The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

注：以下のプロトコルは、ジョージア工科大学の治験審査委員会（IRB）によって設定されたガイドラインに準拠しています。 1.採血およ​​び赤血球単離法<ol><li> 10ミリリットルのヘパリン化バキュテナーチューブ中にドナーからの血液の40〜120ミリリットルを収集します。コレクションの4時間以内にPBMC（末梢血単核細胞）の分離を開始します。この時間中、RTで血液を保つ。 注：これは下PBMCの収量になりますようにRTまたは4℃における血液のO / Nストレージが推奨されていません 。 </li><li>氷冷（4℃）を滅菌PBSで1：全血の1希釈する。 </li><li>ピペット空、無菌の50mlの円錐チューブに氷のように冷たい親水性多糖類の10ミリリットル。静かに親水性多糖類の上に希釈した全血を移す。 </li><li>非常にゆっくりとチューブの側面に沿ってゆっくり設定やピペット血液中の25ミリリットルピペットを使用してください。血液が前にセントリに糖類と混合されていないことを確認してくださいfugation親水性多糖類は、細胞に対して毒性とそうでない場合であるため、PBMCの収率が低くなります。 </li><li> 4℃で400×gで30分間遠心血液サンプル。可能な場合は、遠心分離後の良好な分離のための最大値の半分に遠心分離機のブレーキ速度を低下させる。 </li><li>遠心分離した血液サンプルの血漿/血小板分画から吸引する。慎重に直接パックRBC層の上に親水性の多糖類の層を吸引除去する。 </li><li>パックされたRBCの8〜10ミリリットルを収集し、1希釈する：非無菌の0.9％NaCl生理食塩水で1を。 </li></ol> 2.共焦点顕微鏡評価糖化の血塊構造（模擬糖尿病血塊） <ol><li> 37℃でのヒトフィブリノーゲンおよび蛍光標識されたヒトフィブリノゲン結合体を解凍。 </li><li>マイクロ遠心チューブを卒業した0.5ミリリットルに次のようにピペット。 <ol><li>健康、通常のフィブリノゲンの塊については、10％の蛍光標識したヒトフィブリノーゲンヒトフィブリノゲンをミックス5 mg / mlの濃度で50mMのトリス/ 100mMのNaCl緩衝液中のコンジュゲート。 </li><li>人工的に糖化フィブリノゲンは、（糖尿病血栓をシミュレートするため）6.8 mg / mlでの得られた濃度50mMのトリス/ 100mMのNaClに溶解したグルコースの5 mM溶液中のヒトフィブリノーゲンおよび10％の蛍光標識されたフィブリノゲン結合体をインキュベートする。 </li></ol></li><li>光への曝露を避けるために、不透明材料を用いたマイクロ遠心管を覆う。 48時間、37℃の水浴中でチューブをインキュベートする。 </li><li>スライドの2側面に薄い接着剤を貼り付けてガラス顕微鏡スライド上室を作る。 </li><li> 48時間のインキュベーション期間の後、RTで活性化XIII因子およびヒトαトロンビンを解凍することによってフィブリン形成のための試薬を調製する。 </li><li> 5のCaCl 2のバッファに80 U / mlに活性化XIII因子を希釈します。 </li><li> 5のCaCl 2のバッファに4 U / mlにトロンビンを希釈します。 <ol><li>通常の血栓のために、フィブリノゲン、活性化XIII因子、およびトロンビ​​ンの最終濃度は2.5メートルであることを確認G / mlで、20 U / mlで、それぞれ50μlの容量で1単位/ ml、。 </li><li>糖化血栓のために、フィブリノゲン、活性化XIII因子、およびトロンビ​​ンの最終濃度がそれぞれ50μlの容量で、3.4 mg / mlの、20 U / mlとし、1単位/ mlであることを確認してください。 </li></ol></li><li>すぐに接着剤によって形成されたチャンバー内にフィブリン溶液を30μlのピペット。 </li><li>接着剤の2層の上に0.15ミリメートルの厚さの22ミリメートル×22 mmのガラスカバースリップを置きます。乾燥からフィブリン塊を防止するための明確な接着剤で開放側をシール。接着剤はフィブリン塊と相互作用しないことを確認してください。 </li><li>フィブリン塊は、共焦点イメージングの前に2時間21〜23℃で重合することができるようにします。 </li><li> 488nmのアルゴンレーザーを40X / 1.30オイルM27レンズを共焦点顕微鏡を用いて血栓の共焦点顕微鏡画像を取る。 </li></ol>鎌状赤血球患者からRBCを含むフィブリン塊の3共焦点顕微鏡評価<ol><li> 37℃でのヒトフィブリノーゲンおよび蛍光標識されたヒトフィブリノゲン結合体を解凍。 </li><li>マイクロ遠心チューブを卒業した0.5ミリリットルに次のようにピペット。 <ol><li>健康な、正常なフィブリン塊のために、5mg / mlの濃度で50mMのトリス/ 100mMのNaCl緩衝液中の10％の蛍光標識されたヒトフィブリノーゲン複合体とヒトフィブリノゲンを混ぜる。 </li><li> SCD RBCを含む塊、ヒトフィブリノーゲン及び50mMトリス/ 100mMのNaClフィブリノーゲンの得られる濃度が10 mg / mlであるような、10％、蛍光標識されたヒトフィブリノゲン結合体を混合する。 </li></ol></li><li>細胞標識溶液を使用して（通常のとRBC分離プロトコルから取得した鎌状赤血球患者からのもの両方）を単離したRBCにラベルを付けます。 <ol><li>任意の選択された無血清培地1ml当たり1×10 6の密度で細胞を懸濁。 </li><li>細胞標識溶液に細胞懸濁液の5μL/ mlのを追加します。優しく穏やかにピペッティングでよく混ぜる。 </li><li&gt;は37℃で20分間インキュベートする。 </li><li> 37℃で5分間1500 rpmで標識されたサスペンションチューブを遠心する。 </li><li>上清を除去し、静かに37℃の培地中の細胞を再懸濁。 </li><li>洗浄手順（3.3.4および3.3.5）をさらに2回繰り返します。 </li></ol></li><li> 5のCaCl 2のバッファに80 U / mlに活性化XIII因子を希釈します。 </li><li> 5のCaCl 2のバッファに4 U / mlにトロンビンを希釈します。 <ol><li>通常の血栓のために、フィブリノゲン、活性化XIII因子、およびトロンビ​​ンの最終濃度がそれぞれ50μlの容量で、2.5 mg / mlの、20 U / mlとし、1単位/ mlであることを確認してください。 </li><li> SCD RBCを含む塊については、フィブリノーゲン、活性化XIII因子、およびトロンビ​​ンの最終濃度は、50μlの容量でそれぞれ5 mg / mlの、20 U / mlであり、1 U / mlであること。確実</li></ol></li><li>フィブリン溶液へのラベルRBCのピペットを10μl。ピペット顕微鏡ガラス上のRBCとフィブリンの30μL（GLのための準備をスライドを参照してくださいycated血栓）。 </li><li>フィブリンは、共焦点イメージングの前に2時間21〜23℃で重合することができるようにします。 </li><li>共焦点顕微鏡を使用して血餅の共焦点画像を撮影し、蛍光標識したフィブリンおよび赤血球を励起して488nmと633nmの波長の励起レーザを利用する。 </li></ol>糖化クロット構造における線維素溶解料金の4共焦点顕微鏡評価<ol><li>糖化血栓における線維素溶解率評価のための糖化血栓（プロトコルステップ2）の共焦点顕微鏡プロトコルを繰り返します。 </li><li>明確な接着剤を用いて、チャンバの両端をシールしないでください。フィブリン塊は、脱水を防ぐために、250mlの水を含む密閉筐体に21〜23℃で1.5時間重合することができるようにします。 </li><li>重合後、共焦点顕微鏡を用いて血栓の画像を得る。 </li><li>チャンバーの開放端にピペットプラスミンおよび毛管作用を介して、血餅を介してプラスミンを分散させる。 <ol><li>のために通常の濃度は、ピペット室の​​開口部にプラスミン200μgの/ mlの25μlを、正常と糖化線維素溶解実験。 </li><li>減少した濃度、ピペット室の​​開口部には50μg/ mlで25μlの糖化血栓のために。 </li></ol></li><li>時系列機能を使用する血餅を溶解するプラスミンのリアルタイムのビデオ映像をキャプチャするために、共焦点顕微鏡ソフトウェア（ 図1参照）。 <ol><li>取得モードをクリックし、選択して &quot;時系列&quot;をサイクル数と記録時間間隔を選択します。 </li></ol></li></ol> 5.フィブリン溶解料金の計算<ol><li>面積（2500ミクロン2）を設定し、血餅の固定領域を溶解するのに必要な経過時間を計算することにより、溶解速度を決定する。以下の式（ 図2）を使用して、溶解率を計算する。 <img alt="式1" fo:content-width="2in" srC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52019 / 52019eq1.jpg&quot; /&gt; </li></ol>フィブリン溶解料金の6.統計解析<ol><li>統計分析ソフトウェアを使用して溶解データを分析する。一方向ANOVAおよび事後テューキー·クレーマー検定44,45を実行します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

疾患状態における凝固機構の構造についての意味のあるデータを得るためには、これらの条件下でのタンパク質および細胞の効果を決定するために、凝固に関与する因子を単離することが重要である。このプロトコルは、in vitroで 、糖尿病およびSCDの状態でフィブリン塊の構造を調査する目的で開発された。 改変された条件は、凝固亢進、アテローム血栓症、およびCVDを引き起こすので、それは、疾患状態におけるフィブリン形成およびフィブリン溶解に関与するメカニズムを理解する必要がある。この実験で得られた共焦点画像から、亢進活性が増加したフィブリノーゲン濃度を引き起こし、糖尿病およびSCDの状態で起こることが明らかである。ネットワーク全体でより多くの分岐点と小さい細孔を有する密度の高いフィブリンネットワークにおける増加フィブリノーゲン濃度の結果。 SCD患者フィブリンネットワークでは、より多くのフィブリン存在府があるだけでなくそれがクラスタにフィブリンを閉じ込めるようにT鎌状赤血球患者から赤血球の集約性質もネットワークの構造を変更します。鎌状赤血球患者の赤血球の塊は、ネットワーク内のフィブリンクラスターの多孔性を低減するが、ネットワーク全体での空隙の濃度を増加させるように思われる。糖化血栓の線維素溶解分析の結果は健康で、正常な血栓のそれよりも減少したプラスミンと低いこと糖化血栓での溶解率の仮説を支持した。しかし、結果はプラスミンの正常な濃度の糖化血栓の溶解率に関する決定的な証拠を提供しなかった。したがって、通常のプラスミン濃度の糖尿病患者のために、効率的な方法でフィブリン塊を分解するのに十分な線維素溶解活性が存在し得ることを結論付けることができる。 この調査研究で行った実験では、単離されたタンパク質及び赤血球ではなく、全血及び血漿を用いた。使用することにより、分離されたタンパク質は、フィブリン塊を合成するために、病気の血栓正常対の間に変更された構造の原因を決定することができる。これは非常に他の血漿タンパク質はフィブリン塊の構造及び形態に干渉する有する可能性を減少させた。それらは、細胞死およびタンパク質分解に対してより脆弱であるしかし、単離されたタンパク質を使用することによって、それが適切に細胞およびタンパク質を格納し、処理するために重要である。 この研究のために選択された共焦点顕微鏡イメージング技術は、細胞およびタンパク質の天然の血栓特性を保持しながらフィブリン血餅構造の像を得る能力によるものであった。共焦点顕微鏡はまた、改善されたコントラスト及び伝統的な光の縮小コピーに比べてノイズが低減された試料の光学的分解能を与えることが示されている。レーザ光が入るのをブロックする非収束光をピンホールに向けられる。共焦点顕微鏡の活用の必要性を不要に固定液の化学物質の添加;したがって、細胞およびタンパク質は、フィブリン塊を形成するそれらの天然のタンパク質の活性を維持することができた。その結果、細胞、タンパク質、および酵素は、リアルタイムの活動の画像やビデオをキャプチャするための共焦点顕微鏡を使用することができ、それらの天然の状態で機能した。共焦点顕微鏡により、フィブリン塊の3D画像が捕捉され、フィブリン塊のプラスミン消化のビデオがリアルタイムで得られた。血餅溶解プロセスの時系列のビデオをキャプチャするために凝固さプラスミンを追加する場合には、均質フィブリンマトリックスを介して酵素を分散させるためにプラスミンを介して毛管作用を使用することが重要であった。これは、追加されたプラスミンの濃度は正確であり、酵素はプラスミンを添加したことをローカル·エリアとは対照的に、全体の血餅を溶解させていることを確認するために行った。 方法この研究で得られた結果は、血餅溶解を見出しダンらによって行われた研究と同様であった率は、対照被験者25よりも糖尿病患者で有意に低かった。両方の研究では、糖尿病（糖化）血栓の溶解率の有意差があった。しかしながら、現在のプロトコルを正確に減少するためプラスミンレベルの糖尿病の状態を表すことができる。さらに、この調査研究の線​​維素溶解に異なる時間間隔で離散的なセクションの分析とは対照的に、共焦点顕微鏡を使用してリアルタイムで連続的に撮影した。ウートンら 47はフィブリン血餅の溶解を調査し、血餅の溶解のためのレートを調べる溶解前面速度（センチメートル/秒）を採用している。彼らは、フロント速度を決定するために、それらの研究において、共焦点画像解析を使用した。代わりに溶解フロント速度の（画像を共焦点で分析された方法のため）現在の研究では、溶解領域の速度を使用した。さらに私たちの研究で開発された方法を検証するために、48で著者は、の数学的モデルを記載した<html>それらは線維素溶解の実効速度定数の関数としての溶解フロント速度を規定したプラスミンによるフィブリン血餅溶解。方程式は次のように与えられる： <img alt="式2" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52019/52019eq2.jpg" />ここに、 <img alt="式3" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52019/52019eq3.jpg" />線維素溶解の実効速度定数を表し、K aは吸着定数、C 午後であるプラスミンの濃度であり、ρFnがフィブリンの密度である。測定量の場合<img alt="式4" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52019/52019eq4.jpg" /> （現在の研究では、共焦点解析により測定）が利用され、連鎖ルールが採用され、これにつながる。 <img alt="式5" fo:content-width="1.25in" src="/files/ftp_upload/52019/52019eq5.jpg" />tは &quot;&gt;一次元のみが単位時間当たりに変化していると仮定すると導く。 <img alt="式6" fo:content-width=".75in" src="/files/ftp_upload/52019/52019eq6.jpg" /><img alt="式7" fo:content-width=".75in" src="/files/ftp_upload/52019/52019eq7.jpg" />このように、実験のための線維素溶解の実効速度定数はにつながる： <img alt="式8" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52019/52019eq8.jpg" />この関係は、線維素溶解の実効速度定数（推測<img alt="式9" fo:content-width=".75in" src="/files/ftp_upload/52019/52019eq9.jpg" /> ）プラスミン濃度（C 午後 ）と領域の溶解速度の関数である<img alt="式10" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52019/52019eq10.jpg" /> 。 この技術はまた、血栓症の研究にするために重要であるSCD患者、少しこの病気に対するフィブリンおよび凝固メカニズムについても知られているからである。フィブリン塊の構造上のSCDの影響で実施が非常に少数の研究が行われている。したがって、この研究から収集した共焦点画像は、取り込まれた鎌状赤血球と血塊構造の稀な可視化を提供します。 グループ間の手段の違いを比較するために、一方向ANOVAおよび事後テューキー·クレーマーテストを使用。一元配置ANOVAは、独立したグループ間の平均値の統計的有意差を決定するために使用される統計的検定である。テューキー·クレーマー事後テストは、各独立したグループからの平均値を比較し、グループの手段が互いに統計的に異なるかを決定するために使用される。一方向ANOVAを実行する前に、結果が有効であることを確実にするために満たされなければならない6前提があります。 6の仮定は以下のとおりです。連続従属変数（溶解率）、独立したヴァリアー一つのイベントが別のイベントに影響を与えない起こるように、各グループ内のデータを観察し、独立して二つ以上の独立したカテゴリ基からなるBLE（糖化、正常、および減少プラスミン糖化）、及び（これはデータで重複がないことを保証する。） 、重大な異常値を含まないデータセットは、通常、シャピロ·ウィルク統計的検定によって検証データ、及びレーベン​​統計的検定によって検証データにおける分散の均一性を配布した。これらの仮定が満たされた後、一方向ANOVAおよび事後テューキー·クレーマー検定は統計的有意性を判定するための閾値として0.05のp値を用いて行った。一方向ANOVAおよび事後テューキー·クレーマーテストの厳格な詳細については、44,45を参照してください。 全体として、この方法は、それらの天然の状態で（病的状態に起因する）は、正常と異常なフィブリン塊の画像化を可能にします。この方法はまた、同様に血餅溶解のリアルタイムイメージングのための詳細を提供溶解率の統計的分析など。血栓が生成し、インビトロで画像化することができる容易さは、細胞及び組織工学における広範囲の用途に有用である。

血管の内皮内層に損傷は止血応答、または血栓の形成を通じて修復される。血液は、細胞外マトリックスに浸透すると、組織因子は、凝固カスケードの開始を容易に血流中の血小板を活性化する。この治癒過程の重要な機械的な構成要素は、高弾性であるフィブリン繊維からなるフィブリンマトリックスであり、かつ大きな力1-4を維持することができる。多くの研究が盛んに過去数十5-13フィブリンの形成構造、および機能を研究している。 例えば、糖尿病および鎌状赤血球のような疾患を有する患者は、心筋梗塞、虚血性心疾患、および脳卒中14-19として血栓性合併症を発症するリスクを有する。 200万人以上の人が新たに米国で毎年糖尿病と診断されている。タイプI：糖尿病には2つの種類があります本体は、体がインスリン抵抗性となり、インスリン、およびタイプII、十分な量を生産することができない。糖尿病患者では、心血管疾患（CVD）は、疾患20,21に関連する罹患率および死亡率の80％の原因である。 鎌状赤血球症（SCD）は、米国22で10万人以上の人々に影響を与える遺伝的血液疾患です。 SCDは難しい細胞が血管系23を通過できるようにすること、三日月形になるように、赤血球を引き起こす点突然変異疾患である。これらの疾患状態の両方は、体内のア​​テローム血栓性の状態を発症する可能性を高める。この理由の一つは、疾患状態14,24-26における変化したフィブリン構造と機能の結果である。 糖尿病や鎌状赤血球症の両方において、アテローム血栓症および心血管疾患（Cを誘導し、凝固亢進とhypofibrinolysis活動がありますVD）健康な患者17,27,28と比較した。これはhypofibrinolysisは、アテローム性動脈硬化症の進行を促進し、早期冠動脈疾患を有する患者について29再発虚血イベントを拘禁することが知られている。現在の原稿では、この特定の設定で、フィブリンの物理的特性の役割を調べた。非疾患患者におけるフィブリン血餅の構造は、薄い繊維、より大きな孔、及び一般に低密度の14,24で構成されている。健康な患者における気孔率の増加及び低密度のフィブリン塊は、線溶16を容易にすることが見出されている。糖尿病及び鎌状赤血球症などhyperthrombotic条件で、健康な患者30-33に2.5 mg / mlの正常レベルから増加するフィブリノーゲン濃度を引き起こすフィブリノゲン産生の増加がある。健康な、非直径と比較して、糖尿病患者に形成されたフィブリン塊は、以上の分岐点を有する、より高密度、より剛性の、多孔性の低いことが見出されているbetic患者14,24,33-35。改変されたフィブリン構造が血栓形成に関与するタンパク質中に存在する糖化メカニズムの結果である。グルコース分子が適切に架橋グルタミンおよびリジン残基33,36,37からのヒト第XIIIa因子（活性化XIII因子）を阻害フィブリノゲン分子、上のリジン残基に結合したときに非酵素（不可逆）糖化が起こる。 フィブリンネットワークの構造解析は、最近広く研究されている。特に、研究者は、電子顕微鏡および血管（内皮）細胞および血管外（線維芽細胞および平滑筋）双方の細胞がフィブリン構造40を分析するフィブリン構造39を利用粘弾性スペクトル解析にどのように影響するかを調べたフィブリンネットワーク38の3D再構成などを利用している実験を使用してフィブリン構造と機械的特性との間の相関を開発し、計算は、41に近づく </sup&gt;。現在の研究の焦点は、シミュレートされた糖尿病及び鎌状赤血球症条件下血餅構造を定式化し、疾患状態における血塊の構造および機能の検査のために、共焦点顕微鏡を使用することであった。フィブリン塊は、ヒトフィブリノーゲン、ヒトトロンビン、および活性化XIII因子から形成された。血栓は、プラスミンを用いて溶解した。糖尿病状態をシミュレートするために、フィブリノゲン濃度の増加は、 インビトロでのフィブリノーゲン糖化を誘発するためにグルコース溶液中でインキュベートした。鎌状赤血球症凝固条件をシミュレートするために、増加したフィブリノゲン濃度は、我々のグループ42によって、以前に行われたように患者から採取した鎌状赤血球ヘマトクリットと混合した。これらの方法は、構造および機能病的条件下でのフィブリン塊の形成及びフィブリン溶解に関与するだけでなく、CVDを誘導するメカニズムを調べた。これらの疾患についての現在の情報に基づいて、糖化されたフィブリン塊構造は、少数のAでより高密度であったND小さな孔。鎌状赤血球患者からの赤血球（RBC）とフィブリン塊はまた、より高密度でありRBCおよび凝集フィブリンクラスターの凝集を示した。これは、以前に43決定された十分に確立された現象である。また、線維素溶解率が健全な、正常なフィブリンと比較して減少しプラスミンとない糖化フィブリン塊に有意に低いであろうと仮説を立てた。結果は、糖化フィブリン塊のために、著しく異なる溶解速度の結果だけ減少プラスミン濃度の条件下で観察されたことを示した。細胞およびタンパク質が凝固活性のリアルタイムビデオのキャプチャを可能にするそれらの天然の状態で残っているため、共焦点顕微鏡を使用して、この実験的手法は、他の撮像方法を超える有意な利点を提供する。合成的に誘導凝固のこの方法は、患者のサンプルを取得し、個々のフィルタリングより効率的で安価でより多くの時間であるタンパク質および酵素。サンプル間のばらつきは、プラズマ中の他のタンパク質の結果として存在しなかったように、また、血栓を合成するために分離されたタンパク質および酵素を使用することにより、血栓を標準化した。

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide)</td><td>GE Healthcare</td><td>45-001-749</td><td></td></tr><tr><td>10 ml heparinized vacutainer tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Human Fibrinogen</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate</td><td>Molecular Probes</td><td>F13191</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml graduated microcentrifuge tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Glucose powder</td><td>Life Technologies</td><td>15023-02</td><td></td></tr><tr><td>FXIIIa</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VIS Confocal Microscope</td><td>Zeiss LSM 510</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris</td><td>Lonza</td><td>S50-642</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD cell-labeling solution</td><td>Life Technologies</td><td>L7781</td><td></td></tr><tr><td>Plasmin</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (5 M NaCl)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>Statistical Modeling Software</td><td>IBM</td><td>SPSS Statistics 22</td><td></td></tr></tbody></table>

experimental and imaging techniques for examining fibrin clot structures in normal and diseased states

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.

糖化フィブリンクロット構造の共焦点顕微鏡分析正常および糖化血栓の共焦点顕微鏡画像を図3に示されている。通常の糖化血栓の共焦点顕微鏡分析は、糖化血餅とし、血餅重合中の活性化XIII因子を添加せずに両方の正常な凝血塊よりも小さい孔を有するより緻密であることが明らかである。 図3Aおよび3Bに、より高いフィブリン濃度（ 図3C及び3D）と糖化血栓未満の緻密な構造を作成低いフィブリン濃度が存在する。 糖化血餅で観察大きな密度（単位面積当たりの繊維の数）は、糖尿病患者で起こる増加フィブリノゲン濃度の結果である。正常な凝血に、フィブリン繊維がより線形であったと活性化XIII因子で重合時に長い繊維を形成しているそう繊維間の架橋を形成する活性化XIII因子の結果である。糖化血餅の場合、繊維はさらに活性化XIII因子を添加して、短いように思われた。これはおそらく起因フィブリノーゲン分子上の糖化領域の存在に変更した重合プロセスの結果である。また、 図3の解析から、それがそうである繊維の厚さはまた、糖化ファイバからの蛍光がより低い強度を有するように見える理由である可能性が高い糖化の結果として減少したことである。 鎌状赤血球患者からRBCを含むフィブリン塊の共焦点顕微鏡分析鎌状赤血球患者からの正常と血栓とRBCのフィブリン塊の構造の共焦点顕微鏡像を図4に示す。予測されたように、鎌状赤血球患者から赤血球を含むフィブリン塊の共焦点画像は、健康なフィブリンcのものより緻密な構造を有していたたくさん。 図4（a）は、フィブリンおよび正常なRBCの均質な分布を示している。しかし、 図4（b）に全くフィブリンネットワークが形成されていないフィブリン及びボイドの塊があります。鎌状赤血球患者由来のRBCを均質に分散されなかったのではなく、フィブリン塊に包埋した。増加した密度（単位面積当たりの繊維の数）はSCD患者における凝固亢進の結果として生じる増加したフィブリノゲン濃度の結果であった。さらに、凝集体を形成する鎌状赤血球患者からRBCの自然な傾向は、フィブリンネットワークに織り込まれるようになったRBCの塊を生ん。これは、通常の患者に比べて形態が著しく異なる異常な血塊構造の形成をもたらした。 図4Bからは、鎌状赤血球患者からの赤血球、フィブリンサンプル中の大きな不均一性を生じ、またフィブリン試料中のRBCの広い空間分布を引き起こしたことが観察された場合のCOM正常な赤血球との健全なフィブリン塊に比べ。対照的に、正常な赤血球との健全なフィブリン塊は、フィブリンネットワーク全体細胞のより均一な分散を示した。 それは、鎌状赤血球患者から赤血球中で重合し、サンプルに含まれているどのくらいのHbSを（鎌ヘモグロビン）は不明である。知られているものが、HbSを任意の量の存在は、正常のHbA分子対単位体積当たりのHbS分子の数が多い細胞を凝集させることである。パンら 46は、それらがデオキシのHbSの、及び、比較のために、オキシのHbS及びオキシ正常成人ヘモグロビンのHbAの凝集/クラスタリング効果を比較した研究では、この現象を実証した。溶液調製とそのサイズや数の後数秒以内に形成されたクラスターは、最大3時間のために比較的堅調に推移しました。研究の結論の一つは、オキシHBSとデオキシのHBs分子の両方がより高い数字デンでクラスタ化されたということでしたオキシのHbA温度の関数としての（通常の）分子よりsity。現在の研究に関連する、これは、鎌状赤血球患者からのRBCが一緒にクラスタ化する可能性が高いようで、それがフィブリノーゲン前駆体から重合されていたとしてフィブリンをトラップされたことを意味します。 ノーマルと糖化血栓の共焦点顕微鏡の溶解率解析これは、線維素溶解率はプラスミン濃度が低下した糖化フィブリン塊に比べて、通常のフィブリン塊のために大きくなるであろうという仮説を立てた。この仮説を試験するために、共焦点顕微鏡は、プラスミンの添加によってフィブリン血餅の溶解速度を評価した。平均（平均）プラスミンを200μg/ mlの添加による通常のフィブリンの溶解速度は、43.2±2 /秒およびプラスミンの200μg/ mlのを加えて糖化フィブリンの平均値（平均）の溶解率は以下26.5であった29.7±11.2ミクロン2 /秒。で溶解糖化フィブリン塊のためにプラスミンの50μg/ mlのは、平均溶解率は12.8±3.1μm2で/ SEだった。 10サンプル毎（30サンプル）の合計、平均及び標準偏差値を決定するために使用した。これらの値は、図5に示されている。0.05のp値は、独立した実験群間の有意性を決定した。線維素溶解率の分析は、通常の血栓の値が減少したプラスミンで糖化（シミュレートされた糖尿病）の塊と比較することを実証した有意に異なっていた。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52019/52019fig1.jpg" /> リアルタイムを得るための方法を詳細に共焦点顕微鏡ソフトウェアからの図1.サンプルのスクリーンショット、フィブリン血餅溶解の連続撮影。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52019/52019fig1large.jpg" target="_blank">THIの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください</a>sのフィギュア。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52019/52019fig2.jpg" /> フィブリンクロットサンプルの溶解速度を計算するために使用する固定領域図2.例の共焦点画像。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52019/52019fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52019/52019fig3.jpg" /> 図3。健康で糖化（糖尿病）フィブリン塊の共焦点画像。緑色蛍光は、フィブリンネットワークを表す。糖化フィブリンは糖尿病患者に形成された血栓を表すのに対し、非糖化フィブリンは、健康な患者に形成された血栓を表します。 （A）活性化XIII因子を添加しない非糖化フィブリン。 （B）活性化XIII因子と非糖化フィブリン。 （Cは </強い&gt;）糖化活性化XIII因子なしのフィブリンおよび（D）活性化XIII因子と糖化フィブリン。赤スケールバーは、50μmを示す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52019/52019fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52019/52019fig4.jpg" /> 鎌状赤血球患者からのRBCを有する図正常なRBCおよびフィブリン塊との健全なフィブリン塊の4共焦点画像を。緑色蛍光はフィブリンネットワークとマゼンタが鎌状赤血球患者から健康とRBCをラベル表し。 （A）活性化XIII因子を持つ通常のフィブリン濃度と鎌状赤血球患者からの活性化XIII因子と赤血球との（B）の増加フィブリンで健康な赤血球。白いスケールバーは、50μmを示す。画像（B）中の白丸は認識可能な鎌状赤血球を示している。 <aHREF = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52019/52019fig4large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52019/52019fig5.jpg" /> 図糖化（糖尿病）フィブリン塊と減少プラスミン濃度の糖化の塊に比べて、通常のフィブリン塊の5線溶率。統計的有意性は、一方向ANOVAおよび事後テューキー·クレーマー多重比較検定に基づいて決定した。 ANOVA分析は、溶解率の平均間の有意差があったことを示した。チューキー·クレイマー検定は、p &lt;0.05でプラスミンが低下した通常の凝血塊との間の平均値の有意差があったことを示した。 *正常な凝血塊からの有意差を示す。

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Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States

In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.

正常および疾患米国でフィブリンクロット構造を調べるための実験とイメージング技術

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on ...

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ビデオ: Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and structure by spectrometry and scanning electron microscopy (SEM). A&#946;, which forms neurotoxic amyloid aggregates in Alzheimer&#39;s disease (AD), has been shown to interact with fibrinogen. This A&#946;-fibrinogen interaction makes the fibrin clot structurally abnormal and resistant to fibrinolysis. A&#946;-induced abnormalities in fibrin clotting may also contribute to cerebrovascular aspects of the AD pathology such as microinfarcts, inflammation, as well as, cerebral amyloid angiopathy (CAA). Given the potentially critical role of neurovascular deficits in AD pathology, developing compounds which can inhibit or lessen the A&#946;-fibrinogen interaction has promising therapeutic value. In vitro methods by which fibrin clot formation can be easily and systematically assessed are potentially useful tools for developing therapeutic compounds. Presented here is an optimized protocol for in vitro generation of the fibrin clot, as well as analysis of the effect of A&#946; and A&#946;-fibrinogen interaction inhibitors. The clot turbidity assay is rapid, highly reproducible and can be used to test multiple conditions simultaneously, allowing for the screening of large numbers of A&#946;-fibrinogen inhibitors. Hit compounds from this screening can be further evaluated for their ability to ameliorate A&#946;-induced structural abnormalities of the fibrin clot architecture using SEM. The effectiveness of these optimized protocols is demonstrated here using TDI-2760, a recently identified A&#946;-fibrinogen interaction inhibitor.

Presented here are two methods that can be used individually or in combination to analyze the effect of beta-amyloid on fibrin clot structure. Included is a protocol for creating an in vitro fibrin clot, followed by clot turbidity and scanning electron microscopy methods.

Β アミロイド誘起分光と電子顕微鏡によるフィブリン血栓構造異常の解析

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

生化学

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global reorganization and realignment of the gel microstructure. This process proceeds in a complex manner that is dependent in part on the interplay between the location of the cells, the geometry of the gel, and the mechanical constraints on the gel. To better understand how these variables produce global fiber alignment patterns, we use time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy coupled with an environmentally controlled bioreactor to observe the compaction process between geometrically spaced explants (clusters of fibroblasts). The images are then analyzed with a custom image processing algorithm to obtain maps of the strain. The information obtained from this technique can be used to probe the mechanobiology of various cell-matrix interactions, which has important implications for understanding processes in wound healing, disease development, and tissue engineering applications.

Time-lapse microscopy and image processing techniques were used to observe and analyze fibroblast-mediated gel compaction and fibrin fiber realignment in an environmentally controlled bioreactor over a 48 hr&#160;period.

線維芽細胞媒介フィブリンゲル圧縮の観察と定量

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

生物工学

脳血栓細胞成分を研究するための線維素溶解酵素ベースの方法

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of cerebral blood clots is important for diagnosis, treatment, and prognosis. However, the current approaches to studying the cell components of the clots are mainly based on in situ staining, which is unsuitable for the comprehensive study of the cell components because cells are tightly wrapped in the clots. Previous studies have successfully isolated a fibrinolytic enzyme (sFE) from Sipunculus nudus, which can degrade the cross-linked fibrin directly, releasing the cell components. This study established a comprehensive method based on the sFE to study the cell components of cerebral thrombus. This protocol includes clot dissolving, cell releasing, cell staining, and routine blood examination. According to this method, the cell components could be studied quantitatively and qualitatively. The representative results of experiments using this method are shown.

著者スポットライト:脳血栓の包括的な細胞成分分析のための新しい方法 

This study describes a fast and effective method for the cell component analysis of cerebral blood clots through clot dissolving, cell staining, and routine blood examination.

脳血栓の細胞成分を包括的に解析する

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

直接脳血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

医学

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

免疫・感染学

A Method to Study the Correlation Between Local Collagen Structure and Mechanical Properties of Atherosclerotic Plaque Fibrous Tissue

The rupture of atherosclerotic plaques in coronary and carotid arteries is the primary cause of fatal cardiovascular events. However, the rupture mechanics of the heterogeneous, highly collagenous plaque tissue, and how this is related to the tissue's fibrous structure, are not known yet. Existing pipelines to study plaque mechanics are limited to obtaining only gross mechanical characteristics of the plaque tissue, based on the assumption of structural homogeneity of the tissue. However, fibrous plaque tissue is structurally heterogeneous, arguably mainly due to local variation in the collagen fiber architecture.
The mechano-imaging pipeline described here has been developed to study the heterogeneous structural and mechanical plaque properties. In this pipeline, the tissue's local collagen architecture is characterized using multiphoton microscopy (MPM) with second-harmonic generation (SHG), and the tissue's failure behavior is characterized under uniaxial tensile testing conditions using digital image correlation (DIC) analysis. This experimental pipeline enables correlation of the local predominant angle and dispersion of collagen fiber orientation, the rupture behavior, and the strain fingerprints of the fibrous plaque tissue. The obtained knowledge is key to better understand, predict, and prevent atherosclerotic plaque rupture events.

We have developed a mechano-imaging pipeline to study the heterogeneous structural and mechanical atherosclerotic plaque properties. This pipeline enables correlation of the local predominant angle and dispersion of collagen fiber orientation, the rupture behavior, and the strain fingerprints of the fibrous plaque tissue.

アテローム硬化性プラーク線維組織の局所コラーゲン構造と機械的性質との相関を研究する方法

The rupture of atherosclerotic plaques in coronary and carotid arteries is the primary cause of fatal cardiovascular events. However, the rupture ...

Chandler Loop と RT-FluFF の組み合わせによる Ex vivo 血栓溶解モニタリング

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test thrombolytic drug efficiency both in vitro and in vivo. There is increasing demand for more physiologically relevant in-vitro clot models for drug development due to the complexity and cost associated with animal models in addition to their often lack of translatability to human physiology. Flow, pressure, and shear rate are important characteristics of the circulatory system, with clots that are formed under flow displaying different morphology and digestion characteristics than statically formed clots. These factors are often unrepresented in conventional in-vitro clot digestion assays, which can have pharmacological implications that impact drug translational success rates.
The Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) assay was developed as a high-fidelity thrombolysis testing platform that uses fluorescently tagged clots formed under shear flow, which are then digested using circulating plasma in the presence or absence of fibrinolytic pharmaceutical agents. Modifying the flow rates of both clot formation and clot digestion steps allows the system to imitate arterial, pulmonary, and venous conditions across highly diverse experimental setups. Measurements can be taken continuously using an in-line fluorometer or by taking discrete time points, as well as a conventional end point clot mass measurement. The RT-FluFF assay is a flexible system that allows for the real-time tracking of clot digestion under flow conditions that more accurately represent in-vivo physiological conditions while retaining the control and reproducibility of an in-vitro testing system.

著者スポットライト:In vitroモデルにおけるFlow Dynamicsの統合による血栓溶解性試験の進歩

In-vitro thrombolysis assays have often struggled to replicate in-vivo conditions whether in the model thrombus being digested or in the environment in which thrombolysis is occurring. Herein, we explore how coupling the Chandler loop and Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) is used for high-fidelity, ex-vivo, clot lysis monitoring.

正常および疾患米国でフィブリンクロット構造を調べるための実験とイメージング技術

要約

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Β アミロイド誘起分光と電子顕微鏡によるフィブリン血栓構造異常の解析

線維芽細胞媒介フィブリンゲル圧縮の観察と定量

脳血栓の細胞成分を包括的に解析する

脳血栓の細胞成分を包括的に解析する

脳血栓の細胞成分を包括的に解析する

直接脳血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

アテローム硬化性プラーク線維組織の局所コラーゲン構造と機械的性質との相関を研究する方法

In-vitro血栓溶解モデルにおけるせん断流下におけるChandler Loop形成全血栓の線維素溶解の追跡

In-vitro血栓溶解モデルにおけるせん断流下におけるChandler Loop形成全血栓の線維素溶解の追跡