The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.

1。電極の構築（図1） <ol><li>商業用多チャンネルアンプシステム1,2,25の電極インターフェースボードに合う電極アダプタの製造。 <ol><li> 18ピンコネクタベースに接着小さなプレキシガラスのプレートを使用してください。 </li><li>プレキシガラス板にネジ止め3の別々のはんだ付けラグへの絶縁電線の3短い断片（ 図1 A1〜A3）とベースを接続します。 </li><li>ガラスキャピラリを簡単に移動することができ、ネジで所定の位置に保持することがここでプレキシプレートに溝（ 図1 B1）を挿入します。 </li><li> minutienピンを使用して5ミリメートル程度ガラスキャピラリーを拡張します。 </li><li>安定化とサポートを保証するminutienピンとガラスキャピラリーに沿って微細電極ワイヤを取り付けます。 </li></ol></li><li>マルチチャンネルマイクロワイヤー生産（Ryuichy岡田32,33から採用） <ol><li>スパン3マイクロワイヤ（ポリウレタンコーティングされた銅線、15それらは互いに隣り合って配置されているような方法（ 図1のB2）中のミクロン直径）。 </li><li> （電極先端）（ 図1、B3）、それらを一緒に接着する部分の配線に沿って低融点歯科用ワックスの薄膜（50°C）を広めるために12 Vのはんだ付けの針を使用してください。このセクションでは、電極アダプタとマイクロワイヤを接続するために後で使用されるように、気が動転数センチ（電極端）のまま。 </li></ol></li><li>マルチチャンネルマイクロワイヤーは、電極アダプタに接続する<ol><li>ホルダーからガラスキャピラリを取り外し、電極先端にminutienピンで固定して下さい。マイクロ電極（Figure1のB3）に平行な位置にそれを持って来る。 </li><li>低融点歯科用ワックスを使用してminutienピンに電極チップを接着し、（小さ ​​な矢印が1 B3図 ）minutienピンからと電極端で2〜3センチ突き出し、先端に微小電極をカット。 </li><li>キャピラリーSLスリップightly裏面電極アダプタに。 （ 図1〜B4）、それを修正するためにネジを使用してください。 </li><li>断熱材（ 図1、B4）の溶融を確実にするために周りに360℃の温度ではんだ付けガンを用いて、はんだ付けラグに3線の緩い端を半田付けします。はんだ付けした後、十分な電気的接触（〜300オーム）があることを確認してください。 </li><li>ヘッドステージの電極インタフェースボードに電極（マスター）の1をマウントし、別々のアダプタの他のマルチチャネル電極（スレーブ）を固定します。マスター電極（ 図1のC1）にスレーブのチャンネルに接続します。さらに、マスター電極ベースを参照するだけでなく、筋肉の電極（図1 C2）を半田付けします。 </li></ol></li></ol> 2。ビー準備（図2） これらの記載された実験では、無脊椎動物の動物であるミツバチ（ ミツバチ ）したがって、使用のための具体的な倫理的な許可を必要としない、使用されています。 <ol><li>他人34,35によって示されるように、朝のハイブの入り口にミツバチ飼料収穫機（Aにミツバチ ） をキャッチします。 </li><li>固定化（5から10分）まで砕いた氷の上でミツバチを冷却し、頭部が露出するようにします（ 図2のA）で、標準的なプレキシグラスホルダーや金属管に1を修正。頭の動きを最小限に抑えるために低融点歯科用ワックス（〜50°C）を使用し、複眼や首の基礎を中心にホルダーに丁寧に頭を固定します。 </li><li>鞭毛に触れることなく頭部カプセル（ 図2のB）にアンテナのSCAPIを固定するために、低融点ワックスを使用してください。アンテナの鞭毛が前方指摘される必要がある。ミツバチが自由に口吻を動かすことができることを確認してください。 </li><li>頭の上に邪魔されずに表示してアクセスを確保するために、頭部カプセルを剃る。 </li><li> saturatiまで、30％スクロース溶液で蜂フィード脳組織と動物のよい実行可能性（ 図2のC）の十分な湿潤を確保するために。 </li><li>垂直方向、水平方向複眼と触角拠点上だけでなく、単眼の下の境界線に沿って慎重に切開を行い、キューティクルの緩み個（ 図2 D）を外します。 </li><li>丁寧に下咽頭腺を取っておくと、クリアな視界と挿入（ 図2E、2F）を電極に前脳へのアクセスを確保するため気管を削除します。 </li></ol> 3。電極の挿入 図2に示す例の場合、一方の電極は、L-ALTは、m-ALT 2に照準他方を目指して配置されている。特定のランドマークを使用して、他の標的領域は、例えばALおよびMB出力領域1について、同様に可能である。 <ol><li> （関心のある領域にマイクロマニピュレータを使用して電極を配置する<stroNG&gt;図2Gおよび3A）。 M-頭の中の場所を内側MBの垂直葉からALとの間の電極を対象とする。内外側頭の中のPNの分岐点より上に挿入部位を確認してください。約180ミクロン（ 図2E）の深さに脳内に電極を突出している。電極垂直ローブと、ALの真ん中の側面との間に仮想線の中央に横方向の大脳（LH）は、以下のL-ALTのPN記録場所のため。約300μm（ 図2E）の深さに電極を挿入します</li><li>キューティクルの小さなカットを通じて同複眼に参照（銀線、約25μm径）を挿入します。横単眼下の筋肉の投影領域内に別の銀線を挿入します。注：必要に応じて、ハチの学習動作は、私が関与している筋肉のM17を、記録することにより、高い時間精度で監視することができます25で説明したようにハチ36の口吻拡張応答（PER）をn個。 </li><li>しっかりと脳と頭部カプセル内の電極を固定するため、乾燥から脳を防ぐことができます2成分のシリコン（ 図2H）で脳上記空間全体をカバーしています。注：録音は日 ​​まで時間持続することができ、ミツバチは、たとえば古典的条件付け手順（ 図2H）の間に記録され、異なる匂いの大きなパネルで刺激することができます。 </li></ol> 4。データ収集と前処理<ol><li>次の要件を満たす適切な収集ソフトウェアを使用します。分25 kHzでサンプリングレートを;アナログ1,25または電極チャンネル間のデジタル2クロス分化;バンドは、スパイクイベントを抽出するために、8000 Hzまで300Hzのからフィルタを通す。 </li><li> TEMPL例えば、単一のユニット活動を抽出するために使用可能なスパイクソーティングソフトウェアを使用Spike2ソフトウェア（ 図3）に含まれるマッチング技術を食べた。 </li><li>さらなる分析のために（ 図4）または主成分分析（PCA）のための集団ベクトルを算出する（ 図5）は、市販のソフトウェアを用いて臭気応答を平均し、単一のユニットを計算するために、抽出された単位のタイムスタンプを使用する。さらに、単一のユニットと人口応答待ち時間を分析するために、最近の出版物1,2,25を比較してください。 </li></ol> 5。相対電極位置の可視化（図4） <ol><li> 5％のいずれかの溶液に電極チップを浸しアレクサは、Alexaの記録前実験と0.5 M塩化カリウム溶液に溶解させた488ヒドラジド568または5％ヒドラジド。 </li><li>実験の後、慎重に電極と覆うシリコンを外し、蜂リンゲル液で脳をすすぎ、腺や気管を取り外し、tetramethylrhodamiの小さな結晶を挿入するNデキストランまたは順行のALTにラベルを付けるために、ALに1.0Mの酢酸カリウムで解決5％溶液を挿入します。暗闇の中で次の手順を実行します。 </li><li>色素が取り込まれ、別の30〜45分間蜂リンゲル液で3回脳を洗浄する前に、その軸索管（30〜45分）（ 図4A）に沿って投射ニューロンにより輸送することができます。 </li><li>固定化するまで氷上に蜂を冷却し、慎重に頭部カプセルから脳を削除します。 4％ホルムアルデヒドを含む0.1 M PBS溶液中ですすぐことによって脳を固定し、4℃で一晩それを維持</li><li> 0.1のPBS（10分ごと）に脳を2回洗浄する前に、少なくとも12時間待ってください。 </li><li> （昇順アルコールシリーズで脱水する前に、トリトンX-100 0.1 M PBSで希釈した0.2％、30％、50％、70％、90％、95％、3×100％エタノール、20分間、20分間、脳の3回洗う各ステップ）。 </li><li>顕微鏡スライドとSにサリチル酸メチルで脱水脳を埋め込むカバースライドでそれをEAL。 </li><li>共焦点レーザー走査顕微鏡を使用し、高調波複合プランアポクロマート対物レンズ（10×0.4 NA液浸）を使用して、すべての2-5ミクロンの光学セクションとしての脳をスキャンします。 tetramethylrhodaminデキストランおよび電極位置のために488nmの波長に対して568 nmの波長を用いて組織を励起。 </li><li>再構築ソフトウェアで3Dで画像スタックから染色された脳構造と電極の経路を再構築する（ 例えば 。AMIRAやフィジー）（ 図4）。 </li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

この記事では、カスタム設計されたマルチチャンネルマイクロワイヤ電極の製造および使用方法を示しています。記載された電極は、単一のユニットと（詳細は1,2,25を参照）、単一の試料内での待ち時間の測定値と異なるニューロンと異なるneuropilsの他の時間応答特性のために特に便利です人口活性の両方を記録するのに適している。さらに我々は永久に日まで時間持続ミツバチの振る舞い​​に、安定した長期的な録音を可能にするために、マイクロワイヤ電極を実装する方法が示されている。 細胞外のマルチユニット記録は、空間情報と組み合わせ、高い時間分解能を達成するための有利なツールとなりました。我々の場合において、これらの神経路は、平行又は2つの異なるneuropils 1のいずれかである。複数のニューロンが並列に単一ニューロンレベルで、高時間分解能で記録し、分析することができる。マルチユニット記録41 -イングスは、最初の昆虫39に、後に哺乳類38で適用された。実質的な進展は、細胞外多チャンネル記録技術42,43の開発·改良を達成した。これは、例えば、新たな電極44または新規のスパイク45を選別し、クラスタリングアルゴリズムの開発を含む。 48 -細胞外多単位記録技術の一般的な方法は、46に記載されている。この動画に示される自己内蔵の電極は、さらに、電極あたりのマイクロワイヤを追加することによって適合させることができる、マイクロワイヤは、先端の間の測定可能な一定の距離を得るためにねじられ得る。両方の手順は、しかし、柔軟性が低下し、電極の厚さの増加につながる。 一般的にスズメガ、イナゴやゴキブリ40,49のようなはるかに大きな昆虫細胞外記録用に使用されるシリコンプローブに比べて- </商標&gt; 51記載のマイクロワイヤ電極は、可撓性小さく、潜在的な脳の動きに容易に対応でき、従って、確実にはるかに広い行動レパートリーを示すミツバチやアリのような小さな社会性昆虫で使用することができる。記載されたマイクロワイヤは、ラウンド柔軟で小さく、目標は長く勉強している場合は明らかな利点で、周囲の組織への、したがって害が少ないながら、ほとんどのシリコンプローブは、その挿通チャンネルに沿って軸索と神経組織を切断する構造のような鋭いシャンクを持っている無傷で行動する動物での短期可塑性。マイクロワイヤ電極の別の利点は、その低コスト製造及び取り扱いが容易である。代わりに、慎重に高価なシリコーンプローブを洗浄の電極線を新たに、したがって、輻輳の欠如の問題を前に、脳への挿入および切断される。さらに、それはどちらか異なるneuropiles 1○内に挿入同じ製剤内の複数のマイクロワイヤ電極を使用することが可能であるRトラクト2我々はここに示したよう。このアプローチは、異なる神経処理レベルでの応答潜時との相互作用のような時間的な側面を分析し、比較することが特に有利である。 我々は細胞外記録された信号は、 それ自体が一つの細胞活性を反映していないという事実を認識しています。それは、常に電極チップの周りの電圧活性の化合物である。信号源を特定するために、一方の電極内で隣接する二つのマイクロワイヤーチャネルの差が常に計算されます。このように単一ユニット活動を抽出するために使用されるスパイク信号のソースは、常に1つまたは容易に識別可能なスパイク波形が得られる他の電極チャネルのいずれかに非常に近かった。遠くからの信号は、近隣neuropilsの筋活動や活動のように、比較可能な形や振幅を想起させると同時に、両方の電極に到達し、この手順によって破棄されます。 Spike2のテンプレートマッチング技術を用いて、私たちは同じではありません、単一のユニット活動を得るために非常に自信を持って、単一ニューロン活動に非​​常に近い。しかし、スパイクソーティングの問題は、細胞内記録技術を用いることによって回避することができる。 鋭い電極やパッチピペットのいずれかでの単一細胞記録は、単一のニューロンの生理学的特性についての徹底的な知識を許す。しかし、昆虫の神経細胞とその神経突起の小さなサイズ（ 例えば 。ミツバチのために、1μm未満のPN 52）のみ短期録音を管理可能である。さらに、内細胞の録音は侵襲的かもしれませんし、場合によっては時間的な制限のためのもう一つの理由である細胞に害を与える可能性があります。昆虫におけるin vivo細胞内記録はほとんど1時間を長持ちしない。シングルに識別ニューロン、腹側の不対maxilarニューロン＃1（VUMmx1）からの細胞内記録マーティンハンマー53の先駆的な仕事のために十分であった時間ウィンドウ。彼はLでし報酬経路に直接インクをその活性を。アーネMauelshagen 54が細胞内に特定されキノコ体の外因性ニューロンの活性を登録して、古典的条件の間に茎外因性ニューロン＃1（PE1）。彼らはケニヨン細胞の電気刺激後にLTPを見つけたとき、同じニューロンはメンツェルとマンツ55の焦点が合っていた。しかし、岡田ら56は、細胞外記録中のPE1の識別のために、細胞内で十分に特徴付けられたスパイクパターン（ダブル、トリプルスパイク）を使用することができます。両方の方法の全てを組み合わせた後、特定されたニューロンおよび細胞外の長期的な記録から細胞内記録は、将来の調査のための強力なツールになるかもしれません。 しかし、私は彼らの時間応答の関係を分析するために日までに何時間かけて異なる処理レベルで同時に複数のセル（単位）を記録するために鋭利な電極を使用して、および/あるいはプラスチックの変更ほとんど不可能だ。 62 -最初のカルシウムイメージングは、カルシウム感受性色素を用いたミツバチ57,58に近付くと匂い応答の空間パターンの分析は、59アクセス可能だった。しかしながら、多くの場合、カルシウム感受性色素は、再度ハチの寿命と分析された細胞の固有の特性を制限侵襲的な操作を介して脳組織に導入しなければならない。この問題は、遺伝的に導入されたカルシウムセンサー63,64を使用してショウジョウバエのような他のモデル生物で克服される。それらはおそらく匂い応答の時間的な特性に影響を与えるカルシウムバッファとして作用することができるように、しかし、一般的に、カルシウムセンサは、他の制限を導入することができる。カルシウムイメージングまたは計算の手法と組み合わせて同時細胞内記録は、画像の適切な時間分解能が65,66を処理することを証明することができます。しかし、画像処理自体の時間分解能は、早咲きのですR限られた。 2光子イメージングは、より高速なシーケンス68を取得することができるかもしれませんが、光収集システムは、通常は、5月20日Hzの67の時間分解能で、CCDイメージングを使用しています。しかし、増加のサンプリングレートは常に空間分解能の損失と一緒に行く。さらにミツバチで使用されるカルシウム感受性染料も取得時間69を減少させ、漂白を受ける。 昆虫における他の生理学的記録技術と比較して、当社の柔軟なマルチチャンネルマイクロワイヤ電極は、単一のユニットと蜂を振る舞うの人口神経活動への長時間アクセスを確保。 我々は、異なる記録部位間の時間的符号化態様の分析を容易に同じ動物において、異なる処理段階で、これらの2つの電極を使用する方法を実証した。ここで示す電極の建物の基本的な方法昆虫研究課題とモデルに依存して、簡単に拡張されているできるおよび/または適合させることができる。例えば、それはマルチチャネル電極を製造するために3つの単一ワイヤよりも多くを使用することが考えられる。また、記録部位の数は拡張され、二つ以上の管またはneuropilsの時間的局面を観察することが可能であることができる。私たちの願いは、この方法は多くの科学者を鼓舞し、小さな脳で洗練された神経細胞の処理の理解に積極的に貢献することである。

ミツバチだけでなく、他のほとんどの昆虫は重く嗅覚に依存しています。とりわけ彼らは向き、交尾、同種との通信、および採餌のための嗅覚を使用しています。そのほかには、嗅覚系を精緻フローラルの匂い刺激に関連した行動を学習するの豊かなレパートリーに貢献しています。 （5 -口コミ3を参照）これらの動作は容易に制御された実験条件下で研究することができる。彼らの&quot;ミニ頭脳」（cp. 6）神経細胞の比較的小さな数字でミツバチ神経活動の監視中に嗅覚コーディングや学習を研究するのに適したモデル生物になります。 昆虫だけでなく、哺乳動物の嗅覚系は、（レビューのために7,8を参照）を大幅に類似の組織を示している。ミツバチにアンテナ10,11に沿ってsensillaeに位置し約80,000受容ニューロン9は neurに環境匂い刺激を翻訳onal信号。嗅覚受容ニューロンからの軸索は、脊椎動物の嗅球に匹敵する糸球体の組織を持っている触角葉（Al）を、支配する。 ALは、約4,000局所介在ニューロン（LN） ​​によって相互に接続約164の糸球体を含む（総説については12を参照されたい）。特にミツバチでは、LNSは斑状の横方向の接続を提供し、異なる部分集団は、元素及びconfigural嗅覚符号13,14性質を有することがことが最近示された。 ALは、内側と外側触角葉管（m-及びL-ALTを生じさせる腹と背側半葉に細分さ​​れることが示された。以前はm-および内側 - と横触角葉のprotocerebral用L-APTと呼ばれる管内15から17）。ここでは昆虫の脳の統一命名法のための最近の努力によって導入された新しい道の専門用語は、18を使用します。両方のALTは（L-およびM-ALT）410（L-ALT）、または510（M-ALT）uniglomerular projeいずれかを組み合わせてctionニューロン（PN）、それぞれ15,16,19。両方の管のPNには、最近（レビューのために17,20参照 ）、平行2のコードの臭いに示されており、両方の管は、シナプスケニヨン細胞（KC）、キノコ体（MB）は、プリンシパルニューロンと発散接続を形成する。 23 -各MBは約172,000 KCの21が含まれています。 MBは、刺激の統合、学習、および記憶形成に関与することが知られている。のVerticaまたはα-ローブと水平またはベータローブ22,24：KCののAXOの樹状突起は、主に2つの出力領域を有し、花柄（キノコの茎）を形成する。 MBの出力は、約400外因性ニューロン（JA）24に収束する。嗅覚の情報処理を担当するが、ほとんど垂直のローブ22の腹側面を支配するENS。最近では、この領域に記録されたENには、臭気報酬の関連付け25をコードすることが示されている。 としての時間的29 -昆虫だけでなく、脊椎動物の嗅覚系内pectsは、潜在的なコーディングの原則26のような重要かつ重要な側面となっている。同時に、高時間分解能での異なるサイトから複数のニューロンを記録することができるために、我々は蜂の嗅覚系で異なる標的領域に導入され、カスタマイズされたマルチチャンネルワイヤ電極を用いた二重マルチユニット記録技術を確立しました。このアプローチは、単一のニューロンと、パラレル嗅覚経路、デュアル嗅覚経路2または別のその後のneuropils 1間の神経細胞の集団のレベルでミツバチの嗅覚系で時間的処理を分析し、比較することを可能にします。最近、電極の異なる構成を使用して、ローカスト嗅覚系30で同様の実験的なアプローチを背景不変の臭気認識31のための時空間コード化メカニズムを解析することができました。目当方、確立されたデュアル録音が同時に神経活動プロファイルに関する空間情報を収集できます。 カルシウムイメージングから得た広い空間サンプリングに比べてこの方法は、2スポットから録音することができます。しかしながら、カルシウムイメージング技術と比較して利点は、従来のCCD撮像又は2光子イメージング取得のいずれかによって提供することができない活動電位の記録の高い時間精度である。ここで説明する細胞外電極は、恒久的に移植された電極のドリフトを回避し、脳や頭部カプセルと比較して固定されている。これはシャープな細胞内の電極の使用量に比べて明らかな利点である。細胞内記録とカルシウムイメージングと比較したもう一つの利点は、何時間から日までの範囲の拡張、神経観測時間である。これは、学習と記憶形成の神経相関を調査するための重要な前提条件である。マルチのその他の利点単位記録はさらなる議論の項に概説されています。 この方法論の概要では、カスタム設計ワイヤ電極の製造手順は、32,33とミツバチの脳内の長期的なマルチユニットレコーディングに適してから適応、表示されます。さらに、これらのタイプの電極が永久的に多くの刺激プロトコルを可能にするために長期間にわたって同時にL-及びm-ALTを記録するためにミツバチ嗅覚系内の2つの異なる記録部位に注入する方法の一例が示されている2。記録位置の確認のために記録部位の染色後の記録可視化のための例とプロトコルを提供する。

<table><tbody><tr><td>Paraffin oil</td><td>Fluka</td><td>76235</td><td></td></tr><tr><td>Odors</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>4% Formaldehyde</td><td>ThermoScientific</td><td>28908</td><td>Methanol free</td></tr><tr><td>Triton X</td><td>BioChemica</td><td>A1388</td><td></td></tr><tr><td>Methylsalicylate</td><td>Roth</td><td>4529.1</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby)</td><td>Invitrogen</td><td>D7162</td><td>keep dark</td></tr><tr><td>Alexa 488 hydrazide</td><td>Invitrogen</td><td>A-10436</td><td>keep dark</td></tr><tr><td>Alexa 568 hydrazide</td><td>Invitrogen</td><td>A-10437</td><td>keep dark</td></tr><tr><td>Bee Ringer Solution</td><td>see Brill &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyurethane-coated copper wire</td><td>Elektrisola</td><td>15 &amp;micro;m diameter &amp;amp; P155 insulation</td><td></td></tr><tr><td>Dental Wax&amp;nbsp;</td><td>Densply Detrey</td><td>64103015S1</td><td>moderate melting point</td></tr><tr><td>Dental Wax</td><td>Flexaponal&amp;nbsp;</td><td>124-202-00</td><td>low melting Wax</td></tr><tr><td>KWIK SIl</td><td>WPI</td><td>03L</td><td></td></tr><tr><td>18 Pin Socket</td><td>Conrad Electronic</td><td>189634-62</td><td></td></tr><tr><td>Hot melting glue</td><td>Conrad Electronic</td><td>827673</td><td></td></tr><tr><td>Soldering needle</td><td>Conrad Electronics</td><td>830283</td><td>12 V</td></tr><tr><td>Soldering terminal lug&amp;nbsp;</td><td>Conrad Electronic</td><td>531901</td><td></td></tr><tr><td>Glaselectrodes</td><td>WPI</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>V2A 0.2 x 12 mm</td></tr><tr><td>Switchable headstage</td><td>Tucer Davis Technologies</td><td>SH16</td><td></td></tr><tr><td>Headstage connection module</td><td>NPI</td><td>INT-03M</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier Module</td><td>NPI</td><td>PDA-2F</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition boards</td><td>National Instruments</td><td>NI-6123, Ni-6143</td><td></td></tr><tr><td>Acquisition Software</td><td>National Instruments</td><td>Lab View 8.2</td><td>custom design</td></tr><tr><td>Spike-Sorting&amp;nbsp;</td><td>CED&amp;nbsp;</td><td>Spike 2 v7.11</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>R2008B</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Leitz</td><td></td><td>manual</td></tr><tr><td>AG-wires</td><td>WPI</td><td>AGT05100</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SP2 AOBS</td><td></td></tr><tr><td>AMIRA</td><td>Mercury Computer Systems&amp;nbsp;</td><td>2/5/2000</td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous long-term recordings at two neuronal processing stages in behaving honeybees

哺乳類や昆虫の両方における神経情報が異なる上位と下位の脳センターで処理されます。これらのセンターは、収束し、フィードフォワードおよびフィードバック配線を含む発散解剖学的な接続を介して接続されている。さらに、同じ起源の情報が部分的に異なる、時には同じ脳の領域へと並列経路を介して送信されます。これらの配線戦略、特にお互いに自分の時間的依存関係の進化の恩恵だけでなく、計算上の利点を理解するためには、高い時間分解能で同じ準備で別の管またはneuropilesの単一ニューロンへの同時アクセスを持っていることが必要である。ここでは、2以降のneuropiles 1、触角葉（AL）は、まず嗅覚処理段階とキノコ体（MB）、高次の統合センターINVOでマルチユニット活動を記録するためにユニークな細胞外の長期的なアクセスを実証することによってミツバチに集中学習および記憶形成、又はMBとALを接続する2つの平行な神経管2にLVED。後者の例として選択した、完全に説明される。支持ビデオフレキシブルマルチチャンネルワイヤ電極の構成と永久挿入が実証される。マイクロワイヤ電極チャネルの対の差動増幅を大幅にノイズを低減し、信号源は、電極先端の位置と密接に関連していることを検証する。使用するワイヤ電極の機械的柔軟性は、従来の余分およびin vivo記録技術における細胞内に比べて明らかな利点である、日まで多くの時間にわたって安定した侵略的な長期的な録音を可能にする。

「この議定書は、個々のミツバチ内の2つの異なる処理段階での同時録画を可能にし、さらに例えば経由で学習と記憶の基本的なメカニズムをテストすることができます。、拘束されたミツバチの中エアコンPER。 &quot;これは、神経処理の時間的な側面を分析するための前提条件である。この方法は、蜂の嗅覚系の神経回路網を解明するために、異なる科学的アプローチのために容易に適応可能である。例えば、この方法は、ミツバチのデュアル嗅覚経路、L-及びm-ALTのPN（ 図5）内のPNの一時的な処理を分析するために（i）が使用される。 図5Aに同時にM-ALTのPNで記録されたL-ALT PNの1例は10トライアル平均として与えられ、カラーコード化された熱プロットとして5異なる臭気濃度の点での応答の強さと待ち時間を示している。 11リットルと13ミリアンペアと7ミツバチの平均LTのPN（ 図5B、5C）は 、応答の強度並びに反応潜時の両方が、ある程度まで、付臭剤濃度を反映していることを示している。増加の付臭剤濃度との反応潜時は（ 図5B、5C）が減少しつつ、この例でのPNは、その応答の強さを増加させる。この結果は、かなり限られ、分析匂い物質に対してのみ有効ですが、それでも、AL 37の最近の計算モデルと一致している。ハチのALにおける臭気濃度符号化は非線形計算の基礎となる符号化または他の特性は依然として将来的に分析する必要が根底にあるかどうか。さらに、この方法は、（ii）の二つの連続処理段階、およびAL-MB-出力（ 図6）で集団活動に時間的な側面を比較するために使用することができる。主成分分析（PCA）は、臭気計算が長くなることを示しており、一方、ENにおけるPNレベルでの全体の臭気プレゼンテーションを長持ちセットのオンとオフだけ臭気は人口活性（ 図6）で表されていましたね。 PNの活動はまだ（cp. 動画1）を開発したとき、それによって、EN人口はの時点ですでに最大活性に達した。 <img alt="図1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig1highres.jpg" width="400" /> 。。。図1 3チャンネルのマイクロワイヤ電極の製造A1）は、3つのワイヤの末端が位置11、13及び16におけるICピンコネクタに半田付けされているA2）フォーはんだラグは、プレキシガラス、プラスチック基板にねじ止めされ; minutienピンは、その後、プラスチック板に取り付けられたガラスキャピラリの先端に挿入される。A3）は、プラスチック板をICピンコネクタの上面に接着され、各ワイヤの自由端が上部はんだ付けの一方にはんだ付けされているラグ。 &lt;細い銅線を電極ホルダを装備する強い&gt; B1）は、毛細血管をもう一度取り出すことがあります。B2）ホルダーのベースは、カスタムで修正されているデバイスを揃えるた。三つ銅マイクロワイヤは、B3）平行マイクロワイヤは、歯科用ワックスと一緒に接着されており、キャピラリ場所（長い矢印）に戻され、各端部で溝に沿って整列し、粘着テープで固定されている; （短い矢印）が接着されたマイクロワイヤは、次いで、歯科用ワックスと毛細管に取り付けられ、その端部が切断される。B4）銅線の三緩い端部はと電気的に接触させること、従って3つのトップはんだラグに半田付けされているICピンコネクタC1）二つの完全に組み立てられた電極は、単一のヘッドステージで使用するために相互に接続することができる。C2）は、この目的のために、一方の電極（左、スレーブ）のピンは、右（他方の電極に絶縁電線を介して接続されているマスト）小胞体、ヘッドステージに接続されており;ヘッドステージ接続される電極はまた、筋肉（M17）および基準電極（参照）からの入力を収集することができる。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。準備とハチの脳内への永久電極挿入。A）蜂氷上で固定化後プレキシグラスホルダーに挿入されている。鞭毛（FL）とScapus（SC）とのアンテナ示されています。B）の頭や触角が歯科用ワックスを使用して固定されている。C）頭部カプセルを剃毛し、ハチは砂糖水が供給される。D）頭部カプセルを開いた。 E）は、脳の上部から腺および気管を除去した後、異なるneuropilesおよび主要なランドマークを容易に区別することができる。のALTの軌道は一緒に示されている電極が挿入されているマーク。 （MB：キノコ体、他：触角葉、OL：光葉、α：アルファローブまたは垂直葉、ALT：触角葉管、E1：M-頭の中の録音のための電極挿入側、E2：L-ALTのための電極挿入側録音）。F）リファレンス（REF）と筋肉の電極（M17）がキューティクルや複眼に少し穴に頭部カプセルに挿入されます。G）のワイヤ電極を適切な場所で脳内に挿入されます。H）した後、二成分シリコンを用いた所定の位置に電極を固定し、ミツバチが依然としてPERを示している（ 例えば 、砂糖水を使用して）調整することができる。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" width="500" /> 2神経管と単一のユニット抽出（スパイクソーティング）。Aの図3。細胞外記録 </str実験装置のオング&gt;）模式図。ハチは、プレキシグラスホルダーに固定されている。匂い刺激は、ガラス管を介して提供される。二つの電極シャンクが露出蜂の脳から記録している。B）の濃度で水溶液中の蜂蜜の500ミリ匂い刺激に両方の管に興奮応答を示すL-およびm-ALTのPN（緑と紫のトレース）からの同時録音33℃での1:100スパイクは、単一活動電位がソートされ、色分けされている手順をソートした後）50μVC：それぞれがAのバー内の電極のはんだ付けラグから色分けされたラベルと区別チャンネルを表す線をプロットした。ソートされたユニットのオーバーレイは波形の分離を示しています。D）のスパイク間隔ヒストグラムは、適切なスパイクソーティングの証としてソートユニットの分離品質を示しています。ユニットの耐火期間内にスパイクが存在しないことに注意してください。E）に 2つのビュー（E1、E2）から互いにソート単位の距離を示している主成分分析とソート部の3次元クラスタリング。円はカラーコード化されたユニットが1管内記録から3チャンネルの倍率で見える活動電位を示している）空間で、SDに似ており、主成分空間Fのクラスタの重要な差別化を示し、2.5倍マハラノビス距離を示す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" target="_blank">こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" width="500" /> 図4。記録後の可視化と記録位置の3次元再構成。前外側の最大強度の位置合わせで、Z軸に沿ってオルソスライスのA）の投影図とMBおよびLHに対するAlから突出uniglomerular投射ニューロンの逆行埋め戻し。細胞内のトレーサーMicroruby（tetramethylrhodaminデキストラン）を記録実験の後、ALに挿入した。アレクサとの2つの電極の染色から最大強度の位置合わせで、Z軸に沿ったオルトスライスのAL証明適切PN染色。B）は投影図の内部ステンド糸球体は、M-ALT（E1、矢印の電極配置を示す488ヒドラジド）およびl-ALT（E2、矢印）。トレーサーアレクサヒドラジド488は、周囲の組織電極に移動し、電極挿入部位を染色する。注、アラバマ州の著名な染色は表面的な加工品である。C）染色された標的細胞の3次元再構成（PNS）と、A、B（右側から電極挿入部位）を一緒にミツバチの嗅覚システムの概略図と（左L-およびm-ALT軌跡の表示のある側）。唯一uniglomer、注意してくださいウラルのPN管が示されている。 ：触角神経、他：触角葉、LH：横ホーン、MB：キノコ体、E1、E2：電極挿入部位、M-ALT：内側触角葉管、L-ALT：横触角葉管、C：尾、 R：吻側、M：中間、L：横<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig5highres.jpg" width="300" /> 図5。デュアル嗅覚経路内の臭気濃度符号化の例。A）熱プロットは、単一のL-ALT（緑）の応答を示しており、単一のM-ALT PN（紫）は匂い物質に反応して、個々のミツバチから同時に取得臭気濃度の増加にヘキサナール（1から1:100まで10 -6）。各行は10トライアルSTIMの平均であるulation。発火率は差し引か自発的活動に関連して発火率である相対強度の変化として示されている。B）7を記録ミツバチから11リットルと13メートル、頭の中のPNの人口反応潜時。各ハチの両方で管からのPNを同時に記録した。集団応答待ち時間は、両方の管からPNの内の臭気濃度の増加と共に減少する待ち時間を示す。 99ミリ秒でのアンテナの匂い応答開始はelectroantennogramsを経由して記録し、PN応答待ち時間から差し引かれる。最低濃度応答での待ち時間の測定のために余りに弱く、そのため、除外された。Cに注意してください）人口は、応答の強さが増加している臭気濃度が増加すると、Bの場合と同様のPNから発火率の応答。 L-ALTは強い応答の強さを示しています。 Bにおいては、Cの平均およびSDを示す。 <img alt="図6" fo:contenT-幅= &quot;5インチ&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51750/51750fig6highres.jpg&quot;幅= &quot;500&quot; /&gt; 図6ミツバチの嗅覚経路に沿って二次の処理段階における人口活性を比較するデータは、1 -ヘキサノール、2 -オクタノンで刺激した20匹の動物で記録した。A）各行が一つの突起の偽色コード化された平均発火率を表す。 1 - ヘキサノール10臭い反復にわたって計算されたニューロン（PN）。臭気のプレゼンテーションは、時間0から始まり、3秒間続いた。、B、A）と同様に同じ番組）が、キノコ体外因性ニューロン（JA）のために。 Aに示すマトリクス）を、1 - ヘキサノールによる匂い刺激中のPN集団ベクトルと見なすことができる。我々は、2 -オクタノンで匂い刺激中に集団ベクトルの同じ種類を計算し、時間次元を維持する主成分分析（PCA）における両方のベクターを使用した。C）最初の3つの主成分（PC1、2および3）であった触角葉出力に、PNアンサンブル活動の臭気の分離を説明するために、互いに対してプロット。匂いの発症までの時間は黒でマークされています。 1 - ヘキサノールを用いた刺激の3秒の間に活性が青色で表示されている。 2 - オクタノールによる刺激時の活動は、赤で表示されている。さらに、我々は1 - ヘキサノールのセット（水色）と2 - octanonen（ピンク）の匂いの後に活動の1.5秒（ポスト）を示す。 PNアンサンブルのレベルで、非常に明確な軌道を想起させる、両方の匂いが「定点」長持ち全体匂い刺激期間に定住ことに注意してください。臭気がオフセットした後にのみ軌道が匂い刺激せずに、バックベースラインの活動に移行します。D）と同じ分析はキノコ体の出力でのアクティビティを表すENアンサンブルのレベルで行われていた。 PN活性と比較臭気が少なく明確な軌道を呼び起こす。さらに「固定点」観測できない。最初は匂い誘起軌道INTE臭気はまだ存在するが、ベースライン活性にrmingle。オフセットだけ臭いは、追加の軌跡を誘発。 <a href="/files/ftp_upload/51750/Movie_R3_Brill_et_al._JoVE.avi" target="_blank">映画の1。</a>時間PN-人口ベクトル（左）とEN人口ベクトルの主成分分析後に軌道を誘発され、臭気の評価、解決、アッパー部分は最初の3つの主要コンポーネント（PC1が含まれる（右図6 CPを。）。図2及び図3）は、互いに対してプロットした。下のパネルは、経時的にPC1、2,3の評価を示す。匂い刺激は灰色のバーでマークされている。すべてのパネルが同期された。 contraintuitiveのようですが、それ以前の1で議論されて含まれる層の接続性と特性によって説明できる現象は、ENの人口の活動は、PNの人口アクティビティの前にわずかに始まることに注意してください。

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Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

2異なる脳neuropilesまたは2つの異なる解剖学的管から同時に細胞外の長期的な記録は、ミツバチに設立された。これらの録音は、単一のニューロンでだけでなく、行動する動物でのアンサンブルのレベルで異なる脳領域間での神経処理の時間的な側面の調査を可能にする。

行動するミツバチの二つの神経の処理段階での同時長期レコーディング

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

simultaneous-long-term-recordings-at-two-neuronal-processing-stages

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.9K ビュー.  University of Würzburg.  2異なる脳neuropilesまたは2つの異なる解剖学的管から同時に細胞外の長期的な記録は、ミツバチに設立された。これらの録音は、単一のニューロンでだけでなく、行動する動物でのアンサンブルのレベルで異なる脳領域間での神経処理の時間的な側面の調査を可能にする。 

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Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

ミツバチのテングザルの拡張レスポンスの古典的条件における行動薬理学（セイヨウミツバチ）

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

神経科学

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

All organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is especially important in insects, which use their olfactory systems to respond to, and discriminate amongst, complex odor stimuli. These odors elicit behaviors that mediate processes such as reproduction and habitat selection1-3. Additionally, chemical sensing by insects mediates behaviors that are highly significant for agriculture and human health, including pollination4-6, herbivory of food crops7, and transmission of disease8,9. Identification of olfactory signals and their role in insect behavior is thus important for understanding both ecological processes and human food resources and well-being.
	To date, the identification of volatiles that drive insect behavior has been difficult and often tedious. Current techniques include gas chromatography-coupled electroantennogram recording (GC-EAG), and gas chromatography-coupled single sensillum recordings (GC-SSR)10-12. These techniques proved to be vital in the identification of bioactive compounds. We have developed a method that uses gas chromatography coupled to multi-channel electrophysiological recordings (termed 'GCMR') from neurons in the antennal lobe (AL; the insect's primary olfactory center)13,14. This state-of-the-art technique allows us to probe how odor information is represented in the insect brain. Moreover, because neural responses to odors at this level of olfactory processing are highly sensitive owing to the degree of convergence of the antenna's receptor neurons into AL neurons, AL recordings will allow the detection of active constituents of natural odors efficiently and with high sensitivity. Here we describe GCMR and give an example of its use.
	Several general steps are involved in the detection of bioactive volatiles and insect response. Volatiles first need to be collected from sources of interest (in this example we use flowers from the genus Mimulus (Phyrmaceae)) and characterized as needed using standard GC-MS techniques14-16. Insects are prepared for study using minimal dissection, after which a recording electrode is inserted into the antennal lobe and multi-channel neural recording begins. Post-processing of the neural data then reveals which particular odorants cause significant neural responses by the insect nervous system.
	Although the example we present here is specific to pollination studies, GCMR can be expanded to a wide range of study organisms and volatile sources. For instance, this method can be used in the identification of odorants attracting or repelling vector insects and crop pests. Moreover, GCMR can also be used to identify attractants for beneficial insects, such as pollinators. The technique may be expanded to non-insect subjects as well.

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Olfactory cues mediate many different behaviors in insects, and are often complex mixtures comprised of tens to hundreds of volatile compounds. Using gas chromatography with multi-channel recording in the insect antennal lobe, we describe a method for the identification of bioactive compounds.

昆虫の触角葉でガスクロマトグラフィー - マルチユニットレコーディング（GCMR）を使用して、嗅覚揮発性物質の同定

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（<em&gt; Schistocercaアメリカーナ</em&gt;）嗅覚回路

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

ハニービーの嗅覚学習中のキノコ体の神経細胞のイメージング- 生体内のCa 2 + の

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

生物学

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

蜂蜜の蜂で触角サンプリング戦略の触覚エアコンと運動解析（<em&gt;ミツバチ</em&gt; L.）

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). There are several behavioral mechanisms through which an insect learns salient associations and relates them to these events. It is important to understand this behavioral plasticity for programs aimed toward assisting insects that are beneficial for agriculture. This understanding can also be used for discovering solutions to biomedical and agricultural problems created by insects that act as disease vectors and pests. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol was developed for honey bees (Apis mellifera) over 50 years ago to study how they perceive and learn about floral odors, which signal the nectar and pollen resources a colony needs for survival. The PER procedure provides a robust and easy-to-employ framework for studying several different ecologically relevant mechanisms of behavioral plasticity. It is easily adaptable for use with several other insect species and other behavioral reflexes. These protocols can be readily employed in conjunction with various means for monitoring neural activity in the CNS via electrophysiology or bioimaging, or for manipulating targeted neuromodulatory pathways. It is a robust assay for rapidly detecting sub-lethal effects on behavior caused by environmental stressors, toxins or pesticides.
We show how the PER protocol is straightforward to implement using two procedures. One is suitable as a laboratory exercise for students or for quick assays of the effect of an experimental treatment. The other provides more thorough control of variables, which is important for studies of behavioral conditioning. We show how several measures for the behavioral response ranging from binary yes/no to more continuous variable like latency and duration of proboscis extension can be used to test hypotheses. And, we discuss some pitfalls that researchers commonly encounter when they use the procedure for the first time.

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

昆虫に行動可塑性を調査するためのテングザルの拡張レスポンスプロトコル：基本、生物医学および農業研究への応用

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

Simultaneous Monitoring of Wireless Electrophysiology and Memory Behavioral Test as a Tool to Study Hippocampal Neurogenesis

Brainwaves amplitude obtained from electroencephalography (EEG) has been well-recognized as a basis for cognitive capacity, memory, and learning on animals and humans. Adult neurogenesis mechanism is also linked to memory and learning improvement. Traditionally, researchers used to assess learning and memory parameters in rodent models by behavioral tasks. Therefore, the simultaneous monitoring of behavioral changes and EEG is particularly interesting in correlating data between brain activity and task-related behaviors. However, most of the equipment required to perform both studies are either complex, expensive, or uses a wired setup network that hinders the natural animals&#8217; movement. In this study, EEG was recorded with a wireless electrophysiology device along with the execution of a novel object recognition task (NORT). The animal&#8217;s behavior was monitored simultaneously by a video tracking system. Both recordings were analyzed offline by their timestamps which were synched to link EEG signals with the animal&#8217;s actions. Subjects consist of adult Wistar rats after medium-term environmental enrichment treatment. Six skull screw electrodes were fixed in pairs on both hemispheres over frontal, central, and parietal regions and were referenced to an electrode located posterior of the nasal bone. NORT protocol consists of exposing the animal to two identical objects for 10 min. After 2 h and 24 h, one of the objects was replaced with a novel one. Exploration time for each object was monitored by a behavioral tracking software (BTS) and EEG data recording. The analysis of the EEG synced with behavioral data consists of estimations of alpha and beta relative band power and comparisons between novel object recognition versus familiar object exploration, between three experimental stages. In this manuscript, we have discussed electrodes manufacturing process, epidural electrodes implantation surgery, environmental enrichment protocol, NORT protocol, BTS setup, EEG &#8211; BTS coupling for simultaneous monitoring in real-time, and EEG data analysis based on automatic events detection.

The protocol presented here provides information on the simultaneous electroencephalography (EEG) and behavioral assessment in real-time. We have discussed all steps involved in this protocol as an attractive solution for researchers in many fields of neuroscience, particularly in learning and memory areas.

海馬神経新生研究ツールとしての無線電気生理学と記憶行動検査の同時モニタリング

Brainwaves amplitude obtained from electroencephalography (EEG) has been well-recognized as a basis for cognitive capacity, memory, and learning on ...

行動学

Recording Single Neurons' Action Potentials from Freely Moving Pigeons Across Three Stages of Learning

While the subject of learning has attracted immense interest from both behavioral and neural scientists, only relatively few investigators have observed single-neuron activity while animals are acquiring an operantly conditioned response, or when that response is extinguished. But even in these cases, observation periods usually encompass only a single stage of learning, i.e. acquisition or extinction, but not both (exceptions include protocols employing reversal learning; see Bingman&#160;et al.1 for an example). However, acquisition and extinction entail different learning mechanisms and are therefore expected to be accompanied by different types and/or loci of neural plasticity.
Accordingly, we developed a behavioral paradigm which institutes three stages of learning in a single behavioral session and which is well suited for the simultaneous recording of single neurons&#39; action potentials. Animals are trained on a single-interval forced choice task which requires mapping each of two possible choice responses to the presentation of different novel visual stimuli (acquisition). After having reached a predefined performance criterion, one of the two choice responses is no longer reinforced (extinction). Following a certain decrement in performance level, correct responses are reinforced again (reacquisition). By using a new set of stimuli in every session, animals can undergo the acquisition-extinction-reacquisition process repeatedly. Because all three stages of learning occur in a single behavioral session, the paradigm is ideal for the simultaneous observation of the spiking output of multiple single neurons. We use pigeons as model systems, but the task can easily be adapted to any other species capable of conditioned discrimination learning.

Learning new stimulus-response associations engages a wide range of neural processes which are ultimately reflected in changing spike output of individual neurons. Here we describe a behavioral protocol allowing for the continuous registration of single-neuron activity while animals acquire, extinguish, and reacquire a conditioned response within a single experimental session.

自由に学習の三つの段階を越えハトを移動する単一ニューロン」の活動電位を記録する

While the subject of learning has attracted immense interest from both behavioral and neural scientists, only relatively few investigators have observed ...

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

拘束と自由飛行ミツバチの神経薬理学的操作、<em&gt;アピスミツバチ</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

行動するミツバチの二つの神経の処理段階での同時長期レコーディング

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ミツバチのテングザルの拡張レスポンスの古典的条件における行動薬理学（セイヨウミツバチ）

同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ

昆虫の触角葉でガスクロマトグラフィー - マルチユニットレコーディング（GCMR）を使用して、嗅覚揮発性物質の同定

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ハニービーの嗅覚学習中のキノコ体の神経細胞のイメージング- 生体内のCa ^{2 +} の

蜂蜜の蜂で触角サンプリング戦略の触覚エアコンと運動解析（

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海馬神経新生研究ツールとしての無線電気生理学と記憶行動検査の同時モニタリング

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