この作品は、NIHの助成金GM45916およびGM66834 JCHし、この作品をAKための国際レット症候群財団のフェローシップでサポートされていたにもNIHがGM088409とハワードヒューズ医学研究所のKLへの貢献を助成金によって支えられて

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H., Grigoryev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Short+nucleosome+repeats+impose+rotational+modulations+on+chromatin+fibre+folding.">a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding.</a> The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).</li><li>Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. 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C., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+histone+variant+H2A.Z+regulates+the+equilibrium+between+different+chromatin+conformational+states.">The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states.</a> Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).</li><li>Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. 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J., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+the+In+Vitro+Reconstitution+of+a+Defined+&amp;#34;30+nm&amp;#34;+Chromatin+Fibre+Containing+Stoichiometric+Amounts+of+the+Linker+Histone.">A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined &amp;#34;30 nm&amp;#34; Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone.</a> Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).</li><li>Dorigo, B., Schalch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+fiber+folding:+requirement+for+the+histone+H4+N-terminal+tail.">Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail.</a> J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).</li><li>Qian, R. L., Liu, Z. 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著者らは、利害の衝突を持っていません。

モデルヌクレオソームアレイは、クロマチン構造及び機能のin vitro研究のための非常に有用なツールである。例えば、それらは広く溶液30-34におけるクロマチン繊維縮合のメカニズムを研究するために使用され、tetranucleosome 35のX線構造を得ることが可能となされている。さらに最近では、それらは特定のコアヒストン変異体、突然変異体および翻訳後修飾14-16,36の構造的な影響を解読するのに有用であることが証明されている。ここでは、ヌクレオソーム位置決めDNAからモデルヌクレオソーム配列および組換えコアヒストンの組立のための一般的な方法を説明します。 精製された八量と601 207×12 DNAからのヌクレオソームの配列の再構成は順次、2M 2.5 mmのNaCl濃度を下げて、いくつかの透析工程を含む、簡単です。プロトコルの中で最も難しい部分は、目的のTEMをもたらすr値を使用することですプレート飽和レベル。適切なr値は、最初に小規模で実験的に決定した後、実験に使用されるヌクレオソームの配列を生成するために、より大きな規模で繰り返される。私たちのケースでは、主に、DNAあたり12ヌクレオソームで飽和601 207×12 DNAテンプレートを入手しようとしていた。完全に飽和した601 207×12ヌクレオソーム配列は〜27S 29におけるDNA堆積物当たりわずか11ヌクレオソームと同じDNAテンプレートが、29 Sでの沈降係数。したがって、分析用超遠心で沈降速度は、再構成後ヌクレオソーム飽和レベルを決定するための非常に感度の高い方法を提供する。我々は、拡散補正後の沈降係数の分布が得られる増強ファン·ホルデ-Weischet法を用いて、我々のデータを分析した。それは均質または不均質サンプルは、再構成後でどのように1に伝えますので、この情報は不可欠です。換言すれば、601 207×12 DNAテンプレートの、it図3は 、強化されたバン1.1のrにおいて再構成された601 207×12ヌクレオソームアレイのHolde-Weischet分析の結果を示すDNAあたり12ヌクレオソーム、DNAあたり11ヌクレオソーム等を有する試料の割合を示すもので略配列の30％が飽和を超えている。サンプルの有用性は、通常、飽和配列の割合に結びついたが、一部のアプリケーションでは、非常に均質な、および/または飽和の配列が必要な場合がありますインチのアレイが使用された実験に依存する。多くの方法は、ヌクレオソームアレイの均質性と彩度を向上させるために存在する。 この場合、過飽和アレイは37のMgCl 2を添加した際に選択的沈殿によって除去することができる。より均一なアレイは、ショ糖勾配遠心分離、分取ゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー10,13を用いて試料を精製することによって得ることができる。修正NUcleosomal配列の再構成法は、塩透析38,39を通じて再構成する前に、サンプルに短い競合DNAを加えることを求めている。これは1オーバーのDNAテンプレートを飽和させることなく、ヒストンオクタマー過剰のヌクレオソームの配列を組み立てることができます。ヌクレオソームアレイは、おそらく競合DNAとヒストンの余分な除去のための精製工程を必要とする競合DNAを用いて再構成した。 小さなスケールのパイロットアレイアセンブリ後には大規模に再構成されたヌクレオソームアレイが適切に飽和されないことが可能である。試料中の鋳型DNAおよびヒストン八量の浪費を避けるためには、上または飽和アレイの下に固定することができる。アレイは、飽和を超えている場合、余分なDNAを試料に添加することができる。アレイが飽和未満の場合、余分な量体はそれを修正するために添加することができる。しかし、すでに低塩に透析配列に八量を追加すると、解離オクタマー発生する可能性があります。余分なOを追加する場合ctamerまたはDNAは、配列バルクサンプルへの追加八量またはDNAを追加する前に戻る2MのNaClへの配列を透析する。ステップ3.4に従って高から低塩に固定したサンプルについて、手順透析。アレイを補正するために追加するオクタマーの量は飽和アレイ29の下で沈降係数から推定することができる。ヌクレオソームアレイのサンプルを調整した後、飽和レベルの測定が再度行われるべきである。 AFMは、ヌクレオソームアレイを特徴付けるための強力な方法であるが、複雑で労働集約的なプロセスである。これは、小規模な再構成のをスクリーニングするための技術が乏しいが、大規模なサンプルの特徴付けのためのクロマチン組織の研究のための優れた技術ができる。以前に私たちも、低いのMgCl 2濃度に対する「ハイパー応答性」だったmacroH2A欠失構築物によって生成された「マクロ」粒子を視覚化するために、AFMを使用している。 Likewiそれ自体、モンテルら （2009）H2A BBD変異体はヌクレオソーム配列は野生型配列と比較してより「オープン」であることが原因となることが示されている。そのため、AFMは、品質管理のためだけでなく、一般的なクロマチン繊維構造の研究のための信頼性の高い手法である。

真核生物のゲノムは、裸のDNAとして存在していないのではなく、圧縮し、結合したタンパク質で編成されています。 DNAおよびタンパク質のこれらの複合体は、クロマチンとして知られている。クロマチンの基本繰り返し単位はヌクレオソームである。ヌクレオソームは、ヒストンオクタマーと約1.6倍の1オクタマーヒストンに巻きDNAの146塩基対で構成されています。ヒストン八量体は、2つのコピーのコアヒストンH2A、H2B、H3、およびH4の各々から構成されている。繰り返しDNA分子に沿って配置されているコアヒストン八量はヌクレオソームアレイに呼ばれています。ヌクレオソームアレイの拡張構造は、10nm繊維又は「ストリング上のビーズ」構造と呼ばれ、低塩条件2の下で、インビトロで存在されている。 10 nmの繊維は、アレイ内の圧縮および/ ​​またはアレイ間オリゴマー2を介してより高次の構造へと凝縮することができる。これらの高次構造は、塩の存在下で誘導することができるまたはヌクレオソーム配列3,4にクロマチン建築のタンパク質の結合を介して影響を与えることができる。クロマチン圧縮のレベルは反比例ビボ 5,6 内の転写速度と相関している。最近の研究では、このような分化、癌の発生、その他7,8のようなプロセスにおけるゲノムの構造組織の重要性を強調しています。クロマチン構造及び機能を研究するためのヌクレオソームアレイの使用が普及している。ここでは、組換えコアヒストンとヌクレオソーム位置決めDNAからのヌクレオソームの配列の組立のための方法を説明します。 ヌクレオソーム位置決めシーケンスのタンデムリピートで組換えDNAを使用すると、規則的な間隔のヌクレオソームを含む配列の再構成を可能にします。より一般位置決め配列の二つは、5S rRNA遺伝子配列と「601」配列である9,10。 601配列を、SELEX実験やMORから派生したE強く5Sシーケンス11よりヌクレオソームを配置します。従って、アレイ601のリンカーDNAの長さはより均質である。縦列反復ヌクレオソーム位置決めDNAをゲル濾過4,12によって得られる。組換えヒストンは、E.から精製される変性条件13歳未満の大腸菌 。組換えヒストンの使用は1注意深くヌクレオソームアレイのヒストン組成を制御することができます。例えば、特定の変異14または翻訳後修飾を有するコアヒストン15,16は、野生型コアヒストンの代わりに用いることができる。 沈降速度実験は、遠心力17の下で、溶液中の高分子の沈降速度を監視します。これは、試料中の巨大分子の大きさや形状に関する情報が得られる。沈降速度実験従って、クロマチン繊維中の溶液の状態の変化を研究するための適切なツールであるクロマチン凝縮18による構造。重要なことは、ヌクレオソーム再構成アレイにおける品質管理工程として沈降速度実験を使用することがまず必要である。 DNAおよびヌクレオソームが適切なモル比で結合されない場合、アレイは過小または過剰飽和コアヒストンとすることができる。このように、沈降速度実験から得られた情報は、ヌクレオソームDNAが適切で飽和されていることを確認するために使用される。これは、以前に特徴づけられていないDNAテンプレートを扱う場合は特に、ヌクレオソームでDNAの飽和を推定するための代替方法を使用することが重要である。したがって、我々はまた、原子間力顕微鏡（AFM）を用いてヌクレオソームアレイの分析のための方法を記載している。 AFMは、例えば、飽和レベル、ヒストン変異体又は19,20のMgCl 2の影響の存在の効果などのパラメータの数の効果の可視化を可能にする強力な技術である。 AFMはまた、アプリをされているタイムラプスイメージング21を使用してヌクレオソームのダイナミクスを研究するエド。 インビトロでは 、彼らはAFMイメージング22に適した大きさの範囲内に属しているため、ヌクレオソーム12-merの配列は原子間力顕微鏡の研究に特に適している組み立て。本研究では、品質管理だけでなく、（「百聞は一見にしかず」）のAUCからデータを肯定する手段として、ヌクレオソームアレイのAFMを使用している。単純な可視化に加えて、AFMは、追加のメトリックとしての試料の高さプロファイルの測定を可能にする。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>A3648-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>21-152-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiLoad Superdex 200 16/60 Column</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-1069-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>VS2031</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-667A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfine</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-0476-01 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XL-A/I Analytical Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning dna

繰り返しDNA分子に沿って配置されているコアヒストン八量はヌクレオソームアレイに呼ばれています。ヌクレオソームアレイは2つの方法のいずれかで得られる：in vivoでの情報源からの精製、または組換えコアヒストンからのin vitroで再構成および縦列反復ヌクレオソームのポジショニングのDNA。後者の方法は、以上の組成が均一のアセンブリーと正確に配置ヌクレオソームの配列を可能にするという利点があります。分析用超遠心で沈降速度実験は、それらが、遠心力下で溶液を通って移動する速度を解析することにより高分子のサイズおよび形状に関する情報を得た。この技術は、原子間力顕微鏡とともに、DNAテンプレートの大部分は再構成後にヌクレオソームで飽和されることを保証する品質管理のために使用することができる。ここでは、長さのミリグラム量を再構成するために必要と組成的にDのプロトコルを記述クロマチン構造および機能の生化学的および生物物理学的研究に適しefinedクレオソームアレイ。

プロトコルを説明するために、我々は601の位置決めシーケンス（601 207×12）の12タンデム207 bpの反復からなる組換えアフリカツメガエルコアヒストンとDNAからヌクレオソームの配列を再構成した。まず、凍結乾燥されたコアヒストンからネイティブ八量を組み立てた後、S200カラム（ 図1A）を使用してFPLCによって八量を精製した。より大きな複合体は、S200カラムから先に溶出する。ヒストンは、一般的にこの順序で溶出：非特異的なヒストン凝集体、ヒストンオクタマー、H3/H4四量体、およびH2A/H2B二量体（ 図1A）。 S200カラムからのピークをSDS-PAGEにより分析した。精製されたオクタマー画分のゲルは4ヒストンタンパク質（ 図1B）の等モル量を示す必要があります。 アフリカツメガエル H2AとH2Bはわずか約200ダによって異なり、したがって、彼らはSDSゲル上の単一バンドとして現れる分子量を有していることに注意してください。 H3/H4四量体とH2A/H2B二量体は、バージョンの後に溶出しますが、ヒストンオクタマーピークに近いY。維持するためにどの分画を選択する際には、クロマトグラムのオクタマーピークの端に向かって表示される画分を廃棄することが賢明である。これらの画分は、非ヒストン八量体複合体の量が増加していてもよい。この場合、64から67は、ヌクレオソームの配列の再構成（ 図1）のためにプールされ、保存された画分。 ウルトラスキャン内で強化されたファン·ホルデ-Weischet分析から得られた沈降係数の拡散補正後の分配を表示する2つの異なる方法が存在する。赤い線は、沈降係数の分布の積分を表す。グラフ上の任意の点については、y軸に等しいか又はx軸上に示される値未満の沈降係数を有するサンプルの割合を示す。異種のサンプルが正の傾きを有する曲線を持つことになりますしながら、このように、縦線は、均質なサンプルを示している。緑の線はデです一体型分布のrivati​​ve。ピーク下の面積は、その沈降係数を有するサンプルの割合に比例する。完全に飽和した601 207 X 12クレオソームアレイが29S 29の沈降係数を持っている。 図3に示すサンプルの場合、データはアレイの約70％が飽和であり、30％が過飽和であることを示している。 原子間力顕微鏡は、in vitroでクロマチン組織を研究するために人気の相補的なアプローチに新たな技術となっています。ここでは、再構成後のテンプレート彩度の範囲を確立するために、分析超遠心のと一緒に、AFMを使用している。 図6では、撮像に用いる〜27Sアレイ（ 図4A）の大部分は、AFM及びAUC結果との間の優れた一致を示す、10-11ヌクレオソーム（ 図4B）を含有した。ここで得られたAFMの結果は、このようにしてこれを検証するそれヌクレオソームアレイを特徴づけるための信頼性のある技術的なアプローチとなります。 <table border="1"><tbody><tr><td> ヒストンタンパク質 </td><td> Σ276、非折り畳みタンパク質のCM -1 M -1 </td><td> 分子量ダ </td></tr><tr><td> H2A </td><td> 4350 </td><td> 13960 </td></tr><tr><td> H2B </td><td> 7,250 </td><td> 13774 </td></tr><tr><td> H3 </td><td> 4640 </td><td> 15273 </td></tr><tr><td> H4 </td><td> 5800 </td><td> 11236 </td></tr><tr><td> 8量体</td><td> 44080 </td><td> 108486 </td></tr></tbody></table> 表1。吸光係数およびアフリカツメガエルコアヒストンおよび復元させ、ヒストンオクタマーの分子量。 <img alt="図1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50354/50354fig1.jpg" /><br/&gt; 図1。セクション2で説明したように、S200列からAの溶出プロファイル。約44ミリリットルの小さなピークが大きいヒストン凝集によるものです。 67ミリリットルでの顕著なピークは、ヒストン八量です。 76〜90ミリリットルの広い肩はH3/H4四量体と二量体H2A/H2B S200欄から選択された画分の。B. 20％のSDS-PAGEが含まれています。彼らは非八量ヒストン複合体によって汚染され、少なくとも可能性が高いとして量体ピークから早期の画分を収集する必要があります。この場合、64〜67をプールし、ヌクレオソームのアレイの再構成のために保存した画分。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50354/50354fig1large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50354/50354fig2.jpg" /> 図2。 LAで3,000 rpmで収集された単一のスキャンのA. ProteomeLabソフトウェア画面キャプチャ（ベル）を加えた。サンプルは、この低速で土砂をしないことに注意してください。シングルスキャンは、AUC細胞スキャン（ステップ4.6）のための測定値の範囲を設定するために使用されている。ウルトラスキャンプログラム（追加ラベル付き）26を使用して得られた沈降速度スキャンの一連のB.のスクリーンショット。スキャンこの一連の分析のためにデータ·セット（ステップ5.1参照）を生成するために編集される。 <img alt="図3" fo:content-width="4.75in" src="/files/ftp_upload/50354/50354fig3.jpg" /> 図3。UltraScanIIからのスクリーンキャプチャ。赤と緑の線はウルトラスキャンでの沈降係数の分布を表示するための2種類の方法があります。グリーンは、デリバティブている間赤い線は、沈降係数の積分分布である。解釈に関する追加情報は、結果セクションに記載されています。 図4。原子間力顕微鏡。マウスのオクタマーと組み立て601 207×12アレイ用A.沈降速度プロファイルの平均沈降係数は27Sであることを示す。B. Aの同じ配列をAFMによって画像化され、いくつかの画像でカウントヌクレオソームの数は、MS Excelでプロットした。プロットは、配列の大半は、AUCのデータを裏付け10月11日ヌクレオソームを有することを示した。はっきり見えるリンカーDNAと601 207×12ヌクレオソームアレイのC. A 500×500 nmのスキャンを。右上のパネルには、振幅トレースで、中央の右側のパネルには、Cに示したアレイのための位相トレースである。右下のパネルには、左側にあるがヌクレオソームの高さプロファイルを決定するために、ヌクレオソームを通って引かフリーハンドラインで示されたのと同じ高さのトレースですS。上の画像にあるヌクレオソームのD.高さプロファイルは、以前に40を報告したように、すべてのヌクレオソームは、1.5〜2.5 nmの高さの中に及ぶことを示している。

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Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

この方法は、組換えコアヒストンからモデルクレオソームアレイの再構成および縦列反復ヌクレオソームのポジショニングのDNAのために提示されている。また、分析用超遠心で沈降速度実験、および原子間力顕微鏡（AFM）は、再構成後のヌクレオソームアレイ飽和の程度をモニターするために使用される方法を記載している。

組換えコアヒストンおよびヌクレオソームポジショニングDNAからのヌクレオソーム配列の組み立て

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

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Nanyang Technological University

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Anatomy and Physiology

Biology

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Cells and their Components

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22.5K ビュー.  Colorado State University. この方法は、組換えコアヒストンからモデルクレオソームアレイの再構成および縦列反復ヌクレオソームのポジショニングのDNAのために提示されている。また、分析用超遠心で沈降速度実験、および原子間力顕微鏡（AFM）は、再構成後のヌクレオソームアレイ飽和の程度をモニターするために使用される方法を記載している。 

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Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

アフリカツメガエルの胚および細胞接着アッセイのアセンブリから主催し、動物極の外植片の解剖

生物学

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

マウスの尾からのゲノムDNAの単離

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

組み合わせるQD - FRETとマイクロ流体はリアルタイムでDNAのNanocomplex自己組織化を監視する

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

アセンブリ、読み込み、および分析用超遠心器のサンプルセルの整列

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

土壌と堆積物から高分子量のゲノムDNAの抽出

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

ゲノムDNAから5  - ヒドロキシの選択的捕獲

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

多重ケモスタットアレイの設計および使用

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

からのペプチドおよびタンパク質との組換えエラスチン様ポリペプチドおよびその融合の非クロマトグラフィー精製<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.