この作品は、私たちは、SLO発現プラスミドのためのオクラホマ大学から博士R. Twete​​nに感謝NWAにNIHの助成金R37 AI34867およびR01 GM064625によってサポートされていました。

1。 ASMの転写サイレンシング<ol><li>シード1.5×10 35mmのガラスボトムディッシュ（MatTek社製）上のDMEM増殖培地（10％ウシ胎児血清（FBS）を有するDMEM高グルコース、2mMのL-グルタミン、1％ペニシリン-ストレプトマイシン）2ml中の5 HeLa細胞および5％CO 2インキュベーター内で37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>翌日、増殖培地をオフ吸引し、siRNAトランスフェクション混合物を添加する前に2ミリリットルのDMEMを減少血清培地（4％FBSを含むDMEM）、少なくとも1時間に交換してください。 </li><li> siRNAのオリゴトランスフェクション混合物のための4のチューブを準備します。チューブAとCに、トランスフェクトされる35mmディッシュあたり、血清および4μlのトランスフェRNAiMAXトランスを減少させた250μLのOptimemを追加。チューブBは、オプティメム250μlのを追加し、血清およびトランスフェクトされる35ミリメートル皿あたり制御メディアGC含量のオリゴ（対照siRNA）を8μlの（160ピコモル）、減少した。チューブDでは、追加のOptimem250μlの35ミリメートル皿Tあたり、SMPD1オリゴ（siASM）の血清および8μL（160ピコモル）を削減Oトランスフェクトする。室温で5分間チューブをインキュベートする。 </li><li>チューブAおよびBは、トランスフェクションのためのコントロールのsiRNA複合体、およびASM siRNAのための管CおよびDを形成する。 20分間室温で反応をインキュベートする。 </li><li>それぞれ35 mmのガラスボトムディッシュにコントロールsiRNAとASMのsiRNAトランスフェクション反応にゆっくりと混合物は、滴下して、追加し、37℃/ 5％CO 2でインキュベートする。 24時間のトランスフェクション後に、静かに、メディアをオフに吸引し、新鮮なDMEM増殖培地と交換してください。効率的なASMのノックダウンのために、料理はさらにライブイメージング前に約31時間（合計55時間）、37℃/ 5％CO 2でインキュベートする必要があります。 </li></ol> 2。ライブ顕微鏡用試薬の調製<ol><li> Ca 2 +およびMg 2 +なしで冷たい1×PBS中100 NG /μLの濃度で組換え孔形成毒素ストレプトリジンO（SLO）の溶液を調製する。これらのアッセイにおいて使用されるSLOはconstitutivelある親切に博士ロッドTwete​​n、オクラホマ大学が提供する活動のための還元剤は必要ありませんYアクティブシステイン変異体。毒素は、E.で発現された大腸菌 BL21 DE3、以前に16記載されているように、ネイティブな条件下で精製。 </li><li> 25 mM溶液を作成するために、DMSOに再懸濁FM1-43凍結乾燥粉末：FM1-43のストック溶液を調製する。 </li><li>溶液Aを準備します。4μmの最終濃度にCa 2 +を冷DMEM中でFM1-43のストック溶液を希釈（1.5ミリリットルをマテック皿のあたりに必要とされている）と、必要になるまで氷上で保存する。 </li><li> B液を準備します。4μM（マテックディッシュ当たりに必要な1.5ミリリットル）の最終濃度になるようにCa 2 +および10のEGTA（Ca 2 +を含まないDMEM）なしで冷たいDMEM中でFM1-43ストック溶液を希釈し、まで氷上に保存する必要としていました。 </li><li>事前暖かい（37℃）エッペンドルフチュー​​ブ内の溶液Aと溶液Bを1ミリリットルずつ。 </li><li>のCa 2 +、およびCを含むDMEMのアイスソリューションを保つ2 +を含まないDMEM中。 </li></ol> 3。 FM1-43の処理されたSLOに流入し、未処理細胞の生細胞イメージング<ol><li> 、砕いた氷でMサイズの浅い金属製の容器を埋める氷を持つ大規模なガラス容器に、それを反転させ、露出した金属容器の底面のみを残して、追加の氷を加える。でも、熱転写を可能にするために露出した金属底に湿ったペーパータオルを置きます。 </li><li> 1コントロールsiRNA処理マテック皿（ サンプル1）を取り、冷たい湿ったペーパータオルの上に置きます。優しくすべてのメディアをオフに吸引し、寒さのCa 2 +を含まないDMEMで3回洗う。最後の洗浄の後、皿にすべてのメディアをオフに吸引除去する。 </li><li>のCa 2 +の存在無しSLO創傷（ サンプル1）と細胞内の画像細胞関連FM1-43に、35 mmのガラスボトムディッシュの中心ガラスカバースリップに冷溶液Bの180μLを加え、5インキュベート氷上分（ 表1）。 </li&gt; <li> 37℃に加熱し、（温度、湿度、CO 2レベルを維持する）環境室を搭載した共焦点顕微鏡のステージ上マテック皿を置きます。 40X、NA 1.3の対物レンズ（ニコン）を通して見て画像化される細胞のフィールドを検索します。可能な場合、熱ドリフトを補正するためにPerfectFocusまたは類似のデバイスをオンにします。 </li><li>そっと35-mmディッシュの側に予熱溶液Aの1ミリリットルを加え、環境室（ 表1）のカバーを交換してください。 </li><li> （ULTRAVIEW近所パーキンエルマースピニングディスク共焦点顕微鏡システムにおいてVolocity）適切なイメージングソフトウェアを使用して、すべての3秒1コマで4分間の画像を取得する。 FM1-43の励起は488nmのバンドパスダイクロイックフィルタとを用いて488nmのレーザー線を用いて達成され、発光判別は527（W55）発光フィルターを使用することによって達成される。レーザパワーレベルとカメラの感度は、100ミリ秒の画像露光を達成するように設定されている。 </li><li>繰り返します3.2〜3.6は、そのステップ3.5溶液Bである（ 表1）を追加する必要がありますを除いて、Ca 2 +の非存在下ではありませんSLO創傷（ サンプル2）を対照siRNA処理細胞でFM1-43を検出するには、手順。 </li><li>プレゼンス（ サンプル3）またはCa 2 +が存在しない場合（ サンプル4）の中心ガラスカバースリップにSLOを含有する冷溶液Bの180μlを添加するのいずれかでSLOを負傷したコントロールsiRNAで処理した細胞へのFM1-43の流入を測定するには35 mmのガラスボトムディッシュ、ステップ3.3のように氷上で5分間インキュベートする。繰り返します3.6を通じて3.2ステップ、ステップ3.5（ 表1）で溶液AまたはB液のいずれかを追加し調整します。 </li><li>原形質膜修復におけるASMの役割を決定するには、手順は、すべての条件（ 試料5-8）（表1）のためのASM siRNAで処理した細胞を使用して3.2から3.6を繰り返します。 </li><li>上の細胞外組換えスフィンゴミエリナーゼ（SM）の役割を決定するために、（FM1-43の流入における阻害によって反射された）、細胞膜修復の動態は、（ サンプル9月10日 ）、SMが追加されたステップ3.5（0〜50μU）に溶液Aのどちらか、または溶液Bとし、生細胞の間に細胞に添加されている1ミリリットル（ 表1）の総体積で撮像。 </li></ol> 4。細胞へのFM1-43流入の定量化<ol><li>ムービーが取得された後、画像解析ソフト（Volocityスイート、PerkinElmer）を用いFM1-43の細胞内蛍光強度を測定する。フィールド内の各細胞の細胞質ゾル領域に関心領域を描画し、動画の全フレームを通じて平均FM1-43の蛍光強度を測定するためにソフトウェアツールを適用する。 </li><li>初期FM1-43染色の変動を調整するには、各ビデオのためのデータは、経時的な蛍光強度の増加倍数として表現さ​​れ、それぞれの異なる条件に対してプロットされている。個々の時点あたりの蛍光の倍増加セルは、F Tは、特定の時点での平均蛍光であり、F 0が t = 0（ 図1-2）での平均蛍光であるF T / F 0として計算される。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係はありません宣言します。

機械的損傷と、細胞膜の修復に関する初期の研究では、ガラスビーズ、マイクロピペット、せん断、傷や削れを落とすに至るまで、負傷した細胞の多様なメカニズムに依存していました。すべてのこれらのアッセイの読み出しは、定性的ではなく定量的であり、修復機構の動力学に関する正確な情報を与えなかった。損傷のこれらの形態の後に原形質膜を再シールする細胞の能力は、細胞質内の細胞外液に添加トレーサーの有無によって、膜不浸透性色素、サイトゾル酵素の損失、ATPレベル、または長期の浸透を測定した細胞生存。これらのアッセイのいくつかは、定量的に行うことができるが急速に単一細胞レベルで再シールの動態を評価しながら、これらの研究における1つの大きな障害は、創傷イベントを同期させるのが困難であった。 筋線維のUV-レーザー傷害の開発および使用follo親油性色素FM1-43の流入を検出することによって結婚これらの研究17,20における大きな進歩だった。代わりに削れやけがの類似の機械的手段によって、全細胞集団に与えた総ダメージのため、これらのアッセイは、単一細胞分析を可能にした細胞を創傷に複数の定義された方法を紹介しました。しかしながら、いくつかの問題がこのようなアッセイに残った。レーザー誘起病変の大きさは、生理的条件時に発生する膜損傷の形態よりも大規模で非常に可変レーザー強度に応じて、自然の中で非常に異なっている。別の問題は、1つの細胞または筋線維を追跡することができるイベントを再シールの数を減少させる、顕微鏡関連レーザを使用する時に負傷、従って、結果の統計的有意ことができることである。再現性及びサンプリングによるこれらの問題は大幅に原形質膜修復のメカニズムを調べるための方法として、レーザー傷害の有用性を低減。 TOこれらの問題に対処する、我々は正確に、細菌孔形成毒素によって引き起こされる原形質膜病変の修復速度を測定するために、新たな生細胞イメージングアッセイを開発した。多くの微生物が、真核細胞の膜を透過性にすることができる多数の毒素を有するので、これは、自然界で頻繁に発生する損傷の一形態である。温度は、細孔形成を誘発するために増加されるため、このアッセイは、正確には、低温での毒素を用いて細胞をプレインキュベートすることによって同期され、顕微鏡視野中の細胞の大多数は、FM1-43の流入のために分析されることを可能にすることができる。 このアッセイで実現細孔形成の正確な同期を顕微鏡視野内の複数の個々の細胞を同時に定量することができる、細胞膜の修復動態の再現性のある測定を可能にする。これらのアッセイにおける一つの重要な技術的要因は、イメージングのために使用される顕微鏡対物レンズの品質である。 T我々のアッセイで使用彼40X NA 1.3（ニコン）の目的は、画像解像度を損なうことなく、集団における細胞の十分なサンプリングを可能にする。 10倍の対物レンズに切り替えると、細胞集団の大規模サンプリングを可能にするが、達成され、解像度は、細胞内のFM1-43の適切な定量化のためには不十分であるだろう。この生細胞イメージングアッセイのための重要なステップは、熱ドリフトを補正するPerfectFocusまたは同様の装置の使用である。私たちの手順では、氷の上で、細胞への細菌の孔形成毒素のプレ結合した後、生細胞イメージングのために37℃まで急速に温度をシフトが必要です。この温度調節は、画像取得期間中軸フォーカスの変動の原因となり、補正されなければならない。 PerfectFocusまたは同様のデバイスは、このように、細胞膜の修復動態の正確な定量を可能に、長期間にわたって選択された焦点面の生細胞イメージングを可能にこの問題を修正します。 への鍵このアッセイの成功は、これが使用される毒素のバッチごとに異なりますので、事前に形成毒素の力価は、常に異なる濃度にするには、修復可能な非修理可能な用量を決定することです。特に、多くの毒素の、およびSLOの活性は、感受性および複数の凍結 - 解凍サイクルは、その活性に有害である温度である。ただし、各実験に並んで行わ滴定は正しい毒素の投与量を正確にタイムラプスイメージングのわずか数分で決定されることを可能にする。 このアッセイは、形質膜損傷後の十分な細胞内FM1-43の蛍光の検出に依存する。これは、特定の条件下で制限することができる。膜SLO形態に挿入した後、ロバスト性Ca 2 +流入および真核細胞の急速原形質膜修復応答を可能にする、約30nmの直径を有する細孔。約の細孔径を有するようアエロリジンおよびライセニンのような小さな病変を形成するが、孔形成毒素、彼らは不十分なCa 2 +およびFM1-43の流入につながる可能性があるため1-3 nmの23から25は、このアッセイのために適切でないかもしれない。 でも、このようなSLOなどの大きな細孔を生成毒素を使用して、このイメージングアッセイは、蛍光強度の絶対定量ではなく、相対的な蛍光を可能にしないことを心に留めておくことが重要です。このように、画像は、デジタルカメラのintrasceneダイナミックレンジ内で行われることが重要です。蛍光強度は、レーザパワー、露光時間、及びカメラゲインに影響されるので、修復および非両方でFM1-43とSLOで処理した細胞の予備撮影を行うことにより、各実験の開始時に、これらの3つのパラメータを設定することが重要である修復の条件（CA 2 +またはCa 2 +を含まない培地）。これはdetermとして（（SLOの添加前）は、時間ゼロでの蛍光検出を可能にする画像取得設定の選択を可能にするが、検出器の飽和を生じない非補修条件の下で取得の終了時に、ソフトウェアの読み出し）によりINED。 このアッセイを用いて、SLOの細孔は、このプロセスは、機械16の創傷の修復と同様の迅速な動態を有することを実証し、30秒未満での哺乳動物細胞の原形質膜から除去されることを実証することができた。その後の研究は、リソソーム酵素はASM形質膜の修復に必要であることを示し、ASM-19欠損細胞に細胞外に添加したときに再シール回復させることができる。本研究では、表示できるFM1-43流入アッセイの感度を利用した、初めて、その形質膜の修復はまた、細胞外Ca 2 +の非存在下で起こり得る。組換えスフィンゴミエリナーゼに傷ついた細胞の曝露は、Ca 2 +を含まない培地、細胞質膜修復のため、通常は許容されない状態では、SLOによる透過性細胞で再シールを促進するのに十分であった。興味深いことに、補完原形質膜修復能力のメンテーションは、原形質膜の外葉にこの酵素によって生成されたセラミドの量は、病変の除去プロセスの重要な決定因子であることを示唆し、スフィンゴミエリナーゼの高濃度への暴露後に観察されなかった。この知見は、Ca 2 +がリソソームのエキソサイトーシス工程をトリガする必要があるが、創傷の内在化に関与するスフィンゴミエリナーゼにより誘導されるエンドサイトーシスに必要とされないことを示している。

これは、機械的損傷後の血漿膜修復は、Ca 2 +依存性プロセスであること1,2数十年前から知られている。その後の研究は、傷口を通してのCa 2 +流入は、3,4を再密封するために必要とされる傷害の部位で細胞内小胞のエキソサイトーシスの積極的なプロセスをトリガすることが示された。細胞の細胞質内にロード蛍光色素の損失の速度は、修復の速度を評価するために使用され、再封が損傷後5 &lt;30秒以内に完了したと結論された。二つのモデルは、最初は、細胞膜修復にエキソサイトーシスのための要件を説明するために提案された。病変を通じてのCa 2 +流入は、そのだろう大規模な「パッチ」を形成、細胞内小胞の最初に同型の融合を引き起こすことが示唆さ1）「パッチ」モデル、次いで、創傷6と、その膜を提案しADDE 2）張力低減モデルを再シールするために原形質膜に適用すること創傷の近傍におけるCa 2 +依存性エキソサイトーシスによって7日間二重層の再封を容易にする、原形質膜の張力を減少させるであろう。原形質膜修復におけるCa 2 + -誘発さエキソサイトーシスの役割は、リソソームが損傷菌におけるそれらのエキソサイトーシスおよび原形質膜の修復を促進するのCa 2 +センサー分子、シナプトタグミンVIIを含有することを示す研究によって補強された8,9,10,11 。 しかしながら、追加の証拠は、単独で、エキソサイトーシスは、形質膜の修復を促進するのに十分ではなかったことを示した。原形質膜上の機械的な涙液に加えて、細胞損傷の頻繁な形態は、細菌12,13又は14,15免疫細胞によって産生さ孔形成毒素による透過性である。機械的な涙とは違って、孔形成タンパク質は、細胞膜は、膜「パッチ」を適用するか、削減するだけで再密封することはできない、安定した、タンパク質が並ぶ細孔を形成する上で自分自身を挿入膜張力をING。興味深いことに、研究は、哺乳類細胞は孔形成タンパク質を用いて透過処理した後に、それらの原形質膜を修復するための効率的な機構を有することを明らかにし、このプロセスは、細胞外Ca 2 + 12の存在を必要とする。機械的な傷5で観察されたので、この発見は、細胞表面から貫通孔の除去にも迅速なプロセスであったかどうかという疑問を提起した。プロセスは、細胞外Ca 2 +を必要とし、約30秒以内に完了する：驚くべきことに、我々の最近の研究では、孔形成毒素で透過処理した細胞の再シールは、機械的創傷の修復に非常に類似した性質を有することが明らかになった。より詳細には、このプロセスを調査し、我々は最近、リソソームのCa 2 +調節性エキソサイトーシスに加えて、原形質膜の修復は、リソソーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼ（ASM）の放出によって引き起こさ必須であるエンドサイトーシスの急速な形態を含むことを学ん目のためだけでなく、貫 ​​通孔のEの除去だけでなく、機械的な傷16の補修用。 孔形成タンパク質との透過処理後の細胞再密封の動態を決定するために、我々の研究室では、レーザー損傷孤立筋繊維17の再シール性を評価するために以前に使用されていたライブイメージングの方法論を適応。このアッセイは、安定して蛍光強度が増加した脂質二重層の外側のリーフレット中にインターカレートする親油性色素FM1-43の特性に依存する。ときに、原形質膜二重層を形質膜損傷および修復18,16,19,20を検出するための感度の高いアッセイを提供し、細胞内膜への細胞外の色素アクセスして破壊される。孔形成タンパク質との透過処理後の細胞の再シール性の評価のためにこのアッセイを適合させるために、我々は、膜コレステロール21に結合する細菌毒素ストレプトリジンO（SLO）、4℃で細胞をプレインキュベートした。同期セル透過化は、その後容易に貫通孔の形成をもたらすコンフォメーションの変化をオリゴマー化および活性化する加熱された顕微鏡ステージ、媒体を温めるために氷から細胞を移動させることによって達成することができる。このアプローチの利点は、レーザー創傷を用いて以前に公開されたアッセイの上に、多数の細胞は、細胞集団のより良好なサンプリングを提供し、顕微鏡視野内で同時に分析することができることである。孔形成毒素との機械的損傷および透過後に見られる細胞の再シール工程の間の機構的類似点を考えると、我々はここで説明するアッセイは、細胞膜修復の基本的なプロセスに関与する因子を解剖するために、非常に汎用性と強力な方法を提供する。一例として、我々はそれが修復過程ののCa 2 +依存性および非依存性の手順を識別するために、このアッセイを使用することが可能であることを示している。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HeLa 229 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL2-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose No Calcium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20168</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Optimem Reduced Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Control medium GC content RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12935300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMPD1 RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HSS143988</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat-inactivated</td>
			<td>Gemini-Bioproducts</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sphingomyelinase from Bacillus cereus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7651</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm-glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-14</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C9100-50</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>UltraViewVoX</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Volocity Suite</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Pathology Devices</td>
			<td>LiveCell System Chamber</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds

原形質膜の損傷が頻繁なイベントであり、創傷は急速に細胞の生存を確実にするために修復されなければならない。のCa 2 +の流入は、30秒以内〜原形質膜上に機械的な創傷の修復をトリガする重要なシグナル伝達事象である。最近の研究では、哺乳動物細胞はまた、細孔が細孔エンドサイトーシスに続いてリソソーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼのエキソサイトーシスを伴うのCa 2 +依存性プロセスでの毒素の形成に透過処理後に原形質膜を再シールすることを明らかにした。ここでは、毒素ストレプトリジンOにより透過性細胞の再シールは、Ca 2 +流入にも迅速かつ依存していることを示すために使用される方法について説明します。アッセイデザインは、損傷事象および撮像により原形質膜の完全性を復元し、親油性色素FM1-43は細胞内膜に到達することによって程度を定量化する細胞の能力の正確な速度論的測定の同期を可能にする。このライブアッセイALSoは外因的能力の評価は、それらの感受性形質膜を修復する細胞の能力を反映して、FM1-43の流入を抑制するために、例えばスフィンゴミエリナーゼのような可溶性因子を添加することができる。このアッセイは、私たちは、酵素の細胞外のほかは、Ca 2 +が存在しない場合に透過性細胞の再シールを促進するため、スフィンゴミエリナーゼは、カルシウム2 +依存性エキソサイトーシスの下流で作用することを初めて示すことができました。

リソソーム酸性スフィンゴミエリナーゼで枯渇細胞における細菌スフィンゴミエリナーゼ（SM）レスキュー形質膜修復の低濃度。 FM1-43画像化アッセイを用いて、我々は、以前のCa 2 +の存在下での創傷のリソソーム酵素ASM欠損とSLOに曝露された細胞は、原形質膜の欠陥は、組換えヒト酵素19の細胞外添加によりレスキューされていることを示した。ヒトリソソームASMは、最適な低pHを持っているので、我々は再密封も中性pHで完全にアクティブになっている、 セレウス菌 （シグマ）から精製されたSMの追加回復させることができたかどうかを調べた。以前に示されているように、セルコントロールsiRNAまたはASMのsiRNAオリゴで処理し、Ca 2 +の（修理のための条件ではない許容）が存在しない場合にSLOにさらさ均等ASMの枯渇が毒素（ 図1Aに対する感度と干渉しないことを示し、透過処理した）。興味深いことに、完全な救助OSLOへの暴露後に再密封するためのASM欠損細胞の能力fをμU/ mlの（ 図1B）、SMの低濃度で観察された5〜7.5した。培地に添加し、酵素濃度が増加するにつれて、レスキュー表現型が徐々に損失があった10 - 10μU/ミリリットルに曝露された細胞は、部分的にのみSLOへの曝露後FM1-43の流入を遮断し、50μU/ mlに曝露された細胞を示したASM-枯渇細胞（ 図1Bおよび1C）で観察されたものと同様の完全な再封欠陥を反映し、強い色素流入パターン。この結果は、SLOのエンドサイトーシス除去毛穴がしっかりセラミドレベルによって調節されていることを示唆し、SMによって細胞膜で発生した - 一定以上のプロセスが正常に起こらず、細胞が病変を削除することはできません。 スフィンゴミエリナーゼの添加は、細胞膜の修復におけるCa 2 +の必要性をバイパスします。 細菌Sの注目すべきことに、さらにCa 2 +の（セル再封が許可されていない通常状態）が存在しない場合に、SLOによって透過処理した細胞に、Mはまた、細胞膜の修復を救助した。のCa 2 +（ 図1Bおよび1C）の存在下での孔形成毒素に曝露された細胞に見られるように、SMのみが低濃度のFM1-43（ 図2Aおよび2B）の流入を阻止するのに有効であった。これらの結果は、原形質膜の修復のCa 2 +依存性段階の下流スフィンゴミエリナーゼ機能する。この発見は、リソソームとASMのリリースのエキソサイトーシスをトリガーするのCa 2 +の貫通孔を通って流れていることを仮定している私たちの以前に提案したモデル、と完全に一致して、細胞膜の外葉に切断するスフィンゴミエリン、セラミドを生成し、エンドサイトーシス22によって気孔除去を促進する、19。精製されたSMのほかは、Ca 2 +を強く強化の必要性をバイパスしているという事実リソソームの生理的条件下でのCa 2 +調節性エキソサイトーシスは、エンドサイトーシスを促進するために必要スフィンゴミエリナーゼ活性の供給源であることを。ビューは、S <img src="/files/ftp_upload/50531/50531fig1.jpg" alt="図1" fo:content-width="3.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50531/50531fig1highres.jpg" /> 図1 セレウス菌スフィンゴミエリナーゼ （SM）は、孔形成毒素ストレプトリジンO（SLO）。コントロールsiRNAまたはASM siRNAで処理したHeLa細胞のオリゴにより負傷した酸性スフィンゴミエリナーゼ（ASM）の発現のためにサイレンシングされた細胞の原形質膜修復欠損を補完することができ Ca 2 +およびFM1-43は、4分間の1フレーム/ 3秒で画像化した親油性色素の流入の有無に負傷した。 FM1-43細胞内の蛍光がVolocityソフトウェアを用いて定量し、経時的な蛍光強度の増加倍数として表した。（A）において<html> Ca 2 +の存在しないことは、両方のコントロールsiRNAとASM siRNAで処理した細胞は、SLOによって透過処理した。 18-27細胞がそれぞれの条件で分析した。エラーバーは、平均+ /に対応する-のCa 2 +の存在下において、SEM（B）、コントロールsiRNAで処理した細胞は、それらの形質膜を再シールし、流入染料停止することができた一方ASMのsiRNAで処理した細胞は、再密封することができなかった。加えてのCa 2 +の存在下で、スフィンゴミエリナーゼの低用量の外因性添加は、ASM siRNA処理細胞の原形質膜の欠損を補完する。 18から62細胞は、それぞれの条件で分析した。エラーバーは、平均+ /に対応- SEM（C）は、Bで分析映画の時間枠を選択しました。。バー、9μmでは。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50531/50531fig1large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <html> G &quot;ALT =&quot;図2 &quot;FO：コンテンツの幅=&quot; 3.25in &quot;FO：SRC =&quot; / files/ftp_upload/50531/50531fig2highres.jpg &quot;/&gt; 図2。スフィンゴミエリナーゼの添加は、細胞膜修復におけるCa 2 +の必要性をバイパスする。コントロールsiRNAで処理したHeLa細胞のCa 2 +の非存在下でSLOで負傷したと親油性色素FM1-43の流入は4について/ 3秒の1フレームで画像化した分。 FM1-43細胞内の蛍光がVolocityソフトウェアを用いて定量し、経時的な蛍光強度の増加倍数として表した。（A）は、通常のCa 2 +の非存在下でSLOと損傷した細胞で見られる再密封原形質膜の欠如は、外因性の添加により逆転されるスフィンゴミエリナーゼの低用量。 18〜31の細胞は、それぞれの条件で分析した。エラーバーは、平均+ /に対応- SEM（B）がで分析映画の時間枠を選択しました。。バー、9以下である。g2large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;大きな画像を見るにはここをクリックしてください。 <img src="/files/ftp_upload/50531/50531fig3.jpg" alt="図3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50531/50531fig3highres.jpg"/> 図3。手続きに関与した実験段階のための手続きのタイムラインタイムライン。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50531/50531fig3large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Ca2 +の条件 </td><td> CA2 +のない状態 </td><td> SLO毒素 </td><td> 暖かい溶液A </td><td> 温溶液B </td><td> スフィンゴミエリナーゼ </td><td> 手順ステップ </td></tr><tr><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> 3.2 </td></tr><tr><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> 3.7 </td></tr><tr><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> 3.8 </td></tr><tr><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> 3.8 </td></tr><tr><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> 3.9 </td></tr><tr><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> 3.9 </td></tr><tr><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> 3.9 </td></tr><tr><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> 3.9 </td></tr><tr><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> 3.10 </td></tr><tr><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> 3.10 </td></tr></tbody></table> 表1。手順に記載されている実験手順で使用される溶液の組成物。サンプルを行に記載されている。指定されたコンポーネント（オリゴのCa 2 +またはCa 2 +を含まない培地、SLO、溶液AまたはB、スフィンゴミエリナーゼ）の（ - ）の列が存在（+）または不在を示す。これらのサンプルは第手順セクション3で生細胞イメージングのために使用される実験的な工程が示されている。

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Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

親油性色素FM1-43に曝露された細胞のライブイメージングは​​、孔形成毒素は原形質膜から除去されることにより、反応速度の正確な決定を可能にする。これは、Ca 2 +、スフィンゴミエリナーゼおよび原形質膜の修復に関する他の要因のための要件を評価するために使用できる高感度のアッセイである。

カルシウムの役割を評価するためのイメージングアッセイを生きる<sup&gt; 2 +</sup孔形成毒素の傷の修復&gt;とスフィンゴミエリナーゼ

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

live-imaging-assay-for-assessing-roles-ca2-sphingomyelinase-repair

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

11.6K ビュー.  University of Maryland. 親油性色素FM1-43に曝露された細胞のライブイメージングは​​、孔形成毒素は原形質膜から除去されることにより、反応速度の正確な決定を可能にする。これは、Ca 2 +、スフィンゴミエリナーゼおよび原形質膜の修復に関する他の要因のための要件を評価するために使用できる高感度のアッセイである。 

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The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

の調製ショウジョウバエ</emハンギングドロッププロトコルを使用してライブイメージングのための>胚

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

生物学

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

ハニービーの嗅覚学習中のキノコ体の神経細胞のイメージング- 生体内のCa 2 + の

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

イメージングカルシウムのためのテクニック 2 +人間の精子でシグナリング

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

電子スピン共鳴酸素マッピングのためのライブ種のマイクロイメージング

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

クローン原性アッセイ：付着細胞

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

頭蓋間葉の細胞挙動を評価するための外植片アッセイ

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

モザイク大人のライブイメージングのためのトマト/ GFP-FLP / FRT方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;視細胞

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...