この作品はVENOMICSプロジェクト、第七フレームワーク·プログラム（FP7 HEALTH 2011年から2015年）を通じて278346°欧州プロジェクト無償Nでサポートされていました。 VENOMICSプロジェクトは、ヨーロッパのいくつかの研究機関や企業間のコラボレーションです。 AFMB、エクス·マルセイユ大学（フランス）、CEAサクレ（フランス）、NZYTech（ポルトガル）、SistemasGenomicos（スペイン）、大学·ド·リエージュ（ベルギー）、VenomeTech（フランス）、Vitamib（フランス）、ニュージーランドファーマ（デンマーク） この作品は、統合された構造生物学（FRISBI）ANR-10-INSB-05から01のためのフランスのインフラストラクチャによってサポートされていました。 著者はまた、ビデオの撮影のための準備を支援するために氏ジェレミーTurchettoに感謝したいと思います。

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The authors declare that they have no competing financial interests.

水溶性、折りたたまれた、機能的なタンパク質の発現のための単一のユニバーサルプロトコルがありません。 、コストと時間の効率的であると、複数のターゲットを扱うほとんどの研究室やタンパク質コア施設は、したがって、目標の大半を、可溶性の活性タンパク質を得るために、変数の最高の「一般的な」組み合わせを見つけるためのスクリーニングのハイスループットタンパク質発現を使用しています。私たちは、ジスルフィド豊富なペプチドおよびタンパク質11の可溶性発現のために一般的に適用可能な融合パートナーであるとのDsbCを同定した。 DsbCの融合およびハイスループット方法を用いて、一週間以内に複数の標的の可溶性発現が11で観察することができ、次いで、導入部で論じたものなどの追加の変数は、さらなる最適化を必要とするターゲットでその後のラウンドでスクリーニングすることができる。本明細書に記載されたプロトコルは、ジスルフィドに富むタンパク質およびペプチドの発現を目的としている。しかし、expに希望するユーザーのためのハイスループット様式でRESS非網目状タンパク質は、対応するプロトコルは、以前に公表されており、他の場所22,24見出すことができる。 高スループットのセットアップは（同時に可溶性発現または複数の標的遺伝子のための（様々な融合タグを含む）の発現構築物の多数のスクリーニングのための異なった多数のタンパク質のスクリーニングなど、多数のアプリケーションに最適ですまたは複数の発現が成功率を向上させるために）単一のターゲットの構築物。プラットフォームはまた、多数のターゲットに新しいプロトコルのベンチマークと検証のために使用することができる。他のアプリケーションは、単一の難しいターゲットの変異体のスクリーニング、 例えば 、全ての相同分子種または同じファミリーのメンバー、または1の実験では、単一の標的の変異体のパネルの生産の成功をテストするためにあります。また、このプロトコルは、共発現ベクター（ウィットと組み合わせて使用​​されているH 1は、プルダウン正しい複合体形成および化学量論33を確認するために、より徹底した生物物理学的分析を行ったタンパク質-タンパク質複合体の予備的な特性評価を可能にするために）タンパク質のみをタグ付けされた。精製されたタンパク質の量は、マイクロアッセイ（官能試験、タンパク質-DNA 34またはタンパク質-タンパク質相互作用アッセイ）のために時々に適している。ハイスループット発現スクリーニング戦略にはいくつかの利点がある：（i）多数のターゲットをテストする能力、または単一の実験で多数の変数と、（ii）限られたバッチ間のばらつき、（三）は深い井戸を使用してより小さな規模で働くのシンプルさと使いやすさ、（iv）の拡張性と再現性、より大きなスケールでは、自動化のための（V）の可能性、および（vi）の追跡のシンプルさとハンドリング（個々のチューブの無いラベル、少なく）を混合中の個々のチューブの取り扱いをよりプレートフォーマットを使用するか、クローンの交換時に導入されたミス。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;プロトコルのセクションで説明されていないが、以下に簡単に説明される実験の準備のため、いくつかの重要な考慮事項があります。より完全な議論についてはこれまでの出版物24を参照してください。最大効率のためには、ターゲットの多数のサブクローン作成を簡素化するために、ハイスループットクローニングに適したシステムを持っていることが有益である。 VENOMICSプロジェクトの初期段階のために、我々は週にクローンの数百のペースで任意のデスティネーションベクターにサブクローニングを可能にする汎用性の高いGateway組換えシステム25を利用する。 Gateway組換えクローニングのためのプロトコルは、Invitrogen社のウェブサイトでご覧になれます。ハイスループットクローニングのため他の選択肢は、37のクローンを作成ライゲーションに依存しないクローニング（LIC）35,36および制限フリー（RF）が含まれています。エントリークローンのコレクションから、鋳型DNAからPCRにより含め、表現のための標的遺伝子を得るために複数の方法があります。またはVENOMICSプロジェクト用に選択された戦略である合成遺伝子、。合成遺伝子は、遺伝子の両端に組換え部位に注文することができ、遺伝子合成は、（まれな大腸菌コドンを排除するために）標的遺伝子配列を容易にコドン最適化を可能にする。これはお勧めしますが、必須ではない。希少コドンの数が多い、ロゼッタ2（高度大腸菌内で発現されていない希少コドン用tRNAを運ぶ）（DE3）pLysSをが含まれているコドン最適化することなくターゲットの場合、BL21（DE3）pLysSをより良く適している。細胞質の通常還元環境でのジスルフィド結合の還元を制限可能な菌株があ ​​りますが、私たちの手で、彼らは、通常の大腸菌と同じくらい成功していない大腸菌は 11株。 分析スケールアフィニティー精製は、可溶性融合タンパク質を回収し、収率を定量化するために、試験発現培養物から行われる。定量的データは日に取得することができる培養物を100mg / L - 0.1の範囲内で発現された融合タンパク質の可溶性電子収量。ターゲットが可溶性でない場合、別の融合パートナーが追求される前に、別の発現および誘導温度、株または媒体を試験することができる。ジスルフィドが豊富なタンパク質の可溶性発現のために、我々は以前に細胞質発現のための11のDsbC&gt;のDsbA&gt; GST&gt; MBP&gt; TRX&gt; HIS-タグとして融合パートナーの効果をランク付けした。ペリプラズム発現は、ジスルフィドが豊富なターゲットの成功折りたたみを助けることができるもう一つの可能​​性である。ペリプラズムは、細胞質よりも低い還元環境で、ジスルフィド結合を支援するための有用な酸化還元シャペロンが含まれています。 DsbCは、DsbAの、およびMBPタンパク質は通常、彼らの周辺質のシグナル配列によってペリプラズムに局在している。これは折り畳みを助けるために、細胞膜周辺腔にジスルフィド豊富な目標を指示するために、これらのタグを活用する機会を提供する。難治性のターゲットでは、次のステップはPになります（これは、このプロトコルの範囲の外にあり、ここでは3 9で議論されることはありません）封入体からの不溶性Hisタグのターゲットをurify、可溶化し、リフォールディング。これは、1つまたは2つのジスルフィド結合を有する標的に対して非常に単純であるが、ジスルフィド結合の数が増加するにつれてますます難しくなることができる。あるいは、そして特に4個以上のジスルフィド結合を有するタンパク質およびペプチドのためには、例えば、酵母、昆虫または哺乳動物発現などのより複雑な生産システムを試すことが有益であり得る。 小型化と自動化の進歩により、HTPの電気生理学ラボオンチップ技術28は、間違いなく機能解析のための将来の道になります。我々は（おそらく構造的研究を除いて）ほとんどの目的のために、これは大規模な文化のための必要性を否定することを想定。小規模培養物は、発現条件をスクリーニングするために有用であるだけでなく、接尾を提供することができるようになるだけでなくこれらの小型化された機能アッセイのためのサンプルのficient量。機能的特徴付けのために十分な量で並列に複数のターゲットを生産する能力を培養し、そのプラットフォームのこれらの種類を使用することのコストを下げるため、組換えタンパク質の発現および特徴付けは、コストと時間が有効になります。 プロトコルは、本明細書欧州FP7 VENOMICSプロジェクトの初期段階において、ジスルフィドリッチなペプチドおよびタンパク質の発現に適用されている。毒は頻繁に興味深い薬理可能性を持っている生理活性ペプチドの優れた供給源である。しかし、それらの製造、それらの複雑なジスルフィド結合パターンと小型サイズのため困難である。本明細書に記載のようなハイスループットプラットフォームを用いて、VENOMICSプロジェクトは、自然界で観察される多様性を再現する10,000の新規毒ペプチドのライブラリーを生成することを目的とする。このライブラリは、ジスルフィド-Rの特徴付けのために利用されます新薬の開発を目的とした潜在的な薬理または治療への応用とICHペプチド。プラットフォームは、現在VENOMICSプロジェクトで使用するための新しいプロトコルをベンチマーキングし、検証するために使用されている。

ゲノミクスおよび新規タンパク質の発見の加速された速度の進歩によって動機付けられ、ハイスループット·パイプラインは、最適なタンパク質産生戦略のスクリーニングおよび同定のための従来のアプローチを並列化するために開発されている。潜在的な最適化すべき変数に変化する式は1,2菌株 、これらに限定されないが、温度3,4、メディア2,3、ターゲットは5変異体、融合パートナー6-13、14,15シャペロンとの共発現は、細胞質あるいはペリプラズム発現16〜18、及び精製バッファー成分3。バッチ間のばらつきを抑制しつつ、高スループットのアプローチを実装することにより、多数の変数または多くのターゲットは、高い効率と並行して試験することができる。我々の経験では、戦略は（温度、メディア、曝気など）および精製条件（同RESI同じカルチャを使用して、スケールアップの際に良好な再現性を提供しますnは、緩衝液など）を含む。いくつかのハイスループットプラットフォーム、すなわちそのような融合パートナーは、発現株または温度19-23変化するパラメータ等を介して、可溶性タンパク質発現のための条件を識別するために過去10年間に使用されてきた。 我々は最近、可溶性ジスルフィドリッチタンパク質11の発現のための私達のハイスループットスクリーニング法を使用していました。選択されたタンパク質は、有毒な供給源からだけであったが、植物、ブタ、ウシ及びヒトを含む広範囲の種からのジスルフィドリッチな酵素阻害剤を含んでいた。実験は、12の異なる融合パートナーと28ジスルフィド網状タンパク質の溶解性と折り畳みに3の異なる発現株の効果を比較した。我々は（収率および得られた可溶性タンパク質の数の両方で）株BL21（DE3）での生産のための融合パートナーとしてのDsbCを使用してpLysSを大幅outproducedひずみとの融合の他の組み合わせは11をテストしたことを明らかにした。ザ·この実験の結果は、ジスルフィドリッチな標的の発現のためのより適したものに（広範囲のタンパク質の発現をスクリーニングするために使用されている）当初の一般的なハイスループット·パイプライン22,24を適合させるための基礎を形成した。動物の毒からジスルフィドリッチタンパク質は、特に重要である。毒は、薬理学的および治療的潜在値と、生物活性ペプチドおよびタンパク質の複雑な混合物である。しかし、ジスルフィド結合含有タンパク質の発現は、容易ではありません。これらのタンパク質は、一般的に一から七のジスルフィド結合の間で含まれており、アクティブにするために、正しいジスルフィド結合パターンを用いて酸化されなければならない。現在、プラットフォームは、FP7、欧州VENOMICSプロジェクト（www.venomics.eu）の一部として、ジスルフィドリッチな動物毒多数のタンパク質の発現をスクリーニングおよび標的の数千のハイスループット発現のための新規なプロトコルをベンチマーキングするために使用されている。ここでは、自動化された方法ジスルフィドリッチに動物毒タンパク質を印加（ 図1参照）の高スループットの小規模発現スクリーニングおよび精製の ​​ために設けられている。ジスルフィドリッチペプチドやタンパク質のための戦略は、精製および酸化還元活性融合パートナー、DsbCは、標的タンパク質に切断可能なHIS-DsbCの融合を作成します（ 図2を参照）のための彼のタグを利用しています。 プロトコルの焦点は、本明細書ロボットとHTP電気泳動を処理液を用いて自動化であるが、これらの方法はまた、高スループットの手動アプローチに適している、基本的なセットアップでさえ研究室は高価な機器のための任意の必要条件なしにプロトコルを利用できることを意味。精製および分析（ジスルフィドリッチタンパク質に固有のものではありませ）への変換のためのマニュアルのプロトコルは、他の場所で24公開されており、ここでは繰り返さない。再結合によって生成される発現クローンからの手動手順のスループット（、可溶性タンパク質レベルの分析にナショナルクローニング25）、96（SDS-PAGE検出を使用して）または384（4×96であるドットブロット及びSDS-PAGE 26を使用して）週培養（） 図1を参照。 （例えば、キャリパーGXIIラボチップシステム22と同様に、液体処理ロボットおよびドットブロット26又はHTP電気泳動を使用した半自動化された方法で行われる場合、これを増加させることができる 結果の分析のための）最大1152まで（12×96）一週間にわたって並行して培養、本明細書に記載される。正規振盪インキュベーターに十分な通気のための短い軌道高速振盪インキュベーターの使用を必要とディープウェル96（DW96）形式、（振盪で増殖させた培養物とは対照的に使用できるように、培養は24（DW24）形式深いウェル中で行われる800rpmで）。自動誘導培地27の使用はまた、手動誘導ステップを排除し、式を簡素化します。研究所ではすでに、事前定義された式とプリを使用した場合でもfication条件が、これらは単に効率を向上させるために、このHTPシステムに直接転送することができる。ジスルフィドリッチタンパク質のためのハイスループットスクリーニングパイプラインの詳細な概略図を図3に設けられている。パイプライン中のパラメータはボランティアタンパク質生産のための最も有用な条件を選択させ広範なスクリーニング実験11、22、に基づいて選択した。 特徴付けは、サンプルの数十マイクログラムが十分な、または敏感な機能アッセイ及び結合アッセイ（例えば、低容積HTPパッチクランプシステム28）のためのパイロットスタディにおける小規模表現から直接精製タグ付きタンパク質を行うことができる。同じであっても、切断後に、タグなしのターゲット上で実行される、タグおよびプロテアーゼを設けすることができる（逆相HPLCによって、など）を除去する。品質管理はまた、（予想されたサイズおよび酸化番目を確認するために質量分析法によって行うことができるATE）や、純度や異質性を確認するクロマトグラフィー法（）29。時々 、切断が不要な、あるいは望ましくない（特に難溶性タンパク質のため30,31）ので、このプロトコルの切断にはオプションのタグ。それにもかかわらず、全ての構築物内で直接（ 図2および考察を参照されたい）切断後、天然のタンパク質を産生する標的遺伝子の前にTEVプロテアーゼ切断部位（ENLYFQ / [G] 32）がある。融合タグの切断が所望される場合、切断は、効率性を分析する必要に応じて条件を最適化し、後続のスケールアップ実験の収率の信頼できる推​​定値を得るために小さなスケールで（溶出画分または「カラム上 &#39;）試験することができる。 実験の目的や期待に応じて、アフィニティ精製の間に使用されるビーズの量は2つのオプションがあります。パイロットアッセイまたはMSのために精製するために（可能な限り多くのタンパク質を捕捉できるようにする、又はextrapolに）スケールアップ利回りのために食べた樹脂を200μlの最終容量は、システムが飽和する前に、1から100 mg / Lの文化の範囲内の可溶性タンパク質の検出を可能とする、使用されるべきである）8.1節の（プロトコル（Aを参照） 。実験の目的は、可溶性タンパク質の低量の検出である場合は、樹脂の50μlの最終体積は、（B（プロトコルを参照して0.1〜25 mg / Lの培養物の範囲内の可溶性タンパク質の検出を可能にする、適切である）セクション8.2）である。 必要に応じて生産は可溶性発現のために識別条件を用いてさらなる構造的および機能的研究のために精製された標的のミリグラム量を得るために、スケールアップすることができる。 AFMBで使用スケールアッププロトコルの詳細は他の場所で議論されている22,24。 実験装置、プロトコル内の重要なステップに関連するさらなる詳細は、変更及びトラブルシューティングおよび技術の限界は、ディスクで提供されussion。実験開始前の議論をお読みください。 我々は、各ステップで90％の成功率を期待するプロトコルの全体にわたって（例えば、培養物の少なくとも90％が、任意の所与の段階で成長しなければならない）。実験におけるいずれかのステップの成功率が90％を下回るとサンプルが廃棄され、実験が構築物の完全な回収のために繰り返される。これは試験したタンパク質に高度に依存するであろうしかし、この成功率は、可溶性タンパク質として発現構築物の番号又は100％の効率で切断する構築物の割合には適用できない。 ロボットワークテーブルのセットアップのための具体的な詳細は、各プロトコルのために提供される別のワークテーブルのセットアップに必要とされるが、それらは適合させることができる（また、 図4を参照）。ロボットハードウェア（テカン）を96マルチチャンネルアーム（MCA96）、ロボットマニピュレータ（ローマ）と8チャンネル液体ハンドリングヘッド（で構成されていますLIHA）。 MCA96が利用できない場合MCA96を利用するすべてのステップもLIHAがステップ間に洗浄する必要があるので、彼らは時間がかかります、LIHAを使用して行うことができる。ロボットは、技術的に無菌環境ではありませんが、抗生物質を含めることは、一般的には、汚染や無菌性に問題がないことを保証します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates. 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&#38;ID=5270&#38;Menu=1&#38;Item=21.1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR (PCR96) plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>652270</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at -20 &#176;C. Use a 1 in 1000 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>780270</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the expression of target constructs. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) pLysS competent cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or alternative E. coli expression strain of the user&#39;s choice. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathseal breathable adhesive film</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine with 96-well plate block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well sterile tissue culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662165</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l sterile disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 617</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Shaking Incubator, with 3 mm throw</td>
			<td>Infors</td>
			<td>AJ103</td>
			<td>Not essential, a regular shaking incubator can also be used. 
			http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For glycerol stocks and elution using purification protocol B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the preparation of glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 616</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape pads&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td> 
			http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactinyl</td>
			<td>Orapi Group</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent microbial disinfectant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYP-5052 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for recipes of components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well 24 (DW24) plates,10 ml capacity&#160;</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7701-5102</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed, clear microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance readings. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reading spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional. For measuring OD600nm of cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with rotor for deep well plates&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Suitable for 3800 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mg/ml in water. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole ACS grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IX0005-1</td>
			<td>A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates)</td>
			<td>Misonix Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2M stock in water, autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE or Caliper sample buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Receiver/Filter Plate 20 &#181;m, 1.8 ml capacity</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740686.4</td>
			<td> 
			http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable wide bore tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 050 348</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni Sepharose 6 Fast Flow resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5318-02</td>
			<td>For purification of target fusion proteins. Store at 4 &#176;C. Wash and equilibrate before use. 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well 0.22 &#181;m filter plate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSGV N22 10</td>
			<td>Optional. To filter the soluble fraction after cleavage. 
			http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user&#8217;s discretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer and cuvettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip pipette tips</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Optional. The type of ZipTip is at the user&#39;s discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control. 
			http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author&#8217;s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in e. coli

大腸菌（E.coli）は、構造的および機能的研究のための組換えタンパク質の生産に最も広く使用される発現系である。多くのタンパク質は、不溶性の形態で発現されているので、タンパク質を精製することは時々困難である。困難または複数のターゲットを操作するときには、そのため迅速可溶性発現のための条件を識別するために、高スループット（HTP）小規模のタンパク質発現スクリーニング（1-4 5ml培養物）を使用することをお勧めします。ラボの種々の構造ゲノミクスプログラムに対応するため、（組換えタンパク質の0.1 mg / Lの培養物の範囲内）の定量的およびHTPタンパク質発現スクリーニングプロトコルは、何千ものタンパク質上に実装され、検証された。プロトコルは、液体ハンドリングロボットを用いて自動化しただけでなく、特殊な装置なしに手動で行うことができる。 ジスルフィド豊富な毒タンパク質が増している治療薬のリードとしての可能性の認識を高める。彼らは、非常に強力かつ選択的なことができますが、その複雑なジスルフィド結合ネットワークは、それらを製造するために挑戦します。 FP7、欧州Venomicsプロジェクト（の一員として<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a> ）、私たちの課題は、機能的な特徴付けのための新規毒液タンパク質の何千もの生産を目的に成功した生産戦略を開発することである。ジスルフィド結合イソメラーゼのDsbCの酸化還元特性に助けられ、私たちは、 大腸菌中の酸化、機能的な毒ペプチドの発現のための私達のHTP制作パイプラインに適合大腸菌細胞質。プロトコルはまた、多様なジスルフィドリッチタンパク質の産生に適用可能である。ここでは、私たちのパイプラインは、動物の毒タンパク質の産生に適用さを証明している。プロトコルは、本明細書に記載してit可溶性ジスルフィドリッチタンパク質週できるだけ少ないで得られる可能性が高い。小さなスケールから、目を使用する可能性がありますeは、質量分析によって酸化状態を検証するために、パイロット研究において特徴づけのため、又は感受性マイクロアッセイのためのタンパク質を精製した。

代表的な結果をVENOMICSパイプラインから96ジスルフィドリッチタンパク質の発現スクリーニングのために、図6に示されている。タンパク質は残基の数を増加させること、次いで、ジスルフィド結合の数を増加させることによって配置されている。ペプチドは、HIS-タグおよびDsbCは融合パートナーと細胞質中で発現させた。推奨される培養条件を用いる場合、12のOD 600は、通常達成される。ペプチドを、ニッケル親和性樹脂の50μlの最終容量で8.2-Bプロトコルを使用して精製したので、約25 mg / Lの融合タンパク質の最大値は、この実験で検出することができた。 図6Aは、カリパーラボチップ（Caliper LabChip）システム（切断前の融合を示す）および融合タンパク質mg / L培養で得外挿に基づいて、スコアリングシステム（0.1〜2 mg / Lの培養物のレベルで、2からの電気泳動結果を示す10 mg / Lの培養物、10〜25 mg / Lの文化なし<html> Tが検出されました。）期待通りに切断されたDsbCタグは、通常ではなく27kDaのよりも、約32 kDaの動作する​​ことに注意してください。同様に、DsbCは融合も予想よりも高い約5 kDaのを実行します。ターゲットの多くのために我々は完全な融合（上のバンド）を参照していないだけでなく、融合パートナーは、単独（下のバンド）。これらのターゲットのいくつかのために培養条件を最適化するだけではDsbCは、最終的な収量の増加を可能にすることに比較して、完全な融合（上のバンド）の比率を向上させることができます。得点だけ無傷の融合のレベルに基づいています。唯一の16 96のうち、タンパク質は、融合レベルで検出することができなかった。これは、83％の全体的な成功レベルに​​対応する。検出することができた80のタンパク質のうち、これらのうちの45は2 mg / Lの培養物（56％）よりも高いレベルで検出された。 （この例では、プロトコルB 8.2〜25 mg / Lの融合タンパク質の最大値を検出することができるを用いても）標的との融合に依存して、タンパク質収量は2〜100 mg / Lの培養物の範囲である。 T &quot;&gt;現在のジスルフィド結合の数（ 図6（b）に示す）による成功の分析では、最低の成功レベルが6ジスルフィドを含むターゲットに対して66％であることと、（1と7の間）を試験のジスルフィド結合のすべての数値のための合理的な成功を示しています債券。等電点及び残基の数（ 図6Cに示されている）に基づく式の成功の分布の分析は、両方の発現に成功目標とプロット全体に散らばって検出されなかったターゲットに、技術は特に偏りを示さない。 図6Dは、DTTで還元試料の前後に、単一のターゲットのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）から得られた質量分析結果の一例を示す図である。通常、このような網羅的な質量分析解析は、しかし完全なdemonstratioの目的のために、（還元試料を分析する必要がない）実行する必要がないであろうNは、両方の結果を示している。図示ターゲットは4ジスルフィド結合を有する5.7 kDaのジスルフィドリッチ毒液タンパク質である。左のスペクトルは、それがさらなる介入なしに切断し、脱塩した後だったので、前のDTTによる還元に対するタンパク質の結果を示す。右側のスペクトルは、余分なDTTを除去するための脱塩に続くDTTによる還元後のタンパク質を示しています。実験大衆に対応するイオンは、スペクトル上の矢印でマークされ、各イオンのための指定は、緑で表示されます。 （タンパク質のための先行削減（-DTT）へと縮小（+ DTT）の後に）これ​​らのイオンのために計算された実験的な親質量は表に示します。質量（減少したサンプルのための先行削減、5717.6 Daのサンプルのための5709.6 DA）は8ダの質量差を示す。 2 Daの質量差が、1酸化されたジスルフィド結合の存在に対応する（予想通り）、従って8ダルトンの質量差は4ジスルフィド結合の存在を示すで非還元サンプル。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" /> 記載の半自動化された機器とのハイスループット発現スクリーニングプロトコルの図1略図。このプロトコルを使用して、96から384の条件は手動の方法を使用して一週間に一人で試験することができる、または最大1152の条件。発現プラスミドは、多数のターゲットが一度にサブクローン化することができるように、組換えクローニング技術を用いて構築される。一旦可溶性発現条件が同定されており、切断が行われ、所望の場合、タンパク質は、酸化および純度、マイクロアッセイおよび/または大規模生産を確認するための品質管理に進むことができる。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" wiDTH = &quot;500&quot; /&gt; 図2。ユニバーサル組換えクローニングのための回路図と設計を構築します。対象エントリクローンから、複数の発現ベクターは、ハイスループット様式（週で最大6×96エントリークローン）の単一の実験でサブクローン化することができる。発現されたタンパク質は、ニッケルアフィ​​ニティー精製にHISタグをコードしている。 DsbCは（細胞質発現のためにそのペリプラズムシグナル配列を欠く）融合パートナーは、溶解度を増加および/または折り畳みと標的タンパク質の正しい酸化を助けるために使用される。タグの切断が所望される場合に、ターゲットコード配列がN-末端TEVプロテアーゼ部位（ENLYFQ）を含むべきであることに留意されたい。左上の挿入図は、PCRまたは遺伝子合成により得ることができるドナーベクターと標的配列を使用して、エントリークローンの生成を示す。エントリークローンはまた、商業的なエントリークローンコレクションから得ることができる。複数の組換えクローニングシステムは、しかし、我々はゲートウェイの体系を利用して、ご利用いただけますM、回路図に示すように。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" /> 図3。複数のジスルフィドの豊富なターゲットのハイスループットスクリーニングのパイプライン。目標は、最初は、BL21（DE3）pLysSをEの細胞質中のHIS-DsbCの融合体として表現される自動誘導培地（ZYP-5052）を使用して、17分の37℃で大腸菌 。精製は、HTP電気泳動（又はドットブロット/ SDS-PAGEによる）により、可溶性構築物の検出に続いて、ニッケル樹脂上で行われる。発現スクリーニングの最初のラウンドが失敗した場合に、代替的な培養条件が試されている。構築物は、十分に高い収率、マイクロアッセイおよび品質管理において可溶性タンパク質を産生する場合に実行することができ、必要に応じて、大規模生産を追求することができる。水溶性の利回りが十分に高くないターゲットの場合、発現スクリーニングは、代替STRAを続行することができますインした後、温度が他の融合パートナーとペリプラズム発現。オプションのステップは、破線のボックスで示されている。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" /> HTPプラットフォームの図4ロボットのワークテーブルのセットアップ代替ワーク·テーブルを使用することもできるが、我々の液体ハンドリングロボットワークテーブルのレイアウトは、示されている、利用可能な等価なサイトが提供される。セットアップは（8チャンネル液体ハンドリングヘッド（LIHA））、4箇所で2マイクロプレートキャリアごと（MP4、1-4および5-8位）、2箇所で真空ステーションのための洗浄ステーション（WS）で構成されています2ポジションごと（TE-シェーカーは、14〜15と16〜17位）し、キャリアと3位（MP3は、11〜13位）、2プレートシェーカー付きマイクロプレートキャリア、（TE-VACSは、9と10位） 3ポジションを使い捨てチップのために（DITI、18〜20位）。加えて再2ホテルディープウェルプレート用の担体（図示せず）マイクロプレート用の1である。液体処理ロボットに搭載されているハードウェアは、使い捨てチップ、周りにプレート/機器を動かし、固定チップを備えた8チャネル液体ハンドリングヘッド（LIHA）とロボットマニピュレータ（ローマ）で使用するための96のマルチチャンネルアーム（MCA96）ですワークテーブル。位置の番号付けは、プロトコルの全体にわたって参照される。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" /> 図5 4つの24ウェルプレート中に単一の96ウェルプレートから転送するための模式図。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" /> 図6。代表的な結果は96ジスルフィド豊富な毒プロの発現の画面に表示されますteins。タンパク質は、細胞質中のHIS-DsbCの融合体として発現させ、ニッケル樹脂を50μl（プロトコル8.2-B）を用いて精製した。A）式のスクリーニングの結果、仮想ゲルを示すと発現収量得点。仮想ゲルのコントラストは非常に弱い又は強いバンドを補償するためにレーンを調整された。上のバンドは、インタクトな融合タンパク質単独融合タグに対応する下位バンドに対応する、いくつかの標的のために二つのバンドを見ることができることに留意されたい。B）それぞれの発現レベルで発現されたタンパク質の割合でジスルフィド結合の数と比較しタンパク質。各群におけるタンパク質の実際の数は、グラフ上に重ねている。C）等電点（pI）および残基の数に基づいて、発現レベルの分布D）5.7 kDaのジスルフィドリッチな毒のための質量分析結果の一例4ジスルフィド結合を有するタンパク質。上のスペクトル左側の前、DTTによる還元と右側のスペクトルにタンパク質を示しているタンパク質はDTTで還元した後、脱塩を示しています。実験大衆に対応するイオンは、矢印でマークされ、その割り当ては緑で表示されています。前削減へと縮小後のタンパク質のための実験的な質量は、表に示されており、8ダの質量差を示し、還元剤を添加する前に酸化されたタンパク質の存在に対応している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td>コンポーネント</td><td>レシピ</td><td>コメント</td></tr><tr><td> ZY </td><td> 〜928ミリリットル 10グラムリプトン 5gの酵母エキス 925ミリリットルの水</td><td>混合し、次いで滅菌するオートクレーブ。 </td></TR&gt; <tr><td> 2男のMgSO 4 </td><td> 100ミリリットル 49.3グラムのMgSO 4·7H 2 O 約60 mlの水</td><td>溶解するまで攪拌して滅菌するオートクレーブ。 </td></tr><tr><td> 50X 5052 </td><td> 1 L 250グラムのグリセロール 730ミリリットルの水 25gのグルコース 100グラムのα-乳糖</td><td>順番に追加するすべて溶解するまでの熱の上に攪拌して滅菌するオートクレーブ。 </td></tr><tr><td> 20X NPS </td><td> 1 L 900ミリリットルの水 66グラム（NH 4）2 SO 4 136グラムのKH 2 PO 4 142グラムのNa 2 HPO 4 </td><td>順番に追加し、すべて溶解し、その後滅菌するオートクレーブまで撹拌。 </td></tr></tbody></table> ZYP-5052培地の成分については、表1。レシピ。

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High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

定量的スクリーニング、ハイスループット発現および小規模大腸菌培養物からの融合タンパク質の精製、分析のためのプロトコルを説明し、ジスルフィドに富む動物毒タンパク質標的の発現に適用される。

で産生された組換えジスルフィド豊富な毒タンパク質に印加される高スループット定量的発現スクリーニングおよび精製<em&gt; E.大腸菌の</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

high-throughput-quantitative-expression-screening-purification

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

24.0K ビュー.  Aix-Marseille Université. 定量的スクリーニング、ハイスループット発現および小規模大腸菌培養物からの融合タンパク質の精製、分析のためのプロトコルを説明し、ジスルフィドに富む動物毒タンパク質標的の発現に適用される。 

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

生物学

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

メチロトローフ酵母における組換えタンパク質の発現ピキアパストリス</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

内タンパク質の定方向進化のための変異導入と機能選択プロトコル E.大腸菌</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

からのペプチドおよびタンパク質との組換えエラスチン様ポリペプチドおよびその融合の非クロマトグラフィー精製<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...