaOH溶液1ミリリットルを追加します。 RTで2〜3分間インキュベートする。死んでいるすべてのワームを確認するために、実体顕微鏡下で反応の進行状況を監視します。胚が死ぬことができるようになりましたが5分を漂白しないでください。 </li><li> 3000 RPM（900 XG）で1分間遠心分離することにより、ワームを収集します。上清を除去し、滅菌M9の1ミリリットルを追加反応を中和する。 </li><li> 3000 RPM（900 XG）で1分間遠心分離することにより、二回のワームを洗ってください。 </li><li>上清を除去し、最大で100〜200μlにM9を追加。 </li><li>ガラスパスツールピペットを使用すると、NGMプレートをクリアして、胚が孵化することを可能にするために20℃で少なくとも24時間のためにそれらをインキュベートするワーム/ M9ミックスのドロップを追加。 注：食べ物がないと幼虫の成長がL1段階で停止されます。 </li></ol></li><li> 5日目-シンクロナイズドL4幼虫人口の確立 <ol><li> M9 1-2 mlのプレートを洗浄することにより明確なNGMプレートからのL1幼虫を収集し、円錐形の15ミリリットルチューブに転送。 </li><li>約5分間の15ミリリットルコニカルチューブの底に死んだ成虫の堆積物をしましょう​​。 </li><li>新しい円錐形​​の15ミリリットルチューブ内のL1虫である上清を、収集し、2600 RPM（1,000 XG）で2分間遠心分離することによりワームを沈殿させる。 </li><li>上清ルを削除約500μlのAVING。 </li><li>実体顕微鏡を使用してドロップ10μlのワームの数をカウントすることによりM9溶液中のワームの濃度を決定する。少なくとも5滴を数える。 </li><li> 20-25ワーム/μlにワームの濃度を調整し、NGMプレートにワーム/ M9ミックス50μlのを追加OP50を播種。 </li><li>彼らはL4段階に到達するまでに成長するL1同期化された人口を可能にするために（週末を通してインキュベーションのために）15℃で65時間インキュベートする。 </li></ol></li></ol> 96ウェルプレート中で化学物質へのワームの4暴露注：このセクションでは、Pxol1の使用が記載されている:: Cを含むGFP転写レポーターエレガンス株は、異数性の誘導のためにスクリーニングする。 <ol><li> M9 1-2 mlのプレートを洗浄することにより明確なNGMプレートからL4幼虫を収集し、円錐形の15ミリリットルチューブに転送。 </li><li> L4ワームの底に沈降してみましょう約5〜10分間15ミリリットルコニカルチューブ。ワームペレットを乱すことなく、上清を取り除きます。 </li><li> M9 3〜5 mlを加え実体顕微鏡を用いて10μlの滴でワームの数をカウントすることによりM9溶液中のワームの濃度を決定する。各サンプルについて少なくとも5滴を数える。 </li><li> M9 1000ワーム/ mlの濃度でワームを再懸濁する。 </li><li> M9でセクション1の10倍からOP50細菌を希釈する。より低い温度では、ワームの開発に影響を与えるために再懸濁させ、細菌が室温に達することを確認してください。 </li><li>マルチチャンネルピ ​​ペットを用いて、第一（ステップ8.8）ワーム/ M9ミックス100μlのを追加し、2ミリリットル深い丸底96ウェルプレートの各ウェルに（ ステップ4.5から）で希釈OP50細菌の400μlを添加する。最後に、各ウェルを500μlの100ワームを持つことになります。 </li><li>提案され、最終的なconcentrを達成するために、被験化学物質または所望のウェルに適切な制御のどちらかの0.5μLを追加します。100μMのationが、濃度は一般的にCの化学画面で使用虫 12。 0.1％の最終濃度でエタノールまたはDMSO溶媒対照を公開します。 注：我々は、陽性対照としてノコダゾール（100μM）の使用をお勧めします。 </li><li>接着フィルムを使用してプレートをシール。ウェル間のクロスコンタミネーションを防ぐためにウェルプレートをシールしてください。 </li><li>アルミホイルでプレートを包みます。 </li><li>時間の適切な長さのために適切な温度（24または65時間）のシェーカー（170〜180 RPM）にプレートを転送します。部屋の温度は、ワームの成長に影響を与えます。 20℃前後の温度を維持する。 </li></ol> 384ウェルプレート中で、妊娠ワームの5.画像取得注：このセクションでは、大人の雌雄同体の子宮内の胚におけるGFPの発現を可視化するために、画像さらさPxol1 :: GFPワームに高いコンテンツ顕微鏡の使用が記載されている。のためにスクリーニングされる各384ウェルプレートに、4×96ウェルプレートからワームを使用する。 <ol><li>シェーカー中の化学暴露後に、10〜15分間、96ウェルプレートの残りは成虫がプレートの底に沈降することを可能にすることができます。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて、プレートの底にワームを邪魔しないように非常に気をつけながら、M9の350μlのを削除します。 </li><li> M9の1ミリリットルを繰り返しステップ5.1でワームを洗ってください。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて、プレートの底にワームを乱さないVEYように注意しながら、M9の1ミリリットルを削除します。 </li><li>マルチチャンネルピペットを使用して、残りのM9にワームを再懸濁し、96ウェルプレートからワーム/ M9ミックス100μlのを収集し、黒壁/透明底384ウェルプレートのウェルにロードします。 384ウェルプレートの全てのウェルがロードされるまで、4×96ウェルプレートからワームを使用してプロセスを繰り返す。 注：すべてのウェルに増加させるために、同じ体積を有することが重要である画像取得プロセス中にオートフォーカスの効率と速度。各ウェルを80から100のワームとの間で含まれている必要があります。 </li><li>各ウェルにレバミゾール（100μM）の1μl加え、ワームは、約30分間インキュベートしましょう​​。 NOTE：レバミゾールアセチルコリン受容体アゴニストとして作用し、ワームを固定する。 </li><li>自動化されたイメージングを提供することが可能な広視野高含量顕微鏡にプレートに移す。 </li><li>画像取得のために、製造業者のガイドラインに従って高含量画像収集および解析ソフトウェアを使用します。ウェルあたり1画像を取得する4X対物レンズを選択する。 </li><li>画像取得を開始する前に、xは2160 2160への曝露と画像解像度の45ミリ秒にGFPの撮像パラメータを調整する。 </li><li>ウェル中のワームの総数で割ったGFP陽性虫の数などのデータを収集し、後者の指標は、ウェル間の比較的一貫している。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

ここで説明する方法は、生殖系列の毒物を同定するための最初の大規模な戦略を構成する。それは忠実に生殖細胞機能障害のためのプロキシとして使用されている初期胚で異数性の誘導を報告したGFPトランスジェニックPxol-1 :: GFP含む株を使用する必要があります。この方法は、Cの慎重な同期を伴う虫ワームの人口と自動化ハイコンテンツ顕微鏡によってGFP陽性ワームの撮影に続いて、96ウェルフォーマットでの化学物質へのワーム&quot;暴露。 このプロトコルのいくつかのステップは、結果の一貫性に重要である。適切に露光に使用されるL4幼虫を上演したの数を最大としてまず、ワーム集団はに非常に同期している必要があります。このため、ここで説明する方法論は、L1飢餓によるワームの人口の漂白による最初と、2つの同期ステップを含む。第二の重要なパラこの方法のメーターは露出の長さです。ワームは、日常的に24時間または65時間のどちらかのために露出されている。減数分裂のようにCの継続的なプロセスである虫は 、これら2つの露光窓が変更された後期の減数分裂のイベント（24時間）または初期および後期両方の減数分裂のイベント（65時間）のいずれかのキャプチャを可能にします。それは、より長い曝露がより良い哺乳類生殖毒性10を予測するように見えることが注意することが重要である。 方法の特に魅力的な側面は、その柔軟性である。プロトコルは、ハイスループットスクリーニングのために設計されているが、アッセイのスケールダウンバージョンは、24ウェルプレートまたは1.5 mlチューブを使用してサンプルの少数のスクリーニングを行うことができる。画面のスケールを小さくすると、アッセイの感度を高めることができるサンプルあたりのワームより多数のテストを可能にします。現在の形式では、四連でスクリーニング化合物はaneuplで高い統計的信頼を提供することをお勧めしますoidy率を測定。この大規模な方法論の潜在的なハードルはGFP陽性胚の自動検出のための必要性から来ている。このタスクは簡単に目で行うことができますが、画像解析ソフト上で適切なパラメータを慎重に設立は、理想的にイメージングの専門家と、手順の自動化のために重要である。さらに、GFP陽性胚の検出を超えて、ヒットの二次検証は、染色体エラーが減数または胚起源のものであるかどうかを決定するために行われるべきである。我々は以前にそのような二次アッセイを容易にC.して行われることを示したエレガンスとは、生殖細胞核のDAPI染色と同様にアポトーシス10の測定のためのワームのアクリジンオレンジ染色を含む。これら二つの単純なアッセイから、異常な減数分裂、異常な核形態および断片化を介して進行、ならびに生殖細胞の損失は、全てを評価することができる。 まとめると、我々はdescribを持っているここでエドモデル系Cを使用して生殖細胞毒性の迅速な評価のために必要な手順虫 。それは、哺乳動物の生殖毒性エンドポイントの予測産子数と卵巣の欠陥10を減少させるように重要なのは、生殖細胞毒性のマーカーとしてワームでの異数性の使用は、関連するアッセイである。女性の生殖細胞に対する毒性影響を調査するために特に困難であるので、これは特に重要である。したがって、この高速のアッセイは、最初のパス毒性画面として大型動物実験の代替を提供し、複雑な減数分裂プログラムのさまざまな側面での環境化学物質暴露の影響に光を投げかけて。

米国では商業用に登録さ約87000薬品、これらは潜在的な健康への影響1のためにテストされたのまだごく少数があります。テストされたもののうち、一部のみ、特に女性の生殖細胞の発生および分化の間、哺乳動物における早期の生殖イベントの変更を決定する際の困難さに一部起因生殖健康への影響について評価された。確かに、最初の減数分裂事象は、雌の哺乳類における胚発生の初期段階で行われ、スクリーニング目的に適した番号にアクセスして収集することは困難である。 生殖細胞は、世代間の重要なリンクを提供し、その適切な機能は、細胞の染色体分裂の複雑なプログラム減数分裂と呼ばれるの正確な実行に依存している。減数分裂プロセスの調節不全が減少生殖能力との産生をもたらす可能性染色体の異常な数の配偶子および胚は、条件が異数性と呼ばれる。減数分裂における染色体の分離エラーが人間の健康に非常に関連しています。染色体異常は1〜150で出生の頻度、21トリソミー、18と13だけでなく、最も一般的なタイプ2,3であるXとY染色体のエラーで、共通している。さらに、染色体の起源のものを含め先天性奇形は、環境の影響は、染色体分離や行動に影響を与えることができるという考えは5新しいものではないが、それでも十分に理解されていない米国4で乳児死亡の主要な原因である。それは人間の生殖能力、初期の開発および全体的な生殖に関する健康に干渉している私たちの環境に導入された化学物質のどの調査することが重要である。 哺乳動物モデルのこれらの制限に照らして、我々は、回虫生殖毒性を試験するためのハイスループットスクリーニングアッセイを開発した&lt;EM&gt; C。エレガンス。我々は、その小さなサイズ、低コスト、短い再生サイクル、生殖細胞の割合が高いと操作6の容易として一般的に使用される遺伝モデルシステムによって提供されるいくつかの重要な機能を動員している。ワームは、96ウェルプレートに、または大量の液体培養で増殖することができ、それらの透明性を直接蛍光レポーターを検出するためにプレート上に結像することができる。以下に記載のアッセイは、これらの特性を利用して、蛍光レポーターPxol-1を含むウォーム株を活用:: GFPの胚の異数性の生殖細胞を破砕した誘導を検出すること。 このレポーター株の使用は、主に雌雄同体のワームの人口の男性の一般的まれな出来事に基づいています。これらの男性（&lt;0.2％）が自然にX染色体7の分離の誤差に由来する。しかし、生殖細胞系列の中断などの頻繁に常染色体の分離におけるエラーにつながるそしてheterochromosomesのではなく、男性の表現型（Xの分配異常）ならびに胚性致死（常染色体の分配異常）の高められた発生率との両方を相関させる。胚の致死性の問題を回避しながら、容易に雄の誘導を検出するために、雄特異的プロモーター（XOL-1）は、依然としてワームの子宮内に含まれる初期胚におけるGFPの発現を駆動するために使用される。このように、GFPを発現する胚の外観は、異数性胚の存在のためにプロキシとして使用される。この方法は、以前に生殖細胞維持および分裂8,9に関与する遺伝子を同定するために使用されている。化学物質のスクリーニングに適合し、この菌株は、ハイスループットスクリーニングに媒体中で使用される。重要なことは、株は忠実に化学物質のaneugenicityを報告し、そのための哺乳動物の生殖エンドポイント10に関連している。ここに記載のアッセイは、見て、製薬および化学産業の設定で毒物学者に特に有用であろう急速生殖エンドポイントに向かっての化学物質の毒性を評価した。さらに、このアッセイは、完全に21世紀のレポート11に毒性で強調表示政府の優先事項と整合する。

<table><tbody><tr><td>60 mm Vented, sharp edge Petri dishes</td><td>Tritech</td><td>T3315</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Apex</td><td>20-274</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate</td><td>Corning</td><td>P-DW-20-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone</td><td>Apex</td><td>20-261</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>VWR</td><td>AA12316-A1</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138225</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>IC19018680</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cbs.umn.edu/cgc&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.cbs.umn.edu/cgc&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>VWR</td><td>EM-4455S</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384 well plates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1937-32EA</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS System</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Levamisole hydrochloride</td><td>Fluka</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate anhydrous (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>VWR</td><td>97061-438</td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress High Content Image Acquisition &amp;amp; Analysis Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Rayon films for biological cultures</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>VWR</td><td>BDH0316</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work.</td></tr><tr><td>TY2441 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;, &lt;em&gt;Pxol-1::GFP&lt;/em&gt; reporter strain</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cbs.umn.edu/cgc&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.cbs.umn.edu/cgc&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode caenorhabditis elegans

我々の環境中に存在する化学物質の何千もの生殖毒性を識別することは環境衛生の分野で最も食欲をそそる課題の一つとなっている。これは、（1）正確に生殖過程のキーの機能を再現し、（2）脊椎動物の多数を必要とせず、ハイスループット様式に、中で行うことができ、モデル系の不足に一部起因する。 ここでは、線虫C.でのアッセイを説明異数性胚の誘導を監視することにより、生殖細胞系の毒物の迅速な同定を可能にする虫 。 GFPレポーターラインを利用することにより、生殖細胞の破壊に起因する染色体分離におけるエラーは、容易に自動化蛍光顕微鏡により可視化し、定量化される。したがって、その毒性のための化合物の特定のセットのスクリーニングは、数日のうちに96の384ウェルプレート形式で実施することができる。正hの二次分析その染色体異常が減数分裂の破壊または初期胚染色体分配誤差に由来するかどうかを決定するために行うことができる。要するに、このアッセイは、化学物質曝露後の生殖細胞系の機能障害を迅速に評価するための迅速な初回通過戦略を表す。

このような微小管毒ノコダゾールなどの化学剤に対するPxol-1 :: GFPレポーター株の曝露（ 図1）は、DMSO対照と比較して露出した成体雌雄同体の子宮におけるGFP発現胚の高い割合の誘導を導く。 GFP陽性胚は、他の胚だけでなく、動物の腸内で観察された自家蛍光で観察弱いバックグラウンド蛍光よりも有意に明るい。露出されたワームは、直接384ウェルプレート上に結像された少なくとも1つのGFP陽性胚を含む虫の数は、各ウェルについてカウントし、そのウェル内のワームの総数によって正規化される。化学画面から正のヒットは、DMSO 10よりも高い周波数1.7倍でワーム集団におけるGFP陽性胚の割合を誘発した化合物を意味する。しきい値の最適化、高含量画像解析（ 材料ファイルを参照してください）に続いて、自動化されたカルクことができます正のオブジェクトの数のulation（ すなわち、胚）ウェル内のワームの総数で割って、アッセイの大規模な適応のための最適な方法である。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 妊娠成人人口を生成するために、飢えたワームの人口で開始 </td></tr><tr><td> ↓（文化3日間） </td></tr><tr><td> 妊娠成人人口ブリーチ </td></tr><tr><td> ↓ </td></tr><tr><td> NGMプレートをクリアするために漂白されたワームを転送 </td></tr><tr><td> ↓（文化1日） </td></tr><tr><td> 同期化されたL1集団を収集し、OP50でNGMプレートに移す </td></tr><tr><td> ↓（15ºCで65時間インキュベートし） </td></tr><tr><td> 同期されたL4集団を収集 </td></tr><tr><td> ↓&lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> M9 / OP50の0.5ミリリットルで96ウェルプレートの各ウェルに100 L4ワームを分配 </td></tr><tr><td> ↓ </td></tr><tr><td> 各ウェルに化学物質（100μM）を追加 </td></tr><tr><td> ↓（24または65時間インキュベート） </td></tr><tr><td> 384ウェルプレートに96ウェルプレートから同期妊娠成人人口の100μL（80ワーム）を転送します。 </td></tr><tr><td> ↓ </td></tr><tr><td> 各ウェル（最終濃度1μM）のレバミゾールの1μLを追加 </td></tr><tr><td> ↓（30〜45分間インキュベート） </td></tr><tr><td> 高含量顕微鏡で各ウェルの画像をキャプチャして解析する </td></tr></tbody></table> 表1.実験ワークフロー。1日目は、使用飢餓ワーム集団は妊娠成人集団を生成する。 4日目、blea同期化されたL1集団を生成するために妊娠成人人口はCH。 5日目は、同期されたL4集団を生成するためにOP50シードされたNGMプレートに明確なNGMプレートからL1集団を転送する。 8日目に、96ウェルプレートに同期L4集団を転送し、別の化学物質にそれらをさらす。 9日目と11日目には、高含有量顕微鏡で撮像される384ウェルプレートに露出妊娠成人を転送する。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> M9バッファー- 1 L </td></tr><tr><td> 1.大きなビーカーに以下の成分を組み合わせるか、磁気攪拌棒を用いてメスシリンダー</td></tr><tr><td> 3グラムのKH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 6グラムのNa 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 5グラムのNaCl </td></tr><tr><td> 1ミリリットルの1M MgSO 4を</td></tr><tr><td> H 2 O L. 1 </td></tr><tr><td></td></TR&gt; <tr><td>適切なサイズのボトルに2.分量（500ミリリットルサイズのペットボトルで300ミリリットル） </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> 3. 30〜60分間オートクレーブで滅菌する</td></tr><tr><td></td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> プレート用NGMメディア- 4 L </td></tr><tr><td> 1. 4 Lに記入した後、三角フラスコに以下を追加します。 </td></tr><tr><td> 12グラムのNaCl </td></tr><tr><td> 10gのバクト</td></tr><tr><td> 80gの寒天</td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> 2.加え、よく混ぜる。 </td></tr><tr><td>コレステロール4mlの（5 mg / ml）で</td></tr><tr><td> 4ミリリットルのCaCl 2（1Mのストック溶液） </td></tr><tr><td> 4ミリリットルをMgSO 4（1 M原液） </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> 30〜60分間3.オートクレーブ</td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> 4.少し冷ますとKH 2 POの100ミリリットルを追加<sub&gt;の4（1 M、pHが6ストック溶液）、次いでプレートを注ぐ</td></tr><tr><td></td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> LB培地- 1 L </td></tr><tr><td> 1. 800ミリリットルのH 2 Oに以下を追加します。 </td></tr><tr><td> 10グラムバクト - トリプトン。 </td></tr><tr><td> 5gの酵母エキス。 </td></tr><tr><td> 10グラムのNaCl。 </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> 2. NaOHでpHを7.5に調整します。 </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> 3.をdH 2 Oで1 Lに音量を調整します</td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> 4. 30オートクレーブで滅菌する - 60分</td></tr><tr><td></td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> 集団を同期させるための漂白剤溶液- 50ミリリットル </td></tr><tr><td> 7.5ミリリットル10NのNaOH </td></tr><tr><td> 6ミリリットル漂白剤（レギュラー） </td></tr><tr><td> 36.5ミリリットルのdH 2 O </td></tr></tbody></table>表2.ソリューション。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52445/52445fig1highres.jpg" /> 図1：DMSOおよび陽性対照ノコダゾールを制御するPxol-1 :: GFPレポーター株の曝露から得られる画像の例は、この例では、ワームをノコダゾールで24時間曝露したまたはDMSO Pxol-1 :: GFPワームた。は（A）0.1％DMSO（陰性対照）または（B）100μMノコダゾール（陽性対照）に暴露し、384ウェルプレート中で画像化した。赤矢印：1ノコダゾール扱わワームの子宮内にはっきりと見えるGFP陽性胚。スケールバー= 1ミリメートル。 （C）及び（D）は、それぞれ（A）および（B）の部分を拡大している。スケールバー= 0.33ミリメートル。

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

8.0K ビュー.  University of California, Los Angeles. We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

生化学

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

線虫の表現型プロファイリングを自動化によって化学的毒性予測のための高スループット試金

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

環境学

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term effects are very important in judging their consequences in the environment and on human health. In demonstrating long-term influences, effects of chemicals over generations in recent studies provide new insight. Here, we describe protocols for studying effects of chemicals over multiple generations using free-living nematode Caenorhabditis elegans. Two aspects are presented: (1) trans-generational (TG) and (2) multi-generational effect studies, the latter of which is separated to multi-generational exposure (MGE) and multi-generational residual (MGR) effect studies. The TG effect study is robust with a simple purpose to determine whether chemical exposure to parents can result in any residual consequences on offspring. After the effects are measured on parents, sodium hypochlorite solutions are used to kill the parents and keep the offspring so as to facilitate effect measurement on the offspring. The TG effect study is used to determine whether the offspring are affected when their parent is exposed to the pollutants. The MGE and MGR effect study is systematical used to determine whether continuous generational exposure can result in adaptive responses in offspring over generations. Careful pick-up and transfer are used to distinguish generations to facilitate effect measurement on each generation. We also combined protocols to measure locomotion behavior, reproduction, lifespan, biochemical and gene expression changes. Some example experiments are also presented to illustrate the trans- and multi-generational effect studies.

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Trans- and multi-generational effects of persistent chemicals are essential in judging their long-term consequences in the environment and on the human health. We provide novel detailed methods for studying trans- and multi-generational effects using free-living nematode Caenorhabditis elegans.

毒性物質のトランスおよび多世代効果の研究のためのカエナルハブ炎エレガンスの使用

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in several diseases including cancer. The free-living nematode C. elegans possesses an evolutionary and functionally conserved EGFR-RAS-ERK MAP signal cascade which is central for the development of the vulva. Gain of function mutations in RAS homolog LET-60 and EGFR homolog LET-23 induce the generation of visible nonfunctional ectopic pseudovulva along the ventral body wall of these worms. Previously, the multivulval (Muv) phenotype in these worms has been shown to be inhibited by small chemical molecules. Here we describe a protocol for using the worm in a liquid-based assay to identify inhibitors that abolish the activities of EGFR and RAS proteins. Using this assay, we show R-fendiline, an indirect inhibitor of K-RAS, suppresses the Muv phenotype expressed in the let-60(n1046) and let-23(sa62) mutant worms. The assay is simple, inexpensive, is not time consuming to setup, and can be used as an initial platform for the discovery of anticancer therapeutics.

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The genetically tractable nematode Caenorhabditis elegans can be used as a simple and inexpensive model for drug discovery. Described here is a protocol to identify anticancer therapeutics that inhibit the downstream signaling of RAS and EGFR proteins.

ケノハブディティス・エレガンスを用いたEGFRおよびRAS阻害剤の同定

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

がん研究

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use products. Based on their chemical structure and estradiol-like biological properties, they have been classified as endocrine disrupting compounds (EDC). Long-term exposure to EDCs, even at low doses, has been linked to various health defects including cancer, behavioral disorders and infertility, with greater vulnerability indicated during early developmental periods. Cellular and molecular studies with the genetically tractable nematode model Caenorhabditis elegans have demonstrated that exposure to BPA causes apoptosis, embryonic lethality and disruption in the DNA repair mechanisms. We have previously reported that exposure of C. elegans embryos to low doses of different bisphenols decreases fecundity. In addition, we have shown that the effects of exposure during the very early stages of development persist into adulthood as assayed by quantifying habituation behavior, a form of non-associative learning. Here, we provide detailed protocols for embryonic exposure to low-dose EDCs as well as the associated fecundity and anterior touch habituation assays, along with representative results.

Exposure to environmental toxicants can acutely impact development with long-term effects. Detailed protocols are provided to illustrate a strategy using an effective lab model to study the effect of early embryonic exposure to bisphenol A. We provide fecundity and behavioral assays to monitor the effectiveness of our toxicant exposure bio-assays.

低線量の毒性に萌芽期の露出の長期的な行動および生殖の影響

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

発生生物学

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

生物学

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A non-mammalian soil round worm, Caenorhabditis elegans, is a valuable model organism for toxicology studies due to its convenience and lack of animal ethics issues compared with mammalian animal systems. In this protocol, a detailed procedure of toxicological evaluation of chemicals in C. elegans is described. A clinical anticancer drug, etoposide, which targets human topoisomerase II and inhibits DNA replication of human cancer cells, was selected as a model testing chemical. Age-synchronized C. elegans eggs were exposed to either dimethyl sulfoxide (DMSO) or etoposide, and then the growth of C. elegans was monitored every day for 4 days by the stereo microscope observation. The total number of eggs laid from C. elegans treated with DMSO or etoposide was also counted by using the stereo microscope. Etoposide treatment significantly affected the growth and reproduction of C. elegans. By comparison of the total number of eggs laid from worms with different treatment periods of chemicals, it can be decided that the reproductive toxicity of chemicals on C. elegans reproduction is reversible or irreversible. These protocols may be helpful for both the development of various drugs and risk assessment of environmental toxicants.

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

A basic protocol to evaluate the toxicity of chemicals in a model animal, Caenorhabditis elegans, is described. The method is convenient and useful for the development of pharmaceuticals as well as for the risk assessment of various environmental pollutants.

成長および線虫の繁殖に対する薬剤の効果を測定

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

医学

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s disease (HD) is principally driven by a CAG nucleotide repeat that encodes an expanded glutamine tract in huntingtin protein. Thus, the inhibition of polyglutamine (polyQ) aggregation and, in particular, aggregation-associated neurotoxicity is a useful strategy for the prevention of HD and other polyQ-associated conditions. This paper introduces generalized experimental protocols to assess the neuroprotective capacity of test compounds against HD using established polyQ transgenic Caenorhabditis elegans models. The AM141 strain is chosen for the polyQ aggregation assay as an age-associated phenotype of discrete fluorescent aggregates can be easily observed in its body wall at the adult stage due to muscle-specific expression of polyQ::YFP fusion proteins. In contrast, the HA759 model with strong expression of polyQ-expanded tracts in ASH neurons is used to examine neuronal death and chemoavoidance behavior. To comprehensively evaluate the neuroprotective capacity of target compounds, the above test results are ultimately presented as a radar chart with profiling of multiple phenotypes in a manner of direct comparison and direct viewing.

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Here, we present a protocol to assess the neuroprotective activities of test compounds in Caenorhabditis elegans, including polyglutamine aggregation, neuronal death, and chemoavoidance behavior, as well as an exemplary integration of multiple phenotypes.

ポリグルタミン媒介性神経毒性に対する生理活性化合物を発見するためのモデルシステムとしてのCaenorhabditis elegans

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s ...

神経科学

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, pesticides, and a wide variety of toxic substances. These nematodes are easy to work with and can be used to generate novel research findings, even in the undergraduate biology laboratory. A multi-week laboratory series of authentic, student-driven research projects trains students in a toolkit of techniques and approaches in behavioral measurements, cell biology, and microscopy that they then apply to their projects. One technique in that toolkit is quantifying the percentage of neurons exhibiting neurodegenerative damage following exposure to a chemical toxicant like a pesticide. Young adult C. elegans nematodes can be exposed to different concentrations of commercially available pesticides or other types of toxicants for 2-24 h. Then, undergraduate students can visualize different neuron subtypes using fluorescent-expressing strains of C. elegans. These techniques do not require sophisticated image processing software and are effective at even low magnifications, making the need for expensive confocal microscopy unnecessary. This paper demonstrates how to treat the nematodes with pesticides and how to image and score the neurons. It also provides a straightforward protocol for the microscopy and analysis of neuron morphology. The materials used for this technique are inexpensive and readily available in most undergraduate biology departments. This technique can be combined with behavioral measures like locomotion, basal slowing, or egg-laying to conduct a potentially publishable series of experiments and give undergraduate students an authentic research experience at a very low cost.

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Young adult Caenorhabditis elegans nematodes are exposed to different concentrations of commercial pesticides or other toxicants for 2-24 h. Then, different neurons can be visualized using fluorescent-expressing strains. This paper demonstrates how to expose nematodes to pesticides and assess neuron damage.

カエノルハブディティス・エレガンス神経細胞に対する農薬の効果の検討

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価

要約

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カエノラブディティス・エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

線虫の表現型プロファイリングを自動化によって化学的毒性予測のための高スループット試金

毒性物質のトランスおよび多世代効果の研究のためのカエナルハブ炎エレガンスの使用

ケノハブディティス・エレガンスを用いたEGFRおよびRAS阻害剤の同定

低線量の毒性に萌芽期の露出の長期的な行動および生殖の影響

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

成長および線虫の繁殖に対する薬剤の効果を測定

ポリグルタミン媒介性神経毒性に対する生理活性化合物を発見するためのモデルシステムとしてのCaenorhabditis elegans

カエノルハブディティス・エレガンス神経細胞に対する農薬の効果の検討

スクリーニング可能

線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価

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蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

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ポリグルタミン媒介性神経毒性に対する生理活性化合物を発見するためのモデルシステムとしてのCaenorhabditis elegans

カエノルハブディティス・エレガンス神経細胞に対する農薬の効果の検討

スクリーニング可能

カエノラブディティス・エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法