この作品は、NHLBIからRWへの助成金によってサポートされていました。

1。パワータワーセットアップと操作<ol><li>パワータワーは、テーブルにクランプされ合板の長方形の部分に配置されます。グレインジャーから4.5回転ギアモータは、4つの2 &quot;X6&quot;ボードと1¾インチの合板の上にかかっている。スイッチのオン/オフモーター、AC / DCの速度制御、ヒューズ、接合ボックスに一緒に配線されています。 </li><li>モーターを冷却するために、直径の穴3インチは、合板の縦方向の½インチ片にカットされます。一方の側に、3インチのファンは合板に取り付けられており、他方では、3インチ径の金属シリンダーが取り付けられている。 </li><li>端に取り付けられたローラーを使用したカスタムメイドの回転アームは、モータに接続されています。モータと接続されたアームがドアのヒンジの合板に取り付けられている曲がった¾インチ角チューブの株式の片側を押し下げ、時計回り方向に回転します。ホイールは、それがdirはプラットフォームに対してロールバックを可能にするために、プラットフォーム下にチューブ株式の上面に取り付けられているectlyその上。 </li><li>腕は、チューブの在庫の一方の端にプッシュダウンすると2つのレベルのプラットフォーム（図1D）を引き上げ、もう一方の端を持ち上げる。アームのローラーがチューブの株式をクリアしたときには、アーム（図1F）バックダウンプラットフォームをドロップし、開始位置に戻ることができます。 </li><li>プラットフォームでは、合板の上に配置し、ネジの目にフックされているバンジーコードによって保護されているラックで構成されています。プラットフォームには、括弧で合板に取り付けられている引き出しのスライダに沿ってスライドさせ、ダウンします。 </li><li>バイアルは、ラックに入れ、バンジーコードのある場所に保持されている正方形のグリッド画面で保護されています。 </li><li>発泡スチロールのクッションは、ドロップの衝撃を弱めるためのプラットフォームの下に配置されます。 </li><li>モータの電源が完全に回転周期が15秒の長さになるように調整されます。 </li></ol> 2。運動プロトコル<ol><li>ハエは50％の湿度と12時間の明/ DAを使用して、25℃インキュベーターに収容されていますRKサイクル。運動トレーニングと運動能力の評価の両方を25°C恒温室で行われます。 </li><li>ハエは、それぞれ他の1〜2日以内に収集し、年齢をマッチさせています。 240ハエの最小値は、耐久性と負の走地性（クライミング）能力、運動トレーニングの効果を反映する2つの生理学的指標の長手方向のモニタリングが必要となります。長手方向の監視は、コホート間の変化から交絡影響を与えることなく、各コホートの開始値に対して相対的に誘導される変化の分離を可能にします。必要に応じて追加の実験のためにハエを収集する必要があります。 </li><li>コレクションした後、ハ​​エが行使されることはありません運動療法、および120のコントロールハエに供される120実験的なハエ、に分かれています。ハエは20ハエ、それぞれのバイアルに格納されています。実験的なハエのバイアルは、しっかりとしたセルロースアセテートFlugsとコントロールのバイアル（未行使）と接続されているハエは​​柔らかいSPOと接続されているパワータワーの間にハエを固定するためにプッシュダウンすることができゲイン誤差ストッパー。その適応サイズがバイアルの底の近くに簡単に配置することができますので、スポンジを固定化するために使用されます。柔らかいスポンジの材料はまた、より強固なFlugsによる傷害を減らすことができます。 </li><li>パワータワーのハエは、空のバイアル中に行使されたハエより柔らかい着陸でそれらを提供する食品を5 mLを含むバイアルに格納され、行使されています。我々はトレーニングセッションの途中で頻繁に食べるハエを観察していないものの、食品は、通常、10％ショ糖、10％の酵母、水に2％の寒天で構成されています。空のバイアルは、トレーニング中に使用されている場合は、負傷ハエの割合は劇的に増加されています。 </li><li>パワータワーは25℃に維持される温度制御室℃で運営されてい実験的なハエは、パワータワーの上に置き、登るために作られています。制御ハエもパワータワーに置かれますが、スポンジのストッパーがpusheあるさバイアルハエより約3ミリメートルの動きを制限するためにDにダウンします。このグループは、運動とは無関係であるパワー·タワーのいずれかの効果のコントロールとして機能します。いくつかの部屋はまだ操作にこれらのハエのために存在していますが、我々は繰り返しこれらの条件下でのハエはほとんど実行して行使する生理反応を示さないことを観察した。また、すべてにおいてパワー·タワー上に配置されていない追加の対照群を含めることが望ましいかもしれません。 </li><li>ハエは、ランプのスケジュール（図2）を利用して、それぞれの週5日間連続を行使しています。週1の間にハエは、セッションごとに3時間のセッションごとに2時間、セッションあたり2.5時間週2、週3のために行使されています。他のレジメンがテストされているが、このプロトコルは、遺伝子間や分岐条件の下で一貫性のある結果を生成します。このプロトコルは、しかし、特定の実験に合わせて可能性のあるバリエーションの広い配列に従うものとします。 </li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 3。運動と自発運動疲労<ol><li>持久運動時の疲労までの時間が与えられたコホートの運動能力を確認し、および/または定量するための有用な生理的な指標である。疲労のアッセイは、トレーニング実験に使用されるコホートで長手方向に実行することができます。アッセイは、トレーニングプロトコル、または両方が完了した後、トレーニング前にどちらかを行ってもよい。訓練中に増分進行状況をグラフ化が必要な場合は他の中間時点を追加することができます。疲労アッセイはまた、食事の変化（図3B）としてのトレーニングプロトコル以外の治療への応答として、運動の持久力を測定するために使用することができます。 </li><li>訓練が行われていない場合に疲労のアッセイは、日に実施されるべきである。実験と制御の両方のハエは、20のそれぞれのバイアルにパワータワーの上に置き、疲労まで登るに作られています。疲労はある登山と負の走地性の刺激に応答するための障害として認識されているhavior。疲労の動作が目視により採点される。 </li><li> 5またはより少ないハエは4つの連続した​​ドロップの2インチよりも高い上昇することができたときにハエのバイアルは、 &quot;疲れた&quot;と見なされます。それはまだ動作している間に疲れたバイアルは、パワータワーから削除され、除去の時間が記録されます。除去の時間は、ネストされたヒストグラムとして、または &quot;タイム·トゥ·失敗&quot;としてプロットすることができます。 &quot;タイム·トゥ·失敗&quot;のプロットは、図3Bに示されるようにデータの例としては、プロットされます。 </li><li>バイアルは10時間（図3B）の最大10分間隔で監視されています。 </li></ol> 4。運動、年齢、自発運動能力<ol><li>このトレーニングプロトコルが誘導される実行挙動に依存しているので、トレーニングの効果を定量化するための主要なアッセイは、長手方向にトレーニング中の平均走行速度の変化を測定することである。訓練の過程で、行使し、未行使のハエ120オンザフライコホートは、負の走地性のへの応答のために毎日テストされていますtimulus。リング技術は、ガルガーノらで説明しています。 （2005）は、ハエのクライミング能力12を測定するために使用されています。簡単に言えば、この手法は、負の走地性の誘導の後に定義された時間の間にハエのバイアル増の平均身長を測定します。定義された時間の間に登った高さは、速度を登ると同等です。測定は、一日の実行後に疲労から合併症を避けるように毎日の訓練のためにマシン上でハエを配置する前に実行されます。 </li><li>当社の標準プロトコルでは、ハエは三週間の合計で行使されたと登山能力は、5週間の合計を検討されています（図2）演習の中止後、運動トレーニングと2週間の間に三週間。これは、実験者はモビリティに対する運動の効果は、プログラムの停止後も持続するかどうかをグラフ化することができます。 </li><li>各コホートの毎日のRINGの性能つの写真が能力を登るの分析のために使用されています。シックス·バイアルは、それぞれの写真に含まれています。負のグラムeotaxisが誘導され、時限カメラを使用して、写真が定義した秒数後に撮影されます。これは実験条件に応じて変化させることができますが、我々は通常、2秒を使用しています。すべての写真については、各バイアルは同じ高さの4つの象限に分割され、画像処理ソフトウェアは、各々がそれが割り当てられた期間内に到達象限に基づいてスコアを飛ぶ割り当てるために使用されます。一番上の象限は、4のスコアを受け取るために登るハエは、次の最高の象限に飛ぶ3を受け取り、2番目に高い受信象限に飛んで、最低の象限にハエが1を受け取ります。すべての下部から上昇しませんハエが0のスコアを与えられている。 </li><li>与えられた写真の各バイアルについては、 &quot;登山インデックス&quot;はそのバイアル内のすべてのハエのスコアを平均することにより生成されます。 4の写真から各バイアルの指標は、その日の最終的な登山のインデックスを与えるために平均化されます。 </li><li>すべての負の走地性実験は、長手を実施していますdinally。結果は、能力を登山にコホートの変動の影響を軽減し、運動トレーニングの結果として、コホートの登山能力の相対的な長手方向の変化を強調するために初期の &quot;事前運動&quot;得点に正規化されます。最初のスコアは、最初の3日間の登山の指標の平均値によって決定され、1の値が割り当てられています。その後の試験は、初期インデックスのパーセンテージとして表されている。 </li></ol> 5。代表的な結果野生型のハエは、年齢の5週間（図3A）の向こう側に長手方向のリングアッセイに反映されているように、研修終了後の持続する能力を登山に減少した加齢に伴う減少と耐久性プロトコルに対応しています。負の走地性で、この遅延の減少は、野生型の運動応答が正常に行われていることを保証するために、ポジティブコントロールとして使用できる標準的な表現型の応答です。このデータセットは方法の例として提示されパワータワープログラムによる運動の誘導は、行動の入力として使用することができます。この効果を調節するための様々な遺伝的または環境的要因の能力は、その後、評価することができます。 逆に、パワー·タワーは、さまざまな実験的なデザインで出力として使用することができます。たとえば、遺伝子型、食事、またはその他の条件を変化させることができます。その後、運動生理学上でこれらの変動の影響は、パワータワーを使用してテストすることができます。ここでは、このアプローチの例を示します。ときに彼らの食事中のスクロースのさまざまな割合で飛んでは、増加持久力（図3B）と相関して疲労、増加したショ糖含有量までの時間を試験した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3786/3786fig1.jpg" /> 図1。パワータワーの操作。それは曲がった角管と接触するまで、付属のローラー（AC）電動曲がったアームが時計回りに回転します（D、E）アームが持ち上げてハエのバイアルを積んでプラットフォームを引き起こして、曲がった角管を下にプッシュします。（F）腕のようにハエの一番下に戻すには、強制的にプラットフォームが戻って落ちるように許可されているチューブをクリアバイアル。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3786/3786fig2.jpg" /> 図2。運動プロトコルを提案した 。徐々に30分ごとに週単位で最初の2時間から運動の持続時間を増加させ3週間の長い傾斜のレジメンの下にそれぞれの週5日間の演習に加えられたトレーニングプロトコルにさらさ​​飛ぶ。標準分析では、前に疲労アッセイが含まれており、週〜5週1日から運動プログラムとリングアッセイを以下。すべてのアッセイは陰性対照として未行使のハエの数と同じ数の複製で実行されます。研究者によって決定された他の様々な生理学的または生化学的検査を行うことができる。 <img aLT = &quot;図3&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/3786/3786fig3.jpg&quot; /&gt; 図3。持久的運動は、モビリティの複数の側面を変更します。（a）リングアッセイは、男性のY 1 W 67C23コホートの単一ペアでの年齢を越えて縦方向に実行されます。年齢をマッチさせ、遺伝的に同一行使し、未行使のコントロールハエは、平均上昇速度を毎日測定した。結果は、測定の最初の3日間にわたって平均登山の高さに正規化されている登山のインデックスで表現されています。運動訓練されたハエは、年齢（2ウェイANOVA、P &lt;0.005）全体の年齢をマッチさせた未行使の兄弟に比べ負の走地性能力の低下、年齢関連の低下を表示します。 （B）年齢をマッチさせた女性のカントンSハエで8時間行った疲労のアッセイは、疲労（ログランク、P &lt;0.0001）までの時間に食事ショ糖含有量の有意な効果を示しています。実験に先立って、ハエはいや10％重量/容量で、酵母/スクロース/アガー飼料を与えたセント濃度、食事ショ糖の変化割合。 20ハエ各五バイアルは、各食事のためにテストされています。グラフは、まだ与えられた時点で5以上のハエを実行しているどのように多くのバイアルに表示されます。これらの結果は、5人未満のハエは負の走地性刺激に応答し続ける時間のポイントとして定義されているバイアルの &quot;失敗&quot;と、生存（または失敗になるまでの時間）曲線として統計的に、グラフィカルに扱うことができます。他の多くの可能性の研究デザインと統計的治療が可能であり、データ処理と測定は、個々の目的に合わせて調整する必要があることに注意してください。

<ol>
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私は、開示することは何もありません。

ここで紹介する一般的なプロトコルでは、トレーニング後の生理作用を文書化することに成功してきました。しかし、このプロトコルにはいくつかの領域が特定の実験のニーズに合わせて変更の対象となります。必要に応じて、例えば、発作のトレーニングや数の長さは潜在的に、プログラムが多かれ少なかれ困難なように変えることができます。負の走地性の能力が測定されるコンテナの高さは文書化されるように改善のための利用できる領域を増やすように変更することができます。スピード登山の定量を自動化するさまざまな方法でも適用可能である。原理的には、背景からハエを区別することができる任意のソフトウェアプログラムは、データ収集プロセスを高速化するために使用することができます。 プロトコルのいくつかの側面は、しかし、慎重でのみ変更する必要があります。たとえば、予備実験を強く週の残りの少なくとも一日が大きく表示回数を容易にする傾向があることを示している執拗な毎日の運動よりovement。さらに、概日リズムと温度は冷血動物の動きに影響を及ぼすことが知られています。訓練が行われた日の時間は、概日リズムの交絡影響の可能性を避けるために、変化することができますが、常に比較の下に特定のグループ内で一貫している必要があります。温度制御も不可欠であり、我々は家の運動器具に一定の温度で、専用の部屋をお勧めします。最後に、雄と雌が運動能力の出生や性別の違いの交絡影響の可能性を避けるために、別々に飼育して測定する必要があります。 この方法の潜在的なアプリケーションは、研究者の想像力によって制限されます。予備研究では、3つの広範なアプリケーションでこの方法を利用してきた。 <ol><li>年齢を越え、野生型の生物学のさまざまな側面に関する持久力運動の効果を測定します。 </li><li> T特定の変異体の表現型上の持久的運動の効果を測定するO。 </li><li>運動の利点を実行するために必要な遺伝的要因のために画面に</li></ol>これらの各アプリケーションは、特定の可能性は多種多様を網羅しています。我々の予備的経験に基づいて、変異体の表現型は、食事によって変わるできるだけ運動レベルに応じて変化する傾向があります。良い食事、運動、老化生理の間の関係を理解するために無脊椎動物モデルの使用は、おそらく、このプロトコルの中で最も重要な一般的なアプリケーションです。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>デイトンギヤモータ</td><td>グレンジャー</td><td> 1LRA6A </td><td></td></tr><tr><td> Raco電気ボックス</td><td>グレンジャー</td><td> 5A052 </td><td></td></tr><tr><td> Racoカバー</td><td>グレンジャー</td><td> 5A053 </td><td></td></tr><tr><td>クーパー過電流ヒューズ</td><td>グレンジャー</td><td> 6F043 </td><td></td></tr><tr><td>クーパー過電流ヒューズホルダ</td><td>グレンジャー</td><td> 1DD33 </td><td></td></tr><tr><td>カーリングテクノロジーズスイッチ</td><td>グレンジャー</td><td> 2X464 </td><td></td></tr><tr><td>デイトンコントロール、AC / DCスピード</td><td>グレンジャー</td><td> 4X796 </td><td&gt; </td></tr><tr><td>狭プラスチックバイアル用Flugs </td><td>ジェネシー科学</td><td> 49から102 </td><td></td></tr></tbody></table>

endurance training protocol and longitudinal performance assays for drosophila melanogaster

現代医学の研究者が直面する最も差し迫った問題の一つは、糖尿病と1-3心血管疾患などの関連疾患の結果として増加し、肥満の急増レベルです。これらの関連する健康上の問題への研究の重要なトピックでは、有益な介入として持久的運動の役割が​​含まれます。 運動トレーニングは、過剰な体脂肪4の減少など、いくつかの有益な結果、安価な、非侵襲的な介入である抗炎症作用と抗酸化反応6、心筋7で改良された収縮能力を増加させ、骨格筋5にインスリン感受性を増加させた。低強度の運動は重要な中間体9,10のように転写コアクチベーターPGC1-αで、人間8、マウスのミトコンドリア活性と生合成を増加させることが知られています。 アンデスピTEは、いくつかの重要な加齢に伴う病気との闘いのためのツールと​​しての運動の重要性、広範な長手方向の遺伝学的研究は、短命の遺伝的モデル種の持久力トレーニングプロトコルの不足によって妨げられてきた。 ショウジョウバエで使用可能な遺伝子の様々なツールの組み合わせは、その寿 ​​命が短いと安価なメンテナンスと、それはこれらの遺伝的メカニズムのさらなる研究のための魅力的なモデルを確認します。このことを念頭に置いて我々は、大規模なキイロショウジョウバエの 11の運動トレーニングのためのパワー·タワーと呼ばれる新規な装置を開発しました。パワータワーは繰り返し急速な登山を誘導するためのハエの本能的な負の走地性の動作を利用しています。その後たびにマシンリフト、滴、ハエのプラットフォームは、ハエを登るように誘導されています。ハエは限りマシンが動作中か、彼らはあまりにも応答するために疲労になるまでであるように応答し続けています。したがって、研究者は、sを提供するためにこのマシンを使用することができます年齢をマッチさせたと遺伝的に同一のハエの大量へimultaneousトレーニング。さらに、我々はトレーニング中にハエのコホートの長手方向の進行状況を追跡するために有用な、関連するアッセイを説明します。

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Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

我々は、重要な遺伝的モデル生物種の最初の持久力トレーニングのプロトコルについて説明します。<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;、およびモビリティは、次の訓練の改善をグラフ化していくつかのアッセイを概説します。

キイロショウジョウバエのための持久力トレーニングのプロトコルと縦パフォーマンスアッセイ

One of the most pressing problems facing modern medical researchers is the surging levels of obesity, with the consequent increase in associated disorders ...

endurance-training-protocol-longitudinal-performance-assays-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

15.5K ビュー.  University of Michigan Medical School. 我々は、重要な遺伝的モデル生物種の最初の持久力トレーニングのプロトコルについて説明します。キイロショウジョウバエ、およびモビリティは、次の訓練の改善をグラフ化していくつかのアッセイを概説します。

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Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

成虫（A. gambiae）におけるRNAiのアッセイのためのプロトコル

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

生物学

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

アダルトキイロショウジョウバエのロコモーションの高解像度のビデオトラッキング

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

のてんかんの変異体における発作のためのアッセイをNeurocircuitショウジョウバエ</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

に有糸分裂研究のためのマイクロインジェクション技術キイロショウジョウバエ合胞体胚

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

幼虫のモニタリングの心機能キイロショウジョウバエ生理学的研究のための

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

の分離キイロショウジョウバエ精巣

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

における寿命の測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

のメンテナンス<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;人口ケージ

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.