This work was supported by R01NS075062-01A1. FACS sorting performed at UAB Comprehensive Flow Cytometry Core facility (P30 AR048311, P30 A1027767). Dr. Scott Philips from the UAB Neurobiology Core facility and Dr. Susan Nozell from UAB CDIB assisted with technical aspects of the luciferase assay.

全ての動物は、国立衛生研究所のガイドラインに従って処理されました。アラバマ大学バーミンガム校で動物実験委員会は、動物の使用を承認しました。 1.全脳組織からのアストロサイトの選別（FACS）、蛍光活性化細胞を使用してエンリッチドアストロサイトの集団からRNAとDNAの取得<ol><li>落ち着いた1分間のCO 2で、動物、その後急速に首を切ります。 アルバカーキらに記載されているように、皮質を解剖26。それは、髄膜を除去する必要はありません。 注意：S100β（アストロサイトマーカー）プロモーター下のeGFPを発現するトランスジェニックラットは27板倉らによって生成され、アストロサイトのFACSソーティングのために利用しました。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、非無菌条件下でパパイン解離キットを用いて全脳ホモジネートを準備します。 10分間、水浴中で37℃でパパインを熱活性化します。注意：パパイン溶液は、製造業者によって提供され、L-システインおよびEDTA（材料の表を参照）が含まれています。 <ol><li>閉じたコニカルチューブ（ 図1A）内に供給される5％のCO 2：95％のO 2を運ぶチューブを可能にするために50 mlのコニカルチューブの頂部に穴を開け、またはドレメル。解離培地を含む10ミリメートル培養皿に解剖皮質を置き（MEMは、20mMのグルコースおよびペニシリン/ストレプトマイシン（500 U / ml）を補充し、95％O 2で平衡化：5％のCO 2）で1に組織をミンチする清潔なカミソリの刃を使用しX 1ミリメートル2枚。 </li></ol></li><li>パパイン溶液を含有する50 mlのコニカルチューブに10 mlの手動ピペットマンを用いて転送組織。組織が引き継が解離媒体の量を最小限にするために排出する前に、転送ピペットの底に沈殿することを許可します。インキュベーションの間、表面ガス交換を経て、5％のCO 2：95％O 2に平衡化パパインソリューションをしてください。バブルパパインsolutiにしないでください上。 37℃の水浴中で20分間組織をインキュベートします。 </li><li>パパイン溶液中でのインキュベーション後、磨砕組織低速で10ミリリットルの転送ピペットで10回。 RTで5分間1,000×gで遠心濁った細胞懸濁液。 <ol><li>表面ガス交換を介して、（製造者によって提供される）、DNアーゼ/​​アルブミン阻害剤溶液を平衡化し、DNアーゼ/​​アルブミン阻害剤溶液3mlに細胞ペレットを再懸濁します。メーカーの指示に従って、商業不連続密度勾配を準備します。 </li></ol></li><li> 6分、1000×gで不連続密度勾配をスピン。ピペットを用いたボトムペレットを吸引してチューブの底から解離した細胞を分離します。 </li><li> 0.02％のウシ血清アルブミンおよび1mg / mlのDNアーゼまたは培地HEPES緩衝好適にDPBSの2-3 ml中に解離した細胞を再懸濁します。 FACS（ 図2A）の前に40μmのフィルターを通過。ソートするまで氷上で細胞を保管してください。 <ol><li> FACS 28を実行します 。&lt;/ LI&gt; <li> 4℃で5分間、2,000×gで1.5 mlの遠心管中で細胞をペレット化。 注：ペレット化した星状細胞は、直ちに利用またはDNA抽出まで-80℃で維持することができます。 </li></ol></li><li>好適な分離法29 30を使用して、RNAおよびDNAを抽出します。分光光度計とバイオアナライザ31を介して RNAとDNAの濃度と品質を評価します。 注意：以降の唯一の高品質のRNAとDNAを利用し、それぞれ280分の260 = 2.0〜2.2と1.8から1.9に、。バイオアナライザー分析は、RNAの分解またはDNA断片化のために評価することが不可欠です。 RNAまたはDNAは、それぞれ、その後の研究のため、すぐに利用または-80℃で保存するか、または-20℃できます。 </li></ol> 2.メチル化感受性高分解能融解分析（MS-HRMA）を用いた遺伝子のDNAメチル化状態を評価します<ol><li>遺伝子の任意のCpGアイランドを同定するために好適なオンラインメチルマッピングソフトウェアへの目的の遺伝子配列を入力します興味32の。 <ol><li>亜硫酸水素塩に対する設計プライマーは、DNA配列33に変換し、製造業者のプロトコルに従って、好ましいDNAポリメラーゼを用いて増幅します。 45分間、100Vで1％アガロースDNAゲルを実行することにより、増幅産物のサイズを確認します。 -20℃で20μMのストック濃度で保存するプライマー。 </li></ol></li><li>亜硫酸水素塩は、同じ動物種34から0〜100％の範囲で、各サンプルおよびメチル化DNA標準のDNAの500〜1,000 ngのを変換します。溶出サンプルは、20 ngの/μlの濃度を提供します。分光光度計31を介して重亜硫酸変換したDNAの濃度を確認してください。 </li><li> 表1および2に記載の 5μMの濃度で好ましいDNAポリメラーゼおよびプライマーを使用して、MS-HRM増幅のためのセットアップ20μlの反応は。三重で、FACSのDNAメチル化規格を含むすべてのサンプルを実行します。 </li><li>解析ソフトウェアによっては、事前設定したパラメータを開始および停止後融解曲線の遷移の周り。 0.5℃ - 両者の差が0.2であるので、事前に溶融開始とプリメルト停止パラメータを設定します。ポスト溶融開始を設定し、同様に停止後の溶融。各サンプルのピーク温度差データを抽出します。 </li><li> ％のメチル化標準（y値）とそれに対応する平均ピーク温度差（x値）を使用すると、線形回帰方程式（ 図3A-B、表3-4）を生成します 。未知試料35のメチル化状態を推定するために、この線形回帰式を使用してください。 </li></ol> 3.ルシフェラーゼアッセイの使用を介してハイパーメチル化プロモーター活性を評価します<ol><li>標的遺伝子（ステップ2.1）のCpGアイランドを識別します。 PCRは、CpGアイランド-luc2プラスミド37を生成するために luc2ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に興味36クローンの領域を増幅します。 </li><li>制限経由のCpGアイランドluc2プラスミド30μgのを線形酵素消化38。制限消化のための部位を確認し、好ましいカッターソフトウェア 38 を使用して二重のカットを避けます。製造業者のプロトコルに従って消化後に、適切な温度および時間で加熱不活性化する酵素。 DNAの最小限の損失が線形化工程の間に発生します。 </li><li> 30℃でのCpGメチラーゼ（M.Sssl）O / Nを使用するか、次の調整を除き、未処理の次のメーカーのプロトコルを残すメチル化線​​状化したプラスミド。 </li><li> 50μlの反応を行います。 </li><li>線状プラスミドの700 ngのをメチル化するのCpGメチラーゼの5単位を使用してください。 </li><li> 13-19時間の反応O / Nを実行します。 </li><li> CpGメチラーゼ反応に続いて、標準を用いてDNAのクリーンアップを実行し、市販のシリカゲル膜製造業者のプロトコルに従ってキットをクリーンアップします。 DNAの大幅な損失が30〜60％の損失を以下のCpGメチラーゼ反応を生じます。 </li><li> Hpa II制限消化を介しプラスミドのメチル化を確認してください。 </lI&gt; <li>メチル化または非メチル化DNAの1μgのを取り、制限が37℃で1時間のHpa IIで消化。各μgのDNAのためのHpa IIの5〜10単位を使用してください。 Hpa II消化後、好適な、市販のシリカゲル膜クリーンアップキットを用いてDNAのクリーンアップを実行します。可視化のために45分（ 図4B）を100 VでTAEまたはTBE緩衝液中、1％アガロースゲル上でのDNAのCpGメチル化および非メチル化プラスミドの両方を実行します。 </li><li>適切な制限酵素で二重消化の対象と両方メチル化および非メチル化プラスミドは、全長LUC 2（ベクトル）とCpGアイランド（挿入）38を断片化を解除します。製造業者のプロトコルに従って消化後に、適切な温度と熱不活性化する酵素で二重消化O / Nを実行します。 DNA濃度の最小の損失は、二重制限消化中に発生します。 </li><li> O分離を可能にするために1時間、100Vで1％のDNAのアガロースゲル上の二重消化したプラスミドを実行します。Fベクターと挿入した （図4C）。注意。保護のUVフェイスシールドを着用、バンドを可視化するために卓上ブラックライトにDNAゲルを配置します。きれいな外科用メスを用いたサイズに基づいて、消費税メチル化および非メチル化インサートと非メチル化ベクトル。 </li><li>飽和フェノール、pHが6.6を使用してゲル抽出DNA。簡単に述べると、ベクターまたはインサートを含有するDNAゲルの重量を量ります。 DNAゲルの0.1グラムあたりフェノール100μlのを使用してください。ガラスダウンスホモジナイザーを用いてフェノールにDNAゲルをホモジナイズします。 </li><li> （フェノール量の1/5を使用して）、クロロホルムを加え、20秒間のサンプルを横に振ります。 2-3分間、室温でサンプルをインキュベートします。 4℃での最大速度（16.1 X千XG）で15分間遠心。 </li><li>水溶液を削除し、3 M酢酸ナトリウムとエタノールの2.5倍の量の0.1Xボリュームを追加。 -80℃で1時間サンプルをインキュベートします。インキュベーション後、エタノールを除去し、好適な緩衝液30μlにDNAを再懸濁。 DNAの大幅な損失を挿入し、ベクトルの次の分離を発生し、30〜50％のLOssです。 </li><li> T4 DNAリガーゼ38を用いて、非メチル化ベクターを再ライゲーションメチル化及び非メチル化インサート。ライゲーション反応に挿入するためのベクターの4：1の比を使用してください。メーカーの指示に従ってセットアップ反応。反応のための50μlの総容量を使用してC°またはアイスバケットの上に蓋を氷上で-20℃でO / Nインキュベートします。 </li><li>連結後、好適な、市販のシリカゲル膜クリーンアップキットを用いてDNAのクリーンアップを実行します。 DNAの有意な損失は、次のライゲーション反応、DNAのおよそ30-50％の損失を生じます。 45分間、100Vで1％アガロースゲル上でのDNA実行することにより、再連結を確認し、再連結したプラスミド（ 図4D）の濃度を評価します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って商業トランスフェクション試薬を用いて、D54細胞にメチル化または非メチル化プラスミドをトランスフェクトします。よく0.14×10 6細胞 /で12ウェルプレート上にシードD54細胞。 </li><li> 24時間後、トランスフェクト細胞のwi（1）非methyatedのCpG-luc2プラスミド+ウミシイタケまたは他の制御ルシフェラーゼベクターまたは（2）メチル化CpG-luc2プラスミド+ウミシイタケまたは他の制御ルシフェラーゼベクターのいずれかの目等しい濃度。 </li><li>細胞は、デュアルルシフェラーゼアッセイを行う前に24時間トランスフェクトすることを許可します。製造者の指示に従ってアッセイを行います。ルミノメーターを用いて測定値を実行します。三連で各ウェルをお読みください。 </li><li> ウミシイタケまたは他の制御ルシフェラーゼ活性に対してホタルルシフェラーゼ活性の比率を計算します。非メチルホタルに制御ルシフェラーゼ活性：メチル化されたホタルを正規化対照ルシフェラーゼ活性を、非メチル化ルシフェラーゼ活性によってメチル化ルシフェラーゼ活性を分割して</li></ol>

The authors have no disclosures.

This protocol describes the isolation of an enriched population of astrocytes via FACS as well as a variety of techniques that allow for both correlative and causative studies between DNA methylation and gene expression. These techniques, used in isolation or in combination, are particularly useful for laboratories that work with tissue of high cellular heterogeneity or are interested in the DNA methylation status of a particular gene or gene region versus global DNA methylation changes. One relatively unique challenge in studying the epigenome of the CNS is the diversity of cell populations. As genes of interest may be expressed to varying degrees with both temporally and spatially unique patterns in the CNS, the use of whole tissue often confounds data from both transcription and DNA methylation studies. 
Kir4.1, the protein of interest, is spatially and temporally regulated in astrocytes, oligodendrocytes, and ependymal cells 13,14,40-47. Thus, the use of eGFP-S100&#946; transgenic animals 27 for FACS provided an enriched population of astrocytes 15, and therefore a more accurate assessment of the level of gene transcription and DNA methylation specific to this cell population. Despite this advantage, the use of FACS sorted astrocytes presents several challenges. Preparation of a cell suspension for FACS requires significant disruption of whole tissue and several changes in the temperature and external media environment. While pH and temperature are maintained to promote cell viability and stabilize cellular machinery, it is reasonable to assume that some changes in DNA methylation occur subsequent to the mechanical and enzymatic disruption of cells. Additionally, in comparison to the use of whole tissue, FACS sorting of astrocytes yields significantly lower amounts of RNA and DNA for downstream molecular studies. This low ratio of yield to labor/reagent may limit the feasibility of some studies depending on the number and complexity of subsequent molecular applications as well as brain regions under study. Taking time to maintain proper pH and temperature as well as working efficiently to reduce total protocol time will aid in isolating healthy cells and thus high quality DNA/RNA. 
In regards to methylation studies, a variety of applications are currently available for detection of DNA methylation 48,49. Methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) was utilized to study KCNJ10, the gene of interest. MS-HRMA is useful in screening changes in DNA methylation of any given region of a gene of interest. This technique incorporates many of the same basic concepts and procedures as standard PCR amplification 50. Thus, reactions can be setup using a number of thermal cyclers and data analysis performed in most laboratories familiar with standard molecular techniques. One caveat to MS-HRMA is that the method provides estimates of the methylation status of a given region of DNA. This is in contrast to pyrosequencing which provides exact percentages of methylation of specific CpG sites. Additionally, depending on the number of CpG sites assessed within one region, using a linear regression may skew results for those regions with limited numbers of CpG sites. 
In studying the ability of DNA methylation to regulate KCNJ10 gene expression, we supplemented correlative studies with a dual luciferase assay to directly assess changes in the transcriptional activity of the KCNJ10 gene following hypermethylation. Use of the luciferase assay allows for alteration of the methylation status of a specific region of the gene and subsequent assessment of transcriptional activity directly related to these changes. Two major challenges of the luciferase assay are the laborious nature of the protocol and the loss of DNA input through each sequential step. Validation of the quantity and quality of DNA following each reaction as well as starting with a sufficient amount of DNA is essential to acquiring adequate amounts of DNA for transfection. Overall, the use of these techniques can be performed using tools found in most molecular laboratories and be can performed without the use of a large genomic sequencing facility, making these techniques widely accessible to investigators interested in DNA methylation.

Epigenetics is the study of chemical modifications that can affect the transcriptional activity of the genome. Essentially, without a change in the DNA sequence, epigenetic modifications such as DNA methylation, histone acetylation, and histone methylation are sufficient to reversibly alter patterns of gene expression 1. DNA methylation, a potent regulator of gene expression, is the most well characterized epigenetic modification. DNA methylation is the covalent attachment of methyl groups on the C5 position of a cytosine, typically the cytosine of a cytosine-guanine dinucleotide, also known as a CpG site. Areas that contain a high density of CpG sites are known as CpG islands (CGIs). CGIs are frequently associated with transcriptional start sites (TSS) and gene promoters 1-3. Thus, while changes in DNA methylation at CGIs are not always concomitant with changes in cellular expression or function, changes in DNA methylation at CGIs can exert powerful regulation on transcriptional activity 2. 
Historically, DNA methylation was observed to be essential in embryogenesis, imprinting, and development, with little changes in the levels of DNA methylation occurring in post-mitotic cells (with the exception of alterations in cancer-related genes) 4,5. However, the field of neuroepigenetics has highlighted an important non-developmental role for DNA methylation. Specifically, cognitive epigenetics has redefined DNA methylation as a highly plastic mechanism integral in mediating both the transcriptional activation and repression of genes essential for the process of learning and memory 6. Apart from cognitive epigenetics, studies modeling ischemic injury and neuropathic pain characterize DNA methylation as a labile mechanism that responds rapidly to a variety of CNS insults 7-9. In regards to astrocytes, several lines of evidence suggest DNA methylation plays an important role in astrogliogenesis. Fan et al., found that conditional KO of DNMT1 in neural progenitor cells (NPCs) resulted in precocious development of astrocytes concordant with a global state of hypomethylation 10. Additionally, Perisic et al., concluded differential levels of DNA methylation of the GLT-1 promoter mediated differential levels of expression of the glutamate transporter in the cortex and cerebellum, emphasizing a role in DNA methylation in establishing brain-region specific patterns of astrocytic gene expression 11. Overall, numerous studies underscore the dynamic and labile nature of DNA methylation in the CNS as environment, drugs, and injury have all been shown to change DNA methylation and often, gene expression 4,9. Together, these neuroepigenetic studies point to DNA methylation as a feasible therapeutic target with the potential to mitigate a variety of CNS pathologies.
As the field of epigenetics expands its understanding of the role of DNA methylation in neurodevelopment and disease, the challenge of moving DNA methylation towards a therapeutic target is performing not only correlative, but causative studies that define specific gene targets and sites. Additionally, surveying changes in DNA methylation specific to brain region and cell type remains an ongoing and time worthy challenge unique to the field of neuroepigenetics. This protocol utilizes a variety of techniques including fluorescence-activated cell sorting (FACS) of astrocytes, methylation-sensitive high resolution melt analysis (MS-HRM), and a methylation luciferase assay to investigate the DNA methylation status of KCNJ10, a gene that encodes for Kir4.1. Kir4.1 is a glial specific potassium channel that demonstrates both brain region and cell specific patterns of expression in the CNS 12-16. Kir4.1 expression increases moving from rostral to caudal CNS regions, with the highest expression occurring in the spinal cord 15. Although the channel is expressed in ependymal cells, oligodendrocytes and their precursor cells, Kir4.1 is predominantly expressed in astrocytes and thought to be essential for maintaining homeostatic levels of potassium as well as supporting glutamate uptake by setting the astrocytic resting membrane potential at a hyperpolarized -80mV 12,16-19. Importantly, the expression of Kir4.1 is non-static both during development and following multiple forms of CNS injury 20-25. We wished to examine the epigenetic regulation of this channel, specifically in astrocytes during development. The techniques utilized offer gene-specific and targeted CpG site analyses that provide causal evidence for a role of DNA methylation in regulating KCNJ10 gene expression. These techniques can be applied to other genes.

<table><tbody><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Primer</td><td>Applied Biosystems</td><td>online</td><td>software to localize CpG Islands</td></tr><tr><td>EZ DNA methylation Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td></td></tr><tr><td>Rat Premixed Calibration Standard</td><td>EpiGenDx</td><td>80-8060R-Premix</td><td></td></tr><tr><td>CpG Methylase (M.Sssl)</td><td>Zymo Research</td><td>E2010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction&amp;nbsp;</td><td>QIagen</td><td>28704</td><td>Used for gel extraction and DNA cleanup</td></tr><tr><td>Restriction enzymes</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB cutter</td><td>New England BioLabs</td><td>online</td><td>verify restriction digest sites</td></tr><tr><td>Dual Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Luc2 vector, pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>renilla vector, pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>TD-20/20 Luminometer</td><td>Turner Designs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX and Plus Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A12621</td><td></td></tr><tr><td>Phenol, saturated pH 6.6/6.9</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 17501-100</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeltDoctor Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4415440</td><td></td></tr><tr><td>High Resolution Melt (HRM) Software v2.0</td><td>Life Technologies</td><td>4397808</td><td></td></tr><tr><td>AB SDS software v2.3</td><td>Life Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB High Resolution Melting Getting Started Guide&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB 7900HT Fast Real-Time System</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

correlating gene-specific dna methylation changes with expression and transcriptional activity of astrocytic kcnj10 (kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

アストロサイトの濃縮集団は、eGFPの-S100βトランスジェニック動物27のFACSソーティングを介して取得しました。生後50日目（P50）より古い動物から単離された細胞や分子の分子の品質を低下させるには、P0〜P40老化した動物は、そのような実験のために最適です。皮質組織は、これらの実験に使用しました。 2〜6匹の動物からの皮質を一緒にプールしました。 FACSは、UAB包括的フローサイトメトリーコア施設で行いました。ソートは、ベクトン・ディッキンソンFACSARIA IIで実施しました。 eGFPの励起は488nmのレーザーを用いて得ました。補償は必要ではなかったです。ゲートされた人口は、前方および側方散乱（ 図1B）に基づいて目標としました。生細胞の集団は、臭化エチジウム死細胞の指標とゲーティング（ 図1C）を用いて決定しました 。二つの異なる集団は、eGFPのプロファイル（ 図1D）に基づいて観察されました。経験的テスト、高いEGFPで細胞集団を通じプロファイルは、EGFP陽性細胞集団（ 図1F-F &#39;&#39;）と同定されました。下のeGFPプロファイルを有する第二集団の視覚分析は、おそらくアストロサイトのプロセス（ 図1G-G &#39;&#39;）から破片を表すのeGFPを発現する細胞の断片を明らかにしたが、核を欠いています。解離が、前（ 図2A）をソートすると（ 図2B）をソートした後に、次の解離のeGFP陽性のアストロサイトの代表的な画像が表示されます。単離されたeGFP陽性細胞集団はALDH1L1 mRNAを、星状細胞特異的マーカー39（ 図2C）の40倍の増加を示しました。さらに、NG2 +のOPCおよびアストロサイト39S100βの共有の発現にもかかわらず、我々は、濃縮された星状細胞集団（ 図2C-D）の単離を示す、39オリゴデンドロサイト前駆細胞をNG2 mRNAの4倍の低下、マーカーを観察しました。 RNAそしてFACSから単離されたDNAは、星状細胞は、その後のメチル化研究のために使用されるのに十分な質および量であったソート。様々な年齢や動物の数から単離した全RNAおよびDNAは、FACS（ 表5）以下の分子の分子の期待利回りの基準として表示されます。これは収率も使用動物数、インキュベーション時間、及び研究者の経験に基づいて変化することに留意すべきである。 表6は、利用動物およびインキュベーション期間の数に応じて取得されたイベントの変動を示しています。 メチル化研究のために、高品質とDNAの十分な量で開始することに成功し、下流のアプリケーションに不可欠です。 RNAまたはDNA抽出のための組織の十分な溶解を確実にするために、組織または細胞のすべての均質化は、溶解中に泡立てないように注意しながら、23G針7Xを使用して粉砕して行きました。いったん高品質のDNAを抽出し、重亜硫酸塩変換されedは、関心領域は、MS-HRMAの対象とすることができます。バイサルファイト変換したDNAの品質と濃度を評価する際に重亜硫酸塩は、DNAを一本鎖さに換算し、分光光度計は、33のOD率で読み取るように設定されるべきであることに注意してください。バイサルファイト変換したDNAのための260/280の値は2.20から2.70の範囲でした。 メチル化の研究を開始する前に、それが適切に選択して、MS-HRMA研究のためのサーマルサイクラーをキャリブレーションすることが重要です。さらに、1は、MS-HRMAから生成された生データをエクスポートし、活用する方法を決定する必要があります。 アプライドバイオシステムズ高解像度融解はガイドが 7900HTサーマルサイクラーを校正するのを支援するために利用された入門します 。最後に、データを抽出して、その後のデータ分析のためのHRM解析ソフトウェアにインポートしました。プロトコルに詳述されているように、前と後の起動と停止のパラメータは、融解曲線の遷移の近くに設定しました。ピーク温度の差は、未知のSAのメチル化状態を推定するために使用されましたmples。 MS-HRMAから取得した推定メチル化データ （ 図3C）、15（パイロシーケンシングデータは、MS-HRMプライマーと同じ領域を標的とするプライマーを使用して家の中で生成された）、パイロシーケンシングから生成されたメチル化データに密接に対応します。 デュアルルシフェラーゼアッセイは、目的の遺伝子（ 図4A）の過剰メチル化領域の転写活性を評価するために利用されました。各のCpGアイランドluc2プラスミドを直鎖状にした後、メチル化されていました。しかし、インサート（CpGアイランド）とベクトル（luc2）の両方が反応中にメチル化されているので、1は、メチル化のインサートを切除しなければならないし、再ライゲートした非メチル化ベクトルに。プラスミドの大規模な操作に、大きな損失が発生し、1は、十分な出発物質で開始する必要があります。 HpaII消化のHpaIIのみが非メチル化DNA（ 図4B）を消化するように、各プラスミドのメチル化状態を確認するために利用されました。これは、ことに留意すべきですO / Nメチル化が不十分である場合には、CpGメチラーゼの付加的なSAMの1×と1×30℃でのインキュベーションの1時間後に添加してもよいです。補足SAMおよびCpGメチラーゼを加えた後、O / Nインキュベーションを継続します。メチル化および非メチル化CpGアイランド-luc2プラスミドの生成は、ルシフェラーゼ活性の測定を介したDNAメチル化と転写活性の間の変更を直接評価することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52406/52406fig1.jpg" /> 図1. FACS選別は、eGFPの+細胞popoulationを隔離する。50mlコニカルチューブの（A）の使用上の穴カットをパパイン消化の間に表面のガス交換を可能にします。 （B）選別された細胞は、前方および側方散乱プロットに基づいてゲーティングしました。死細胞インジケータベース（C）、臭化エチジウム、生細胞集団（赤）ゲートを利用しました。 （D）ライブCEL高eGFPのプロファイル（緑）と低eGFPのプロファイル（紫）と1 - リットルの人口は2つの集団を示しました。すべてのグラフは、y軸は側方散乱領域（SSC-A）を表します。 x軸は前方散乱面積（FSC-A）、緑色蛍光タンパク質の領域（GFP-A）、または臭化エチジウム（EtBrを）を表します。 （EG）細胞解離はヘキストでインキュベートし、解離した細胞の20μlのカバースリップ上に置き、画像化しました。大規模なプロセスと（E-E &#39;&#39;）のeGFP +アストロサイトは、（NS）をソートする前に可視化しました。並べ替え、高のeGFP +集団（POS）の後（FFは&#39;&#39;）ヘキスト染色で局在共同のeGFP +細胞ソーマを示しています。 （G-G &#39;&#39;）低eGFPの人口はおそらく（すべての画像のため、スケール= 20μm）のアストロサイトの破片を表す、ヘキスト染色と共局在しなかったのeGFP +染色を実証し<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52406/52406fig1large.jpg" target="_blank">てください。</a>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52406/52406fig2.jpg" /> eGFP-S100のβトランスジェニック動物の仕分け図2、FACS、FACSの前に解離した細胞（NS）20μlのが示されているアストロサイトの濃縮集団を提供する。（A）、プロセスは（=50μmのスケール）無傷のまま。 （B）代表画像ポストFACS（FACS）細胞が示されています。星状細胞突起を除去し、細胞体のままである（スケール= 20μm）としています。 （C）のqPCRデータは、FACSでALDH1L1 mRNAにおける40倍の増加を示しているソートされていない人口（NS）に比べ細胞（FACS）を選別しました。 （D）NG2 mRNAは、FACSで4倍減少するが。ソートされていない人口（NS）と比較して、細胞をソート<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52406/52406fig2large.jpg" target="_blank">するには、ここをクリックしてください</a><html>この図の拡大版を表示します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52406/52406fig3.jpg" /> MS-HRM研究のための図3.サンプル・データと分析。メチル化の標準から生成された温度差プロットの（A）の例。対応パーセントのメチル化は、各曲線（B）ラットメチル化標準から生成された線形回帰式の例のために標識されます。 （C）（pyroseq、緑色のバー）とMS-HRMA（灰色のバー）をパイロシーケンシングから取得％のメチル化の比較は、KCNJ10の変化する領域についてのメチル化の同様のレベルを示しています。MS-HRMと同じ領域を標的とするプライマーを使用して、家の中で生成されたパイロシークエンスデータ分析。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52406/52406fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 常に &quot;&gt;：&quot;キープtogether.withinページ= FO &quot;10トン<img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52406/52406fig4.jpg" /> 図4.デュアルルシフェラーゼアッセイを差動メチル化遺伝子領域の転写活性の評価が可能になる。ルシフェラーゼ転写活性アッセイの（A）図は、プロトコルのワークフローを示しています。 （B）DNAゲルは、のHpaII消化後に非メチル化プラスミド対メチル化の違いを表示します。非メチル化DNAを容易にDNAプラスミドの成功したメチル化を実証し、メチル化DNAと比較してのHpaII消化後の消化されます。 （C）DNAゲルは、二重消化後、インサートからのベクトルの分離を示しています。 DNA分離に続いて、ベクターとインサートをゲル抽出しています。 （D）DNAゲルは、ベクターとインサートの成功の再連結を示しています。再連結されたプラスミドは、未処理のプラスミド（untx）と同様の分子量を有しています。 NM、非METhylated; M、メチル化; RL、再連結しました。未処理、untx。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52406/52406fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 。 </td><td>容量（μL） </td><td> ×3 + 10％過剰</td><td>サンプルのX＃ </td></tr><tr><td> MeltDoc MM </td><td> 10μlの</td><td> 33μL </td><td></td></tr><tr><td>プライマー1 </td><td> 1.2μL </td><td> 3.96μlの</td><td></td></tr><tr><td>プライマー2 </td><td> 1.2μL </td><td> 3.96μlの</td><td></td></tr><tr><td> gDNA </td><td> 1μL </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td> dH 2 0 </td><td> 6.6μL </td><td> 21.78μlの</td><td></td></tr></tbody></table> MeltDoctorマスターミックスの表1計算例。各MS-HRMのREAを実行します。ピペッティングの誤差を補償するため、10％の過剰の三連でction。最後の列は、サンプルの複数の番号のために必要な計算を示しています。各反応の総容量は20μlです。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>サイクル</td><td>温度（℃） </td><td>時間（秒） </td><td>ランプ速度（％） </td></tr><tr><td></td><td> 95°C </td><td> ：15 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 40倍</td><td> 95°C </td><td> ：15 </td><td> 100 </td></tr><tr><td></td><td> 60°C </td><td> ：60 </td><td> 100 </td></tr><tr><td>融解パラメータ</td><td> 95°C </td><td> ：10 </td><td> 100 </td></tr><tr><td></td><td> 60°C </td><td> ：60 </td><td> 100 </td></tr><tr><td></td><td> 95°C </td><td> ：15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 60°C </td><td> ：15 </td><td> 100 </td></tr><tr><td>ホールド</td><td> 4<html> 76; C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表2：増幅のためのサンプルプロトコールは、融解曲線の増幅および生成の40サイクル、続いて10分間95℃でサンプルを変性。融解パラメータは、表の中に記載されています。高解像度融解温度の取得を可能にするランプ速度の変化に注意してください。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>パーセントメチル化（ラット標準） </td><td>ピーク温度差</td></tr><tr><td> Y </td><td> X </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 5.670116 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 10.70448 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 15.5044 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 25.52295 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 34.43047 </td></tr><tr><td> 75 </td><td> 43.80894 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 53.88717 </td></tr></tbody></table>ピーク温度差データの NT &quot;&gt; 表3の例パーセントのメチル化標準はy座標としてラベル付けされる。x座標としてピーク温度差データは標識されている。代表的なピーク温度差データは、1つの遺伝子領域からのMS-HRMを用いて取得しました。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>ピーク温度差</td><td>推定メチル化</td></tr><tr><td> X </td><td> Y </td></tr><tr><td>サンプル1（N = 4） </td><td></td></tr><tr><td> 47.450 </td><td> 81.115 </td></tr><tr><td> 46.​​292 </td><td> 78.657 </td></tr><tr><td> 41.694 </td><td> 68.894 </td></tr><tr><td> 47.292 </td><td> 80.779 </td></tr><tr><td>サンプル2（N = 4） </td><td></td></tr><tr><td> 29.925 </td><td> 43.904 </td></tr><tr><td> 24.269 </td><td> 31.894 </td></tr><tr><td> 25.061 </td><td> 33.575 </td></tr><tr><td> 25.389 </td><td> 34.272</td></tr></tbody></table> 算出された推定パーセントのメチル化の例を表4。不明メチル化状態のサンプルのピーク温度の差は、線形回帰式を用いて％のメチル化を推定するために使用されます。 2つの異なる状態、サンプル1とサンプル2からの代表的なデータが示されています。 N =各条件について4。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>年令</td><td>動物の数</td><td>トータルRNA（NG） </td><td>全DNA（NG） </td></tr><tr><td> P4-P10 </td><td> 3-6 </td><td> 455から868 </td><td> 265-1523 </td></tr><tr><td> P19-P22 </td><td> 1-2 </td><td> 220から680 </td><td> 583-1483 </td></tr><tr><td> P40-P50 </td><td> 3-4 </td><td> 198から260 </td><td> 578-1700 </td></tr></tbody></table> FACSから取得した表5の全RNAとDNAは、細胞を選別した。年齢とFAで使用される動物の数CS実験が記載されています。各N.全RNAとDNAが予想される収量の基準として表示されているため、両方の皮質を利用して、注意してください。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>年令</td><td>動物の数</td><td>順位のイベント</td><td> NEGイベント</td><td>インキュベーション時間（37℃） </td></tr><tr><td> P26 </td><td> 1 </td><td> 2.18X10 ^ 6 </td><td> 1.15X10 ^ 6 </td><td> 20：00分</td></tr><tr><td> P26 </td><td> 2 </td><td> 4.4X10 ^ 6 </td><td> 2.78X10 ^ 6 </td><td> 20：00分</td></tr><tr><td> P26 </td><td> 2 </td><td> 9.2X10 ^ 6 </td><td> 3.3×10 ^ 6 </td><td> 30:00分</td></tr></tbody></table>正（EGFP +）イベントや負のイベントのP26番号で生後26でFACSから取得したイベントの表6数を利用する動物の数およびインキュベーション期間によって異なります。

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Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

アストロサイトの発現および転写活性を有する遺伝子特異的DNAメチル化の変化の相関<em&gt; KCNJ10</em&gt;（Kir4.1）

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

correlating-gene-specific-dna-methylation-changes-with-expression

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

7.9K ビュー.  University of Alabama at Birmingham. DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression. 

ビデオ: Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

遺伝学

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the differentiation of hiPSCs derived from a patient with the triplication of the alpha-synuclein gene (SNCA) locus into Parkinson&#8217;s disease (PD)-relevant dopaminergic neuronal populations. Accumulating evidence has shown that high levels of SNCA are causative for the development of PD. Recognizing the unmet need to establish novel therapeutic approaches for PD, especially those targeting the regulation of SNCA expression, we recently developed a CRISPR/dCas9-DNA-methylation-based system to epigenetically modulate SNCA transcription by enriching methylation levels at the SNCA intron 1 regulatory region. To deliver the system, consisting of a dead (deactivated) version of Cas9 (dCas9) fused with the catalytic domain of the DNA methyltransferase enzyme 3A (DNMT3A), a lentiviral vector is used. This system is applied to cells with the triplication of the SNCA locus and reduces the SNCA-mRNA and protein levels by about 30% through the targeted DNA methylation of SNCA intron 1. The fine-tuned downregulation of the SNCA levels rescues disease-related cellular phenotypes. In the current protocol, we aim to describe a step-by-step procedure for differentiating hiPSCs into neural progenitor cells (NPCs) and the establishment and validation of pyrosequencing assays for the evaluation of the methylation profile in the SNCA intron 1. To outline in more detail the lentivirus-CRISPR/dCas9 system used in these experiments, this protocol describes how to produce, purify, and concentrate lentiviral vectors and to highlight their suitability for epigenome- and genome-editing applications using hiPSCs and NPCs. The protocol is easily adaptable and can be used to produce high titer lentiviruses for in vitro and in vivo applications.

Targeted DNA epigenome editing represents a powerful therapeutic approach. This protocol describes the production, purification, and concentration of all-in-one lentiviral vectors harboring the CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene for epigenome-editing applications in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons.

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these animal models. The rat is one particular model animal where an epigenetic tool can complement many pharmacological and behavioral studies to provide insightful mechanistic information. To this end, we adapted the SureSelect Target Capture System (referred to as Methyl-Seq) for the rat, which can assess DNA methylation levels across the rat genome. The rat design targeted promoters, CpG islands, island shores, and GC-rich regions from all RefSeq genes. 
To implement the platform on a rat experiment, male Sprague Dawley rats were exposed to chronic variable stress for 3 weeks, after which blood samples were collected for genomic DNA extraction. Methyl-Seq libraries were constructed from the rat DNA samples by shearing, adapter ligation, target enrichment, bisulfite conversion, and multiplexing. Libraries were sequenced on a next-generation sequencing platform and the sequenced reads were analyzed to identify DMRs between DNA of stressed and unstressed rats. Top candidate DMRs were independently validated by bisulfite pyrosequencing to confirm the robustness of the platform.
Results demonstrate that the rat Methyl-Seq platform is a useful epigenetic tool that can capture methylation changes induced by exposure to stress.

Here, we describe the protocol and implementation of Methyl-Seq, an epigenomic platform, using a rat model to identify epigenetic changes associated with chronic stress exposure. Results demonstrate that the rat Methyl-Seq platform is capable of detecting methylation differences that arise from stress exposure in rats.

ストレス曝露に伴うエピジェネティックな変化を識別するためにラット メチル Seq プラットフォーム

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

生化学

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

神経科学

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a variety of human retinal degenerative diseases and pinpoint new treatment approaches. The nuclear architecture of mouse retina is organized in two different patterns: conventional and inverted. Conventional pattern is universal where heterochromatin is localized to the periphery of the nucleus, while active euchromatin resides in the nuclear interior. In contrast, inverted nuclear pattern is unique to the adult rod photoreceptor cell nuclei where heterochromatin localizes to the nuclear center, and euchromatin resides in the nuclear periphery. DNA methylation is predominantly observed in chromocenters. DNA methylation is a dynamic covalent modification on the cytosine residues (5-methylcytosine, 5mC) of CpG dinucleotides that are enriched in the promoter regions of many genes. Three DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) participate in methylation of DNA during development. Detecting 5mC with immunohistochemical techniques is very challenging, contributing to variability in results, as all DNA bases including 5mC modified bases are hidden within the double-stranded DNA helix. However, detailed delineation of 5mC distribution during development is very informative. Here, we describe a reproducible technique for robust immunohistochemical detection of 5mC and another epigenetic DNA marker 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), which colocalizes with the &#34;open&#34;, transcriptionally active chromatin in developing and postmitotic mouse retina.

The objective of this report is to describe the protocol for robust immunohistochemical detection of epigenetic markers, 5-methylcytosine (5mC) and 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in developing and postmitotic mouse retina.

5-メチルシトシンと開発の 5-ヒドロキシメチルシトシンの免疫組織化学的検出と後マウス網膜

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

発生生物学

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

生物工学

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

アストロサイトの発現および転写活性を有する遺伝子特異的DNAメチル化の変化の相関

要約

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この動画の章

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

ストレス曝露に伴うエピジェネティックな変化を識別するためにラットメチル Seq プラットフォーム

脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

5-メチルシトシンと開発の 5-ヒドロキシメチルシトシンの免疫組織化学的検出と後マウス網膜

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

アストロサイトの発現および転写活性を有する遺伝子特異的DNAメチル化の変化の相関

要約

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DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

ストレス曝露に伴うエピジェネティックな変化を識別するためにラット メチル Seq プラットフォーム

脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

5-メチルシトシンと開発の 5-ヒドロキシメチルシトシンの免疫組織化学的検出と後マウス網膜

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

ストレス曝露に伴うエピジェネティックな変化を識別するためにラットメチル Seq プラットフォーム