我々は感謝してアニャローターバッハ（Lehrstuhl Biomaterialien）、ローレンツ大全（サンドラーAG）とアーミンベック（B / S / H / G）の技術的及び科学的サポートを認める。 SEM-イメージングは​​ヨハネスディール（Lehrstuhl Biomaterialien）により行った。資金は、BMBF（01RB0710）から派生した。

1。紡糸原液の調製<ol><li> eADF4（C16）のタンパク質を凍結乾燥させてください。 </li><li>高精度の尺度を用いて、1mlの反応容器内でeADF4（C16）を20mg秤量する。 </li><li>ヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）を200μlを加え、パラフィルムで容器を密封する。 注： HFIPは非常に揮発性と有害である。それは慎重にピペット、安全フードの下で呼吸トラック、仕事に害を引き起こす、チューブキャップをすることができますように。 </li><li>ボルテックスは1分間サスペンションと、さらにソリューションをクリアするためにそれを振る。確実にするために、タンパク質の全体量が完全に溶解されていることを、一晩待つ。 </li></ol> 2。エレクトロスピニング<ol><li>場所対極と電極（-22.5キロボルト）と対極（+2.5 kVの）両方のプリセット電圧の上にフィルター材料：エレクトロデバイス（ 図1）を準備します。 315μL/時に体積流量を設定します。 注：Whileエレクトロ、毒性HFIPを蒸発されます。あなたのエレクトロデバイスがドラフトに接続されていることを確認してください。 </li><li>市販の20 G針を取り、30mmの残存長さにハンドグラインダーで鋭い先端を挽く。 、1mlのシリンジに針を接続します。 注：平面ニードルチップは、明確に定義されたテーラーコーンを生成するために必要とされる。 </li><li>シリンジに全体紡糸原液を（200μl）をロードします。完全な溶液が紡糸工程中に押し出すことができるようにするために、空気100μlのドープを重ねる。 注：針の目詰まりを避けるために、紡糸原液には粒子（集合体や不純物）がないことを確認してください。ヒュームフード下で働く！ </li><li>エレクトロデバイスのシリンジポンプにフィルドシリンジを接続し、液滴は、針の先端に表示されるまで、慎重に注射器にピストンを押してください。ピストンをロックします。 </li><li>距離を設定針の先端と8月20 cmまで対極との間。 </li><li>シリンジポンプを起動し、針の開口部から（通常は乾い）滴を削除します。直ちにエレクトロデバイスのすべての安全のインストールを有効にして、新たな液滴が現れるとすぐに高電圧源を開始します。紡糸原液のエレクトロと、続いて開始されます。回転持続時間を制御するためにストップウォッチを使用してください。 注：溶液の乾燥を回避するため、針の目詰まりするためには、それはすぐに乾燥させた液滴を除去した後、紡糸プロセスを開始する必要がある。 </li><li>組換えスパイダーシルクタンパク質のエレクトロは湿度と温度に依存するため、個々の研究室の状況に向けたプロセスパラメータの適応は（ 図2）必要があるかもしれません。 注：乾燥から滴を防ぐため（ 図2B）十分な流量を有効にします。低加湿がある場合TYは、周囲の雰囲気中で、相対湿度を調整するか、流量を引き上げる。適切なテイラーコーンが発生するまで電圧を下げます（ 図2A）。先端（ 図2C）全く解が存在しない場合、流速を高め、液滴が発生するまで電圧を低下させる。その後、定期的かつ安定したテイラーコーン（ 図2A）を確立するために、電圧を調整します。 </li><li> 30シリンジポンプオフスイッチをエレクトロスピニングの秒/ 60秒/ 90秒後。落下液滴を避けるために、シリンジ内の残圧を解放するために高圧電源を切る前に10秒待つ。 </li><li>ステップ6〜8は、比較のため、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリエステル不織布メッシュと同様に、黒色の紙のようなフィルター材料、異なるタイプのを行うことができる。 </li><li>その後の安定性実験のための不織布のメッシュを生成するには、フィルター材料の代わりに黒い紙を使用し、ステップ5〜7を実行します。エレクトロの5分後、停止ステップ8で説明したようにプロセス。 </li></ol> 3。シルク不織布メッシュの後処理<ol><li> 60予熱オーブン℃まで</li><li> eADF4（C16）不織布メッシュを垂直にし、ロック可能なガラス容器に2cmの最小距離をもつフィルタ基板を置きます。容器は、続いてエタノールと水を導入するために使用される2つの開口部を有するべきである。 注：フィルター材を固定する場合は、透水性実験のために必要な領域がクランプによって損傷されていないことを確認してください。 </li><li>後処理容器の内部底面（ 図3）にポインティングシリコーンチューブを60mlずつ2シリンジ、エタノールを充填した1、水で満たされたものを、接続する。 注：治療後の容器から液体を除去できるようにするために、できるだけ近い底部にパイプの開口部を配置する。 </li><li> OVで後処理容器を置きENとシリンジを押し出すことにより、エタノール60 mlを加える。治療期間を制御するためにストップウォッチを使用してください。 </li><li>エタノール蒸気処理の90分後、ガラスから注射器でエタノールを除去し、第2のシリンジから水60mlを加えます。 </li><li>別の90分間待ってから、水を除去し、オーブンのスイッチを切る。それが完全に冷えて凝縮して液滴を避けるために、炉容器を残す。 </li></ol> 4。スパイダーシルク不織布メッシュの分析<ol><li>黒い紙または他の取り外し可能な支持体上の安定性試験のための絹織メッシュを準備します。段ボールの2つのフレームを切り出し、両面粘着性粘着テープを調整します。黒い紙の上に堆積絹織メッシュに1つのフレームを押して、シルク繊維（その後のSEMイメージングのための過剰繊維を保つ）の過剰を遮断するメスを使用しています。丁寧に紙から不織布を切り離すために、フレームを削除します。二フレームを使用してこの手順を繰り返し（ 図4）。 </li><li>実用ディップテスト：各のピース（1 cm 2）を、後処理および非処理絹織メッシュをカットし、脱イオン水に浸す。治療不織メッシュ（ 図5）が安定になる一方、非処理絹織メッシュはすぐに、溶解します。浸漬した後、浸漬、試料を乾燥させ、SEMイメージングのための準備をします。 </li><li>フーリエ変換赤外分光法（FTIR）測定およびその後のフーリエ自己デコンボリューション（FSD）：不織布メッシュの後処理時の絹タンパク質の構造変化に関する情報を得るために、FTIR、パラメータを使用して適用することができる。透過率モード、60蓄積は、各スペクトルを測定し、平均しているcm -1の、一つの基準は、スペクトルごとに測定されます800から4,000にスキャンします。データの定量分析については、FSD（ 図6および図7）を用いることができる。これにより、データ曲線はARに低減される1590と1705センチメートル-1およびベースライン補正との間のEAが行われる。地元の最小二乗適合が22（1611 1619、1624、1630、1640、1650、1659、1666、1680、1691、1698センチメートル-1）これまでの研究から取らピーク位置に応じて算出される。 </li><li> SEM撮像：SEMは、繊維直径および異なるフィルタ基板上のシルク繊維の形態を調査するために、繊維の形態（ 図8）上の後処理の影響を分析するために適用することができる。十分に詳細な画像を得るために25,000 X〜5,000 Xの倍率を使用してください。 </li></ol> 5。通気性の決定<ol><li> Akustron空気透過性デバイスの測定領域にフィルター材料の適切な嵌合部を置きます。 注::あなたは空気透過装置の他のタイプを使用する場合は、DINの要件53 887、DIN 53 120、ISOを満たしていることを確認してください9237およびASTM D 737から96規格。 </li><li>Akustronの通気性·デバイス（または他の任意のよう5.1に示されている）を採用。必要はノルムのデータを計算すると[L /（M×2 秒）]。 </li><li>サンプルのさまざまな部分で、手順1と2は少なくとも10回繰り返し、算術ミドル（ 図9）を計算。 注：測定通気性は、デバイスの接触および不織布メッシュを必要とする。従って、試料の取り扱いに注意が繊細なシルク不織布メッシュの破壊を防止することが重要である。 </li></ol> 6。フィルター効率の決定<ol><li>このようなユニバーサルパーティクルサイザー（パラス社、カールスルーエ、GER）として、圧力制御やパーティクルカウンターで適切なマシンを使用してください。 </li><li>デバイスと測定粒子保持（ 図10）でフィルタのサンプルを置きます。エアゾール：DI-エチル-ヘキシルsebacat（DEHS）、粒径：0.3〜ミクロン、長さ：30秒;液体速度：2350センチメートル/秒;空気流量：3400メートル3 /時。 <br/&gt; 注：注意してサンプルを処理し、不織布メッシュの破壊を防ぎ、任意の汚染を避けるために、表面に触れないでください。パフォーマンス測定のために同等の品質の十分なサンプルを作成してください。 </li></ol>

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我々は、開示することは何もありません。

新しいフィルタ装置は、一定以上のフィルター効率で空気ろ過の全体のエネルギー消費を下げるようにする必要があります。ここでは、そのようなデバイスは、クモの糸で作られた不織布を使用して作成された。その低表面張力と高揮発性のため、HFIPは電気紡糸のために適切な溶媒として選択されている。また、水性シルク溶液は以前の実験で試験されたが、まだ繊維が生成されなかった。ここで、表面張力を低下させ、それによって溶液の紡糸特性を改善するために添加物を使用することが重要であろう。最も重要な工程は、高電圧及び押出速度を回転させて、条件および使用される材料の濃度および紡糸溶液の溶媒を調整することである。演奏中に、先端の目詰まり例えば水蒸気の形での水分とニードルチップを供給することにより防止することができるが、エレクトロスピニングセットアップでの追加の任意の種類は、その後乱す可能性があります敏感なプロセスおよび電界。本質的なプロセスパラメータ（濃度、電圧、距離、湿度）は、単独で独立した実験的な系列（データは示さず）を行う決定した。考慮し、すべてのパラメータを取ること、それは、連続テイラーコーンと均一繊維を作成するために紡糸工程の世話をすることが重要です。 フィルタ効率は、フィルタ材料の最も重要なパラメータの一つである。このパラメータは、主にフィルター材料の構造によって影響される。織布は、均一な細孔サイズと、その後一貫し通気性を継承します。これは、毛穴を埋めるために、ゼロ欠陥フィルタを生成するために、これらのテンプレート素材で均質織メッシュを作成することが重要です。我々のフィルタにおいて、フィルタ効率は、不織布、メッシュ層の数、従って、紡糸時間（シルクタンパク質の）に直接依存性を示し、。単繊維間の空隙が一貫保持Oの有効化、満たされているfは小さい粒子。 本研究では、高いフィルター効率を示す、スパイダーシルク不織布メッシュを有する新規なフィルター材料を製造するための方法を導入しました。したがって、これらのフィルタは、空気ろ過システムにおける将来の使用のための有望な候補である。

強度および伸展それらの組み合わせにより、スパイダーシルク繊維は、他のほとんどの天然又は合成繊維の1以上の運動エネルギーを吸収することができる。さらに、ほとんどの合成高分子材料とは異なり、絹材料は無毒と生体適合性であり、2,3を組み込んだ全くアレルギー反応を起こさない。推定上の健康上のリスクは、スパイダーシルクを使用することにより防止することができる。これらの機能は、医療と技術の様々なアプリケーションのためのクモの糸は非常に魅力的です。スパイダーは、その共食い動作により、養殖することができないので、生物工学的方法の両方、コスト効率的かつ十分な量4には、スパイダーシルクタンパク質を生成するために開発されてきた。 組換えシルクプロテインeADF4（C16）はAraneusのdiadematusのフィブロイン4（ADF4）の自然な配列に基づいて設計されています。 eADF4は、（C16）5 48kDaの分子量を有し、種々の溶媒に可溶である（hexafluoroisopropanol（HFIP）6、ギ酸7、水性緩衝液）8。 eADF4（C16）は、このような膜9、カプセル8、粒子10、ヒドロゲル11、コーティング7、繊維12と不織布メッシュ6などの異なる形態に加工することができる。それらの化学的安定性のために、後者はフィルタ用途において高い電位を与える。 ここでは、エレクトロ換えスパイダーシルクタンパク質の不織布のメッシュを含むエアフィルターデバイスを製造するためのプロトコルを提示する。エレクトロスピニング又は静電紡糸は、典型的には既にフィルタ·アプリケーション14として研究されてきたが10nm程度13 -10、及び不織布のメッシュの範囲の直径を有するポリマー繊維を製造するために採用される技術である。過去には、エレクトロスピニングが正常でなく、組換え的に産生さ16クモの糸のように再生された15の処理のために適用されているタンパク質。典型的には、高電圧（kVの5-30）をシリンジと8月20 cmの距離に配置された対向電極（0-20キロボルト）に印加さ​​れる。強い静電場は、帯電したソリューション内の反発力を誘導する。表面張力を超えた場合、テーラーコーンが形成され、細いジェットは、先端部17,18から噴出される。形成後、曲げ不安定性は、さらに、溶媒が蒸発するように延伸させる噴流内で発生し、固体繊維が形成されている。最後に、繊維がランダムに不織布メッシュ19と対向電極上に堆積される。直径と表面トポロジー（多孔質、滑らかな）のような繊維の特性、濃度、粘度、表面自由エネルギーと溶媒との本質的な導電率と透磁率20などのソリューションパラメータに主に依存している。溶液中のタンパク質の濃度に応じて80-1,100程度から直径がスムーズファイバにおけるHFIP結果に溶解eADF4（C16）のエレクトロ。HFIPからeADF4（C16）エレクトロは、主にα-ヘリックス二次構造を表示し、繊維は水溶性6アール。シルク繊維を安定化させるためには、β-シート構造はエタノールでその後の処理によって誘導されなければならない。以前に確立された後処理方法21とは対照的に、本 ​​研究でeADF4（C16）不織布は、シルク繊維の形態を維持するために、エタノール蒸気で処理されている。二次構造解析は、文献22に記載されているように、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）およびその後のフーリエ自己デコンボリューション（FSD）を用いて行った。 FSDは、FTIRスペクトルの分解能は、いくつかのオーバーラップバンドから成ることができ、信号処理ツールである。これにより、I領域の中の不明瞭な広い帯域が改善されたピークの解像度でデコンボリューションしたスペクトルを受信するためにハイパスフィルタを用いて狭くすることができる。 effのを評価するために、シルク不織布メッシュを補完フィルタ基板のiciencyは、通気性試験は、標準的なプロトコルに従ってAkustron装置を用いて行った。堆積速度は、パラスユニバーサルパーティクルサイザーを用いて測定した。

air filter devices including nonwoven meshes of electrospun recombinant spider silk proteins

Araneusのdiadematusのフィブロイン4（ADF4）、組換えスパイダーシルクタンパク質eADF4の天然の配列に基づいて（C16）設計されています。この反復性の高いタンパク質は48kDaの分子量を有し、異なる溶媒（ヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）、ギ酸および水性緩衝液）に可溶性である。 eADF4（C16）は、フィルム、カプセル、粒子、ヒドロゲル、コーティング、繊維や不織布メッシュなどの形態に加工した様々な技術的なアプリケーションのための高い潜在性を提供します。それらの化学的安定性および制御された形態のために、後者は濾材を改善するために使用することができる。このプロトコルでは、電界紡糸、組換えスパイダーシルクタンパク質の不織メッシュの堆積によって、異なるエアフィルタデバイスの効率を高めるための手順を示す。スムーズ繊維中HFIP結果に溶解eADF4（C16）のエレクトロ。異なる繊維直径（80-1,100ナノメートル）およびタンパク質濃度の変動（5〜25％w / vのは）結果不織布メッシュのため、細孔径。 タンパク質が新たに紡いだ繊維で、主にα-ヘリックス二次構造を表示しますので、HFIPからeADF4（C16）エレクトロの後処理が必要であるため、繊維は水溶性である。エタノール蒸気とのその後の処理は、シルク繊維とメッシュの形態を維持し、耐水性、安定したβシート構造の形成を誘導する。二次構造解析は、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）およびその後のフーリエ自己デコンボリューション（FSD）を用いて行った。 主な目的は、上にシルク不織布層を追加することで、既存のフィルタ基材のフィルタ効率を改善することであった。持続時間をエレクトロスピニングの影響及びフィルタ効率に従って、不織布層の厚さを評価するために、我々は、粒子堆積測定と組み合わせて通気性試験を行​​った。実験は標準に従って実施されたプロトコル。

HFIP〜10％w / vの濃度の組換えスパイダーシルク溶液のエレクトロスピニングは、不織布のメッシュの形成を可能にする、80〜120nmの範囲の直径を有する滑らかな繊維をもたらした。エタノール蒸気による後処理は、絹織後処理の適切な方法（ 図8）として設立され、それゆえ、だっ目立つ形態学的変化には ​​つながらなかった。構造変化は、FT-IR及びIバンドが単一寄与ピーク（ 図6）を分析するために行われた中での後続のFSDを用いて検出した。これは、α-ヘリックスundのランダムコイル構造の含有量が少なくなる（ 図7）が、後処理は、β-シート構造の増加をもたらすことを示すことができた。この結果は、実質的に水（ 図5）内に不織後処理を浸漬することによって証明することができる。でも、一週間後、不織布メッシュのない溶解が発生しません。 スピニング·デュ配給は、エレクトロ繊維の高密度化に基づいて圧力降下に起因するフィルター材料シルク不織布の適用に関する最も重要なパラメータである。こうして拡張回転期間のウント通気性の指数関数的な減少繊維層結果の上位数。この効果は、ポスト処理前と処理後の全ての異なるフィルタ基板材料（ 図9）を検出することができる。同様に、サブミクロン粒子が増加する（ 図10）のシルク含有濾材の濾過効率。短い回転期間（30秒）は、低フィルタ効率、より高い回転期間（90秒）高い効率のリードを獲得しながら。 <img alt="図1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50492/50492fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig1.jpg" /> 図1の高電圧（0〜30キロボルト）は、i<html> sがシルク溶液を充填したシリンジに適用され、対向電極（0-20キロボルト）は8〜20センチメートルの距離に配置されている。このセットアップでは、帯電したソリューション内の反発力を誘発する、強い静電場につながる。表面張力を超えた場合、テーラーコーンが形成され、細いジェット先端から噴出される。形成後、曲げ不安定性は、さらに、溶媒が蒸発するように延伸させる噴流内で発生し、固体繊維が形成されている。最後に、繊維がランダムに不織布メッシュ状の対向電極上に堆積される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig2.jpg" /> 図2の正規テイラーコーン（）、乾燥滴（B）、及び液滴（C）なしのセットアップの写真を。 iles/ftp_upload/50492/50492fig3highres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/50492/50492fig3.jpg &quot;/&gt; 蒸気後処理中に図3の回路図手順。最初のステップでは、チャンバはエタノールで充填されており、試料を90分間60℃で蒸している。以降の処理のために不織布メッシュを柔らかくするために、エタノールが除去され、繊維は60℃90分間水蒸気で蒸している℃で<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50492/50492fig3large.jpg" target="_blank">大きい図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig4.jpg" /> 後処理に使用する付属の絹織メッシュと段ボールのフレームの図4。写真。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig5.jpg" /> 図5。Electrosp国連とその後は後処理乾燥状態（A）に、水（B）の下で不織布。 <img alt="図6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50492/50492fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig6.jpg" /> 図6。アミド（A）未処理および後処理（B）スパイダーシルク不織布メッシュの私はバンドのフーリエセルフデコンボリューションされた吸光度スペクトル。実線はデコンボリューション後派生のような単一の拠出ピーク（点線）に起因する吸光帯が表示されます。それぞれの曲線の割り当ては、文献22から以前に発行された値に基づいていました。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50492/50492fig6large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図7" fo:conten<html> T-幅= &quot;5インチ&quot;のfo：srcが= SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50492/50492fig7.jpg&quot;を &quot;/ files/ftp_upload/50492/50492fig7highres.jpg&quot; /&gt; 図7非処理およびeADF4（C16）後処理織メッシュの二次構造含量。 <img alt="図8" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50492/50492fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig8.jpg" /> 図8は 、異なるフィルタ基板上のエレクトロeADF4のSEM像（C16）繊維：ポリアミド（PA）、ポリエステル（PE）、ポリプロピレン（PP）、純eADF4（C16）繊維前（S1）と後（S2）、ポストエタノール蒸気を用いた治療。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50492/50492fig8large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 / ftp_upload/50492/50492fig9.jpg &quot;/&gt; 図9空気透過性試験の前（A）および後処理の後に（B）をエタノール蒸気で絹織布のメッシュの増大紡糸時次いで、空気透過性を低下させる多くの不織布層につながる。 <img alt="図10" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50492/50492fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig10.jpg" /> 図10エタノールによる後処理後、シルク層量に影響を与える別の回転期間におけるポリアミドフィルタ材料に関するエレクトロスパイダーシルク不織布メッシュ、上のジ-エチル-ヘキシルsebacatエアロゾルのフィルター効率。

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Air Filter Devices Including Nonwoven Meshes of Electrospun Recombinant Spider Silk Proteins

クモの糸繊維は、臨時の機械的特性を表示します。エンジニアリング<em&gt; Araneusのdiadematusの</em&gt;フィブロイン4（eADF4）はエレクトロスピニングを用いた不織布メッシュに加工することができる。ここで、eADF4織メッシュは空気除菌装置の性能を改善するために使用される。

エレクトロ組換えスパイダーシルクタンパク質の不織布メッシュを含むエアフィルターデバイス

Based on the natural sequence of Araneus diadematus Fibroin 4 (ADF4), the recombinant spider silk protein eADF4(C16) has been engineered. This highly ...

air-filter-devices-including-nonwoven-meshes-electrospun-recombinant

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.1K ビュー.  University of Bayreuth. クモの糸繊維は、臨時の機械的特性を表示します。エンジニアリング Araneusのdiadematusのフィブロイン4（eADF4）はエレクトロスピニングを用いた不織布メッシュに加工することができる。ここで、eADF4織メッシュは空気除菌装置の性能を改善するために使用される。

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Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation biomaterials with high performance properties. The development of these new structural materials must be rapid, cost-efficient and involve processing methodologies and products that are environmentally friendly and sustainable. Spiders spin a multitude of different fiber types with diverse mechanical properties, offering a rich source of next generation engineering materials for biomimicry that rival the best manmade and natural materials. Since the collection of large quantities of natural spider silk is impractical, synthetic silk production has the ability to provide scientists with access to an unlimited supply of threads. Therefore, if the spinning process can be streamlined and perfected, artificial spider fibers have the potential use for a broad range of applications ranging from body armor, surgical sutures, ropes and cables, tires, strings for musical instruments, and composites for aviation and aerospace technology. In order to advance the synthetic silk production process and to yield fibers that display low variance in their material properties from spin to spin, we developed a wet-spinning protocol that integrates expression of recombinant spider silk proteins in bacteria, purification and concentration of the proteins, followed by fiber extrusion and a mechanical post-spin treatment. This is the first visual representation that reveals a step-by-step process to spin and analyze artificial silk fibers on a laboratory scale. It also provides details to minimize the introduction of variability among fibers spun from the same spinning dope. Collectively, these methods will propel the process of artificial silk production, leading to higher quality fibers that surpass natural spider silks.

Despite the outstanding mechanical and biochemical properties of spider silks, this material cannot be harvested in large quantities by conventional means. Here we describe an efficient strategy to spin artificial spider silk fibers, which is an important process for investigators studying spider silk production and their use as next-generation biomaterials.

実験室規模の合成クモの糸生産

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

生物工学

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, nanomedicine, tissue regeneration, and drug delivery. Designing materials based on the molecular-scale interactions between these proteins will help generate new multifunctional protein alloy biomaterials with tunable properties. Such alloy material systems also provide advantages in comparison to traditional synthetic polymers due to the materials biodegradability, biocompatibility, and tenability in the body. This article used the protein blends of wild tussah silk (Antheraea pernyi) and domestic mulberry silk (Bombyx mori) as an example to provide useful protocols regarding these topics, including how to predict protein-protein interactions by computational methods, how to produce protein alloy solutions, how to verify alloy systems by thermal analysis, and how to fabricate variable alloy materials including optical materials with diffraction gratings, electric materials with circuits coatings, and pharmaceutical materials for drug release and delivery. These methods can provide important information for designing the next generation multifunctional biomaterials based on different protein alloys.

Blending is an efficient approach to generate biomaterials with a broad range of properties and combined features. By predicting the molecular interactions between different natural silk proteins, new silk-silk protein alloy platforms with tunable mechanical resiliency, electrical response, optical transparency, chemical processability, biodegradability, or thermal stability can be designed.

バイオメディカル応用のためのシルクシルクプロテイン合金材料設計

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

マイクロ流体ドライ回転と再生絹フィブロイン繊維の特性

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

化学

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

三層のための3つのユニークな環境を提供するために、エレクトロスピニング法を適応させます<em&gt;インビトロ</em&gt;気道壁のモデル

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Reactive Inkjet Printing and Propulsion Analysis of Silk-based Self-propelled Micro-stirrers

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The resulting devices are an example of self-propelled objects capable of generating motion without external actuation and have potential applications in medicine and environmental sciences for a variety of purposes ranging from micro-stirring, targeted therapeutic delivery, to water remediation (e.g., cleaning oil spills). This method employs reactive inkjet printing to generate well-defined small-scale solid silk structures by converting water soluble regenerated silk fibroin (silk I) to insoluble silk fibroin (silk II). These structures are also selectively doped in specific regions with the enzyme catalase in order to produce motion via bubble generation and detachment. The number of layers printed determines the three-dimensional (3D) structure of the device, and so here the effect of this parameter on the propulsive trajectories is reported. The results demonstrate the ability to tune the motion by varying the dimensions of the printed structures.

This protocol demonstrates the ability to utilize reactive inkjet printing to print self-motile biocompatible and environmentally friendly micro-stirrers for use in biomedical and environmental applications.

シルクベース自走式マイクロスターラーの反応性インクジェット印刷と推進力解析

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

シルクナノ粒子の製造および薬物送達アプリケーション

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order to reproduce the remarkable mechanical properties of spider silks, they must be produced in heterologous hosts as spiders are both territorial and cannibalistic. The synthetic analogs of spider silk also tend to be insoluble in aqueous solutions. Thus, a large percentage of research in recombinant spider silks rely upon organic solvents that are detrimental to large scale production of materials. Our group&#8217;s method forces the solvation of these recombinant spider silks into water. Remarkably, when these proteins are prepared using this method of heat and pressure, a wide range of material forms can be prepared from the same solution of recombinant spider silk proteins (rSSp) including: films, fibers, sponge, hydrogel, lyogel, and adhesives. This article demonstrates the production of the solvated rSSp and material forms in a manner that is more easily understood than from written materials and methods alone.

Here, we present a protocol to produce water soluble recombinant spider silk protein solutions and the material forms that can be formed from those solutions.

熱と圧力を用いた水性溶媒和による組み換えクモ絹の材料形成

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical methods for manipulating and monitoring the activity of neurons in vivo. These types of experiments rely on two main components: 1) implantable devices that provide optical access to the brain, and 2) light-sensitive proteins that change neuronal excitability or provide a readout of neuronal activity. There are a number of ways to express light-sensitive proteins, but stereotaxic injection of viral vectors is currently the most flexible approach because expression can be controlled with genetic, anatomical, and temporal precision. Despite the great utility of viral vectors, delivering the virus to the site of optical implants poses numerous challenges. Stereotaxic virus injections are demanding surgeries that increase surgical time, increase the cost of studies, and pose a risk to the animal's health. The surrounding tissue can be physically damaged by the injection syringe, and by immunogenic inflammation caused by the abrupt delivery of a bolus of high-titer virus. Aligning injections with optical implants is especially difficult when targeting small regions deep in the brain. To overcome these challenges, we describe a method for coating multiple types of optical implants with films composed of silk fibroin and Adeno-associated viral (AAV) vectors. Fibroin, a polymer derived from the cocoon of Bombyx mori, can encapsulate and protect biomolecules and can be processed into forms ranging from soluble films to ceramics. When implanted into the brain, silk/AAV coatings release virus at the interface between optical elements and the surrounding brain, driving expression precisely where it is needed. This method is easily implemented and promises to greatly facilitate in vivo studies of neural circuit function.

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Here, we present a method for delivering viral expression vectors into the brain using silk fibroin films. This method allows targeted delivery of expression vectors using silk/AAV coated optical fibers, tapered optical fibers, and cranial windows.

生体内でシルク/AAV 膜を用いた光遺伝学的タンパク質の発現

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

神経科学

<meta charset="utf8"></head><body>FN-Silkメンブレンの形成と細胞培養インサートへの接着

Nanofibrillar Basement Membrane Mimic Made of Recombinant Functionalized Spider Silk in Custom-Made Tissue Culture Inserts

Replicating tissue barriers&#160;is critical for generating relevant in vitro models for evaluating novel therapeutics. Today, this is commonly done using tissue culture inserts with a plastic membrane, which generates an apical and a basal side. Besides providing support for the cells, these membranes come far from emulating their native counterpart, the basement membrane, which is a nanofibrillar, protein-based matrix. In this work, we show a simple way to considerably improve the biological relevance of the tissue culture inserts by replacing the plastic membrane with one made from a pure recombinant functionalized spider silk protein. The silk membrane forms through self-assembly and will spontaneously adhere to a membrane-free tissue culture insert, where it can provide support for cells. Custom-designed tissue culture inserts can be printed using a standard 3D printer, following the instructions provided in the protocol, or commercial ones can be purchased and used instead. This protocol shows how the culture system with silk membranes in inserts is set up and, subsequently, how the same cell culturing techniques that are used with traditional, commercially available inserts can be implemented.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:組換え官能基化クモ糸膜によるIn vitro細胞培養モデルの強化

Tissue culture inserts with plastic membranes are the golden standard in cell culture labs as permeable supports to establish cell layers and models of barrier tissues. Herein, we present a simple method to replace the plastic membrane with a more biologically relevant membrane made from a recombinant functionalized spider silk protein.

ナノフィブリル基底膜模倣品 カスタムメイドの組織培養インサートに組換え官能基性クモの糸で作られました

Replicating tissue barriers&#160;is critical for generating relevant in vitro models for evaluating novel therapeutics. Today, this is commonly done using ...

エレクトロ組換えスパイダーシルクタンパク質の不織布メッシュを含むエアフィルターデバイス

要約

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実験室規模の合成クモの糸生産

バイオメディカル応用のためのシルクシルクプロテイン合金材料設計

マイクロ流体ドライ回転と再生絹フィブロイン繊維の特性

三層のための3つのユニークな環境を提供するために、エレクトロスピニング法を適応させます

シルクベース自走式マイクロスターラーの反応性インクジェット印刷と推進力解析

シルクナノ粒子の製造および薬物送達アプリケーション

熱と圧力を用いた水性溶媒和による組み換えクモ絹の材料形成

生体内でシルク/AAV 膜を用いた光遺伝学的タンパク質の発現

ナノフィブリル基底膜模倣品カスタムメイドの組織培養インサートに組換え官能基性クモの糸で作られました

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エレクトロ組換えスパイダーシルクタンパク質の不織布メッシュを含むエアフィルターデバイス

要約

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実験室規模の合成クモの糸生産

バイオメディカル応用のためのシルクシルクプロテイン合金材料設計

マイクロ流体ドライ回転と再生絹フィブロイン繊維の特性

三層のための3つのユニークな環境を提供するために、エレクトロスピニング法を適応させます

シルクベース自走式マイクロスターラーの反応性インクジェット印刷と推進力解析

シルクナノ粒子の製造および薬物送達アプリケーション

熱と圧力を用いた水性溶媒和による組み換えクモ絹の材料形成

生体内でシルク/AAV 膜を用いた光遺伝学的タンパク質の発現

ナノフィブリル基底膜模倣品 カスタムメイドの組織培養インサートに組換え官能基性クモの糸で作られました

ナノフィブリル基底膜模倣品 カスタムメイドの組織培養インサートに組換え官能基性クモの糸で作られました

ナノフィブリル基底膜模倣品カスタムメイドの組織培養インサートに組換え官能基性クモの糸で作られました

ナノフィブリル基底膜模倣品カスタムメイドの組織培養インサートに組換え官能基性クモの糸で作られました