著者は、このプロジェクトと彼らの支援のためのエレナLomakina、リチャードBauserman、マーガレットヤングマン、シェイVaknin、ジェシカ·スナイダー、クリスStriemer、Nakulナタラジ、鴻李鄭、テジャスKhire、エリックラムに感謝したいと思います。このプロジェクトは、NIH＃PO1 HL 018208によって賄われていた。

1。メソッド 1.1セル·フローチャンバー細胞は1.0 Paの（10ダイン/ cm 2）のせん断下で成長してから、アサイラムMFP3D AFM（サンタバーバラ、カリフォルニア州）に直接転送することができるように、図1に示すフローチャンバーは、構築した。 <ol><li> 15分間、次いで蒸留水でそれらを洗濯：フローチャンバーは最初ピラニア溶液（H 2 O 2 3：01、H 2 SO 4）内にスライドガラスを洗浄することにより、実験のために用意された。彼らはその後に焼成した乾燥した真空蒸着チャンバー内のシランアミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）で被覆した。 </li><li>シリコーンガスケットはシルエットSDの切削工具を用いて切断した。これは、私たちは細かく細胞増殖時の流速とせん断応力を制御するためのフローチャンバーの寸法を制御することができました。典型的には、チャネル、0.4 mmのシリコンのシートから長い19ミリメートルで幅の広い6.4ミリメートルを切断した。属に必要な流量TE 1.0 PA（10ダイン/ cm 2）のせん断応力は、次式を有する矩形チャネル内の層流を仮定して計算されます： </li></ol><img alt="式（1）" fo:content-width="0.737in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1.jpg" /> Qは流量であり、τはせん断応力であり、μは 、1.0メガパスカル（0.01ダイン*秒/ cm 2）であることがここで想定媒体の粘度であり、hは高さであり、wはフローチャンバーの幅です。 <ol start="3"><li>フローチャンバーのトップピースは、細胞培養皿にガスケットと整列し、磁気リングで固定した。アセンブリは、滅菌のためにイソプロピルアルコール（IPA）で満たされていた。 </li><li>フルフローシステムを組み立てた。細胞培養皿内のフローポートは三方弁に接続されていた。バルブは30ミリリットルのシリンジを開くために接続されていたsである。 IPAは、その後4％ウシ胎児血清（FCS）をマッコイ培地30mlで洗浄したシステムを介して流した。システムは、その後、Vecはテクノロジーズ細胞増殖培地20mlを充填した。カバーは​​シリンジのトップスの上に置かれた。キャッチ·リザーバーシリンジキャップ、フィードタンクに戻ってメディアを移動する場所に針を持っていた。滅菌0.2μmのフィルターは、システムの汚染を防止するためにカバーに空気口に取り付けた。フローチャンバーは、次に細胞播種の準備ができていた。 </li></ol> 1.2細胞培養<ol><li>ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECの）と増殖培地はVecはテクノロジーから購入（レンセラー工科大学、ニューヨーク州）とT25フラスコでコンフルエントになるまで増殖させた。 </li><li>増殖培地をフラスコと2.5％トリプシンの2ミリリットルでリリースされた細胞の単層から除去された。細胞は溶液中であったら、トリプシン処理をフラスコに細胞培養培地10mlを加えてクエンチした。 </li><li>木曜日eの細胞懸濁液を5分間遠心分離した上清を除去した。細胞は、フローチャンバーに注入するための細胞培養培地（血清を含む）1mlに再懸濁した。 </li><li>細胞懸濁液（0.5ミリリットル、〜50,000細胞）をシリンジに装填し、三方弁を介してフローチャンバーに注入した。 </li><li>細胞は、フローが開始される前に2時間のために解決し、ガラス基板に付着させた。細胞がコンフルエントになるまで1〜5日間37℃でインキュベーター内の流れの下で成長させた。 </li></ol> 1.3カンチレバーの作製と細胞のインデント<ol><li>チップレスのAFMカンチレバー（ナノワールド、スイス）を5分間硝酸で洗浄、蒸着室でシランアミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）で官能化された。 </li><li>ハンクス緩衝塩溶液中の重量のNHS-スルホ-LC-ビオチンで5 mg / mlの溶液（HBSS）を調製した。カンチレバーは、コンジュ〜15分間溶液中に浸漬したN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）化学とシランゲート。 </li><li>ビオチンを含まない培地の溶液を12時間streptavadinビーズ200μlでVecは技術、細胞培養培地（血清を含む）の20ミリリットルをインキュベートすることにより行った。ビーズを磁石で培地から除去し、培地を0.22μm滅菌フィルターで濾過した。 </li><li>フローチャンバーは、細胞培養皿から除去し、細胞を37℃ビオチンを含まない培地で洗浄した。 </li><li>ビオチンを含まない培地を1mlのストレプトアビジンでコーティングされた2.4μmのビーズ1μlの原液を調製し、株式100μlの細胞培養皿に添加した。 </li><li>ストレプトアビジンビーズは、ビーズ、後退の横のガラス表面上の先端を着陸ビーズ上にカンチレバーの頂点を配置した後、ビーズとの憩いの数秒にカンチレバーを押し下げることによってカンチレバーで拾い上げた。 </li><li>カンチレバーの感度は、メジャーだった裸のガラスの領域にインデントや電圧の関数としての先端のたわみを設定するには、曲線の傾きを指定することで、D。 </li><li>カンチレバーのばね定数は、次にMFP3Dソフトウェアの熱キャリブレーションから算出した。 </li><li> 図2に示すように校正されたカンチレバーは、その後、サンプルをインデントするために使用された。これらの2.4μmのビーズは柔らかい糖衣層の機械的特性を検出することができるように、細胞表面との接触面積を提供します。カンチレバーは、セルに細胞核と先端の柔らかいアプローチに近いセルの上に配置された細胞表面上約3μmカンチレバーの高さを設定するために使用された。ソフトウェアは7 NNの最大の力〜1μmで/秒の速度で20繰り返さくぼみに設定されました。約6秒の連続接点間経過。これらの初期ではあるが、グリコカリックスの時間依存特性をテストするためにインデントの異なるレートを使用することが可能です<html>実験は、単一のインデント率は（1ミクロン/秒）を用いた。 </li></ol> 2。インデント論半径Rの球との半空間弾性にインデントはインデントの力Fは 、式で与えられるヘルツ理論を用いて説明することができます： <img alt="式（2）" fo:content-width="1.157in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2.jpg" /> 押し込み深さここで、δであり、E * は 、被試験材料（ 図3）の減少率である。均一な弾性半空間を無限に当たる硬い圧子の場合、E *は次式で与えられます。 3/50163eq3.jpg &quot;/&gt; Eはどこ弾性率、νは材料のポアソン比である。ポリマーフィルムと最近の研究では、薄膜1の弾性率と厚さを決定するための2層モデルの開発にインスピレーションを与えてきました。我々は、細胞体の表面に均一な薄膜軟質フィルムとして糖衣を扱うことによって、細胞生物学に本モデルを適用しています。このモデルを使用して、システムの縮小率は次のようになります。 <img alt="式（4）" fo:content-width="2.85in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4.jpg" /> Eの GCはグリコカリックスの係数であり、E 細胞は細胞体の弾性率であり、P、Qおよびnは、経験的にポリマー収まるから決定された、 および z は次式で与えられる定数です。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withinページ= &quot;always&quot;を&gt; <img alt="式（5）" fo:content-width="1.257in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5.jpg" /> ここで、t は、糖衣層の厚さである。これらのパラメータの概略を図3に示します。モデルは硬めの基板1上に薄膜の弾性率と厚さを決定する正確な方法であることが示されている。 図4に示すように、この式は、内皮グリコカリックスの弾性率と厚さを決定するために、細胞内にインデントから得られた曲線に合わせて使用することができます。

<ol>
	<li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoindentation+measurement+of+young's+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson's+ratios.">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li><li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx.">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li><li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm.">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li><li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases.">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li><li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells.">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+surface+layer.">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li><li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force.">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li><li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema.">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li><li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity.">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li><li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules,+Erythrocytes,+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries.">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々は、2層モデルと内皮壁と血液中を循環する白血球の相互作用をモデル化するためのヘルツ理論から算出した値を使用していました。我々は、10 PN荷重下50nmの直径を持つ白血球上の微絨毛は糖衣に約150nmをインデントすることを全体の厚さのほんの一部を計算した。これは、この実験で測定された特性を持つグリコカリックスは、細胞間相互作用に大きな障害となり、細胞は白血球の接着時に接着カスケードの間に克服しなければならない大きな立体障害であることを示しています。 モデルでは、等方性弾性構造として糖衣我々はおおよそ、ここで使用される。我々は、これはそうではありませんを示すために、任意の機械的測定に気づいていながら、何のグリコカリックスの分子構造についてはほとんど知られていないと、これはおそらく過剰な単純化であることを示唆している。実際には、グリコカリックスは複雑かつ多様である細胞の表面上の構造。それは指向分子構造から構成され、明確に定義された外側の境界を欠いている、と思わ細胞表面に近いより密になります。ここで使用される2つの層の弾性モデルは、細胞を循環させることによって、観測されたグリコカリックスの相対剛性への洞察を提供しつつ、今後の研究では、その可能性の異方性と厚さ方向の密度変化を考慮するかもしれない代替機械の説明を探ることができます。それはグリコカリックスは細胞表面の異なる領域で同じではないことも可能です。ここに提示されたすべてのデータは、原子核の周りをセルの中央領域に取られたので、これはセットに存在するデータから明らかではなかったであろう。 グリコカリックスはまた、この研究で調査されていなかった粘弾性特性を示すことができる。これは、静的な条件下では、毛細血管内の赤血球が完全にへwheres循環、糖衣を圧縮することができ、ことが観察されている赤血球は10ない。静的赤血球により発生する力は、（〜3月10日Pa）と非常に小さい可能性が高いです。これはグリコカリックスは遅い圧縮に対応して非常に柔らかいが、より高速な圧縮時にかなり硬めかもしれないことを示します。我々の測定は、循環セルが発生する可能性のある剛性をシミュレートするためには1μm/秒のインデントレートで実行されますが、さらに進行中である時間依存特性を調査するために仕事しました。 AFMのインデントはそのまま生きている細胞の内皮グリコカリックスの弾性率と厚さを測定するために使用されてきました。測定はグリコカリックスは細胞 - 細胞接触や接着に重要な障壁となる可能性が高いと炎症時に接着カスケードを調節する上で重要な要因となることを示している。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>マッコイミディアム</td><td>ギブコ</td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> Hyclone社</td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地</td><td> VEC Technologies社</td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td>プールしたヒト臍帯静脈内皮細胞</td><td> VEC Technologies社</td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td> JTベーカー</td><td> 9681から02 </td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> （3 - アミノプロピル）トリエトキシシラン</td><td>アルドリッチ</td><td> 440140-100ML </td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td> Cellgro </td><td> 25から054-C1 </td><td></td></tr><tr><td>ハンクス緩衝塩溶液</td><td>ギブコ</td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td>スルホ-NHS-LC-ビオチン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 21335 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavadinビーズ</td><td>ダイナ</td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td>アサイラムリサーチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チップレスカンチレバー</td><td>ナノワールド</td><td> ARROW-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td>シルエットのSD </td><td> Quickutz </td><td>シルエット-SD </td><td></td></tr><tr><td>シリコーンゴム</td><td>ストックウェルElastomerics </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30mlのシリンジ</TD&gt; <td>ベントンディッキンソン</td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 18ゲージの針</td><td>ベントンディッキンソン</td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td>拡張セット</td><td>ホスピーラ</td><td> 4429から48 </td><td></td></tr><tr><td> 4方弁</td><td> Teleflexは</td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td>男性/女性ポートキャップ</td><td>スミスの医療</td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>ワトソン·マーロー</td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td>蠕動チューブ</td><td>ワトソン·マーロー</td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td>滅菌フィルター</td><td>ポールライフサイエンス</td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy

白血球と白血球キャプチャ時の血管壁の相互作用についての我々の理解は、内皮表面層の機械的特性の不完全な理解によってのみ制限されます。それは、白血球上の接着分子が表面トポグラフィー3に対して不均一に分布していることが知られており、その地形が他の表面9に接着結合の形成を制限し、その生理的な接触力（≈5.0 -微絨毛あたり10.0 PNが）と微絨毛を圧縮することができます対向面3,7に分子のアクセシビリティを増やし、彼らの休憩の長さの3分の少し。我々は2層構造と、比較的剛性の細胞体、プラス糖衣、腔面6に柔らかい保護糖コーティングなどの内皮を検討してください。それはグリコカリックスは内皮表面4への白血球の付着を低減するための障壁として作用し得ることが示されている。本稿では、内皮の機械剛性が結合形成に影響を与える可能性のある方法を理解する内皮表面の変形に対処するために開始されます。静置培養で増殖した内皮細胞は、堅牢な糖衣を発現しないが、生理的な流動条件下で培養した細胞は 、in vivo で観察された2近似糖衣し始める。内皮細胞体の弾性率は、約5〜20kPaで5であることが、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて測定されています。グリコカリックスの厚さや構造は電子顕微鏡8を使用して研究されており、グリコカリックスの弾性率は、間接的な方法を用いて近似されていますが、私たちの知る限りでは、生きた細胞で糖衣弾性率の直接測定は発表報告されていない。そこで本研究では、MAに彼らの糖衣式を最大化するための条件で培養した細胞上で小説AFMプローブで作られたインデントの実験を提示内皮グリコカリックスの弾性率と厚さのke直接測定。

典型的な実験では、20力片対距離曲線は近くで​​はなく、核（〜2μm以内）に、通常は核周辺領域で、セルの指定された領域から得られた。曲線は測定期間にわたって任意のサンプルのドリフトを考慮するために整列した後、図4に示すように、カンチレバーのノイズを除去するために平均化した。曲線を分析し、薄いポリマーフィルム1の弾性率と厚さを決定するために開発された2層モデルに適合させた。 25セルの曲線の発作から、我々は、内腔の層の弾性率は0.7±0.5 kPaであり、 図5に示すように、厚さは、380±50nmであることを決定した。細胞体の弾性率は、16±6 kPaです。これらの値は、細胞体と糖衣5,8の厚さの係数の前の測定値とよく一致している。 図1。私たちの細胞培養装置。室を横切る流れはCのセルにアサイラムAFMのためのクローズドセル皿の表面（アサイラム、サンタバーバラ、CAに磁石で開催されたクローズドチャンバーBでプレーティングした貯水池からの重力によるものであった）。 Bの三方弁は、私たちは流れを止めることができました。シリコーンガスケットは、流路高0.4ミリメートル、長19ミリメートル、幅6.4ミリメートルを作成しました。密閉チャンバーBは容易に除去とクローズドセルの皿は、実験用のAFMに直接移動されました。身長差Dは、リザーバCから蠕動ポンプ（図示せず）とに流体をポンピングすることによって維持された。アセンブリ全体は、細胞培養の期間インキュベーターに入れた。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50163/50163fig2.jpg" /> 図2左：2.4カンチレバーのイメージμmのビーズ（矢印）は、ビオチン - ストレプトアビジン結合によって接続されている。右：流れの下で成長したHUVECの単層。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50163/50163fig3.jpg" /> 図3。セルに距離δをインデント半径Rのビードとの相互作用の幾何学。緑色で示さグリコカリックスは、E GCと厚さt の弾性率を有する。細胞体は、弾性率E 細胞を持っています。セル、Fへのビードによって加えられた力を測定し、図4に示すように力対距離曲線が得られる。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50163/50163fig4.jpg" /> 図4：セルにインデントに対する平均力対距離曲線は赤でプロットされます。個々のインデントは挿入図に示されています。強調表示された<html>画像内の曲線の傾きは傾きが主に細胞の機能であるグリコカリックスの剛性、および細胞体によって支配されているカンチレバーが最初腔側表面に触れる接触点、管腔の層であり、ボディ弾性率を測定した。二層インデント理論から近似曲線は青色で示されており、弾性半空間のためのシンプルなヘルツモデルのフィットが黒い点線で示されている。二層フィットで4自由パラメータがありました。この特定の適合のために決定された値は次のとおりだった：細胞率= 15.9 kPaで、管腔の層係数= 0.33 kPaであり、内腔の層厚=​​ 420nmである。第四当てはめパラメータはグリコカリックスとの接触点である。細胞表面への相対的なx軸の原点の位置は任意です。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50163/50163fig4large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 10 &quot;のfo：コンテンツの幅=&quot; 5.5in &quot;のfo：SRC =&quot; /は &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50163/50163fig5.jpgに &quot;/ files/ftp_upload/50163/50163fig5highres.jpg&gt; 図5。曲線から25セルのプロパティのヒストグラムは収まる左：E GCは 0.7±0.5 kPaであることが決定された。右：グリコカリックスの厚さは380±50nmであることが決定された。

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Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

内皮グリコカリックスの機械的特性は、AFMカンチレバー上にミクロンサイズの球を使用して、インデントによって測定した。内皮細胞は糖衣発現を誘導する生理的な流動条件下でカスタム室で培養した。データはグリコカリックス厚さと弾性率を決定するために、薄膜モデルを用いて分析した。

原子間力顕微鏡と内皮グリコカリックスの機械的性質の定量化

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.2K ビュー.  University of Rochester. 内皮グリコカリックスの機械的特性は、AFMカンチレバー上にミクロンサイズの球を使用して、インデントによって測定した。内皮細胞は糖衣発現を誘導する生理的な流動条件下でカスタム室で培養した。データはグリコカリックス厚さと弾性率を決定するために、薄膜モデルを用いて分析した。

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Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

生物工学

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

原子間力顕微鏡カンチレバーを用いたナノインデンテーション:空気および流体中のナノスケールでの機械的特性測定

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

工学

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3. On the macro scale the stiffness of tissues and organs within the human body span several orders of magnitude4. Much less is known about how stiffness varies spatially within tissues, and what the scope and spatial scale of stiffness changes are in disease processes that result in tissue remodeling. To better understand how changes in matrix stiffness contribute to cellular physiology in health and disease, measurements of tissue stiffness obtained at a spatial scale relevant to resident cells are needed. This is particularly true for the lung, a highly compliant and elastic tissue in which matrix remodeling is a prominent feature in diseases such as asthma, emphysema, hypertension and fibrosis. To characterize the local mechanical environment of lung parenchyma at a spatial scale relevant to resident cells, we have developed methods to directly measure the local elastic properties of fresh murine lung tissue using atomic force microscopy (AFM) microindentation. With appropriate choice of AFM indentor, cantilever, and indentation depth, these methods allow measurements of local tissue shear modulus in parallel with phase contrast and fluorescence imaging of the region of interest. Systematic sampling of tissue strips provides maps of tissue mechanical properties that reveal local spatial variations in shear modulus. Correlations between mechanical properties and underlying anatomical and pathological features illustrate how stiffness varies with matrix deposition in fibrosis. These methods can be extended to other soft tissues and disease processes to reveal how local tissue mechanical properties vary across space and disease progression.

The stiffness of the extracellular matrix strongly influences multiple behaviors of adherent cells. Matrix stiffness varies spatially throughout a tissue, and undergoes modification in various disease conditions. Here we develop methods to characterize spatial variations in stiffness in normal and fibrotic mouse lung tissue using atomic force microscopy microindentation.

原子間力顕微鏡を用いた肺組織のマイクロメカニカル特性

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

生物学

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

免疫学的単一細胞力分光法のための単一T細胞または単一粒子による原子間力顕微鏡片持ちの機能化

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

免疫・感染学

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft biomaterials and cells. This approach has gained a central role in the fields of mechanobiology, biomaterials design&#160;and tissue engineering, to obtain a proper mechanical characterization of soft materials with a resolution comparable to the size of single cells (&#956;m). The most popular strategy to acquire such experimental data is to employ an atomic force microscope (AFM); while this instrument offers an unprecedented resolution in force (down to pN) and space (sub-nm), its usability is often limited by its complexity that prevents routine measurements of integral indicators of mechanical properties, such as Young&#39;s Modulus (E). A new generation of nanoindenters, such as those based on optical fiber sensing technology, has recently gained popularity for its ease of integration while allowing to apply sub-nN forces with &#181;m spatial resolution, therefore being suitable to probe local mechanical properties of hydrogels and cells.
In this protocol, a step-by-step guide detailing the experimental procedure to acquire nanoindentation data on hydrogels and cells using a commercially available ferrule-top optical fiber sensing nanoindenter is presented. Whereas some steps are specific to the instrument used herein, the proposed protocol can be taken as a guide for other nanoindentation devices, granted some steps are adapted according to the manufacturer&#39;s guidelines. Further, a new open-source Python software equipped with a user-friendly graphical user interface for the analysis of nanoindentation data is presented, which allows for screening of incorrectly acquired curves, data filtering, computation of the contact point through different numerical procedures, the conventional computation of E, as well as a more advanced analysis particularly suited for single-cell nanoindentation data.

The protocol presents a complete workflow for soft material nanoindentation experiments, including hydrogels and cells. First, the experimental steps to acquire force spectroscopy data are detailed; then, the analysis of such data is detailed through a newly developed open-source Python software, which is free to download from GitHub.

ソフトマターナノインデンテーションの実験・データ解析ワークフロー

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...

Extracting the Young's Modulus of Native Murine Pulmonary Basement Membranes from Atomic Force Microscopy Derived Force Maps

Atomic force microscopy (AFM) allows the characterization of the mechanical properties of a sample with a spatial resolution of several tens of nanometers. Because mammalian cells sense and react to the mechanics of their immediate microenvironment, the characterization of biomechanical properties of tissues with high spatial resolution is crucial for understanding various developmental, homeostatic, and pathological processes. The basement membrane (BM), a roughly 100 - 400 nm thin extracellular matrix (ECM) substructure, plays a significant role in tumor progression and metastasis formation. Although determining Young&#39;s modulus of such a thin ECM substructure is challenging, biomechanical data of the BM provides fundamental new insights into how the BM affects cell behavior and, in addition, offers valuable diagnostic potential. Here, we present a visualized protocol for assessing BM mechanics in murine lung tissue, which is one of the major organs prone to metastasis. We describe an efficient workflow for determining the Young&#39;s modulus of the BM, which is located between the endothelial and epithelial cell layers in lung tissue. The step-by-step instructions comprise murine lung tissue freezing, cryosectioning, and AFM force-map recording on tissue sections. Additionally, we provide a semi-automatic data analysis procedure using the CANTER Processing Toolbox, an in-house developed user-friendly AFM data analysis software. This tool enables automatic loading of recorded force maps, conversion of force versus piezo-extension curves to force versus indentation curves, computation of Young&#39;s moduli, and generation of Young&#39;s modulus maps. Finally, it shows how to determine and isolate Young&#39;s modulus values derived from the pulmonary BM through the use of a spatial filtering tool.

This protocol visualizes how to prepare cryosections of murine lung tissue, perform atomic force microscopy force map experiments, and analyze the data to determine Young's modulus of the native murine pulmonary basement membrane.

原子間力顕微鏡から得られたフォースマップからのネイティブマウス肺基底膜のヤング率の抽出

Atomic force microscopy (AFM) allows the characterization of the mechanical properties of a sample with a spatial resolution of several tens of ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

内皮細胞接着性の定量<em&gt;インビトロ</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

の剛性を測定します<em&gt; ex vivoで</em原子間力顕微鏡を使用&gt;マウス大動脈

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

マウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの硬さの測定

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

Retinal capillary degeneration is a clinical hallmark of the early stages of diabetic retinopathy (DR). Our recent studies have revealed that diabetes-induced retinal capillary stiffening plays a crucial and previously unrecognized causal role in inflammation-mediated degeneration of retinal capillaries. The increase in retinal capillary stiffness results from the overexpression of lysyl oxidase, an enzyme that crosslinks and stiffens the subendothelial matrix. Since tackling DR at the early stage is expected to prevent or slow down DR progression and associated vision loss, subendothelial matrix, and capillary stiffness represent relevant and novel therapeutic targets for early DR management. Further, direct measurement of retinal capillary stiffness can serve as a crucial preclinical validation step for the development of new imaging techniques for non-invasive assessment of retinal capillary stiffness in animal and human subjects. With this view in mind, we here provide a detailed protocol for the isolation and stiffness measurement of mouse retinal capillaries and subendothelial matrix using atomic force microscopy.

著者スポットライト:早期糖尿病性網膜症における血管の硬直と炎症の調査

We recently identified retinal capillary stiffening as a new paradigm for retinal dysfunction associated with diabetes. This protocol elaborates the steps for isolation of mouse retinal capillaries and the subendothelial matrix from retinal endothelial cultures, followed by a description of the stiffness measurement technique using atomic force microscopy.

原子間力顕微鏡と内皮グリコカリックスの機械的性質の定量化

要約

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