著者らは、マイクロインジェクション、だけでなく、匿名のレビュアーからの洞察に満ちたコメントで支援するためのRJサマー＆X王に非常に感謝しています。この作品は、NIHの助成金SC2GM089602によってサポートされています。

1。トランスジェネシス：DNA調製<ol><li>支配的なコインジェクションマーカー：pRL3 [PPA - PRL - 1（tu92）] pRL3プラスミドは、視覚的に成功した形質転換事象を識別するための支配的なコインジェクションマーカーです。このプラスミドは、密接にCでSQT - 1コラーゲン遺伝子に関連するPPA - PRL - 1遺伝子の優性突然変異体対立遺伝子（tu92）をコードする虫やワームの本体軸1,5に沿って時計回りにねじる運動に野生型正弦波運動に変換します。形質転換動物は、C言語で使用されるポピュラーな優性選択マーカーROL - 6（su1006）と非常に似ています過去20年間のエレガンス 。 </li><li>ターゲットレポーター遺伝子：PPA - EGL - 4P：：GFP 目的の遺伝子をシーケンス9をコードするGFPに、転写または翻訳後リンクすることができます。本研究では、PPA - EGL - 4promoter：：GFP（EGL - 4、cGMPの依存性プロテインキナーゼ）は使用いた上流に翻訳開始の2 kbのフラグメントは、P.でGFPの発現を付与することができるかどうかを判断するには、d pacificus PS312。このGFPベクターは、変更されたとのGFPコード領域を含んでいます イントロンと親切にXiaoyue王とラルフJ.ゾマー（マックスプランク研究所、チュービンゲン、ドイツ、EU）が提供する多目的PPA - RPL - 23の3&#39;UTRターミネーター5。 </li><li>ゲノムDNA：PS312 野生型P.の追加pacificus PS312のゲノムDNAは、特にそれらのF 2後代〜5トランスジェニックF 1動物から、安定した導入遺伝子の継承を取得する必要があります。で安定したF 2トランスジェニック系統で観察されたものに似て：ゲノムDNA二つ導入遺伝子（GFPレポーター：共射出マーカーPRL - 3とPPA - EGL - 4P）との複合体の余分な染色体の配列を形成する場合、それはまだ定かではないC.エレガンス 3。しかし、要件が同一のcohesiを共有するためにゲノムDNAと導入遺伝子を持っているためオーバーハングをVEは強く宿主細胞は、適切なDNAの伝達（gDNAをシグマG1N10キットを用いて調製した）のために認識できる複雑な染色体外配列の形成を示唆している。 </li><li> DNA消化 ：GFPベクターDNAと共射出マーカーpRL3とPS312 gDNAのと互換性のある粘着性がオーバーハングを生成する：制限酵素は、PPA - EGL - 4Pを線形化するために使用されます。ボルテックスではない、タップして混ぜる。 37℃で一時間インキュベート℃に</li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> pRL3 </td><td> 4μgの</td></tr><tr><td> 10xbuffer </td><td> 10μlの</td></tr><tr><td>をPstI（10 U /μL） </td><td> 4μlの</td></tr><tr><td>のdH 2 O </td><td> 〜 </td></tr><tr><td> 合計： </td><td> 100μL </td></tr><tr><td> PPA - EGL - 4P：：GFP </td><td> 4μgの</td></tr><tr><td> 10倍のバッファ</td><td> 10μlの</td></tr><tr><td>をSalI（10 U /μL） </td><td> 4μlの</td></tr><tr><td>のdH 2 O </td><td> 〜 </td></tr><tr><td> 合計： </td><td> 100μlの </td></tr><tr><td> gDNAをPS312 </td><td> 10μgの</td></tr><tr><td> 10倍のバッファ</td><td> 10μlの</td></tr><tr><td> pstファイルIおよびSal I（10 U /μL） </td><td> μlの8 </td></tr><tr><td>のdH 2 O </td><td> 〜 </td></tr><tr><td> 合計： </td><td> 100μlの</td></tr></tbody></table> 表1。制限酵素消化のための混合物。 <ol start="5"><li> DNAの沈殿と準備<ol><li>消化産物の1:10〜酢酸ナトリウム（3 M NaCOOCH 3液（pH5.2））と2.5倍の100％エタノールの量を追加し、ペレットを見やすくするためにグリコーゲンの20 ng /μLのを追加。 </li><li> 4℃で15分間14,000 rpmで遠心する℃、 </li><li> tippiによって上清をデカントゆっくりとngの遠心分離管逆さにしてから、ティッシュペーパーで、それをタップすると、ペレットがチューブの底隅に安全であることを確認し、エタノールの自由意思。 </li><li> 75％エタノール1 mlを追加します。 </li><li>すぐに4℃で5分間、14,000 rpmでスピン℃、 </li><li>ゆっくりと上下逆に遠沈管を転倒し、ペレットがチューブの底の隅に固定していることを確認し、エタノールの自由な意思ティッシュペーパーで、それをタップして上清をデカントします。 </li><li> 25から30で5分間14,000 rpmで真空遠心分離で乾燥ペレット° C、乾燥してエタノールの完全にフリーになるまで。 </li><li> TEまたは滅菌のdH 2 Oを30μlを加え、℃で混合簡単に前にボルテックスで4℃で一晩おきます。 </li><li>表2は、注射のための各精製したDNAから注入混合物を作成する方法について説明します。 </li><li> -20℃で保存注射用混合物を融解後、かもしれない破片の粒子を取り除くために5分間14,000 rpmでチューブをスピンダウン注射針を詰まらせる。 </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 遺伝物質 </td><td> 濃度 </td></tr><tr><td> PPA - EGL - 4P：：GFP（SalIで） </td><td> &gt; 5 ng /μlに（0.1-10ng/μl） </td></tr><tr><td> pRL3（PstIで） </td><td> &gt;は1 ng /μL </td></tr><tr><td> gDNAをPS312（PstIで+をSalI） </td><td> &gt; 60 ng /μLの</td></tr><tr><td>のdH 2 O </td><td> 〜 </td></tr><tr><td> 合計： </td><td> 30μlの </td></tr></tbody></table> 表2。PPA - PRL - 1注射混合物 2。 RNA干渉：in vitroで二本鎖RNAの合成で <ol><li>目的の遺伝子を増幅するPCRを使用してください。 RHL091 5&#39; - agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC - 3&#39;（BamHI部位）とRHL092 5&#39; - tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG - 3&#39;（PstIサイト）は、464 bpのゲノム断片を増幅したPPA - PRL - 1（tu92）対立遺伝子を含むpRL3ベクトルからメンター（位置3から466まで）。 </li><li> BamHIおよびPstIでPCR産物を消化。 </li><li>をBamHI / PstIで消化pL4440 RNAiの給餌ベクトル2への断片をライゲーションする。 </li><li>コンピテント細胞に挿入されたベクトルを変換し、アンピシリンLB培地プレート（50μg/ mlの）上に成長する。 </li><li> T7プライマーを用いたPCRにより、正常に挿入ベクトルを選択してください。 </li><li> BLOCK - ITのRNAi合成キット（Invitrogen）を用いて）二本鎖RNA二本鎖RNAを作るためにPRL - 1遺伝子を含むPCR産物を両側にT7を使用してください。 </li><li> &gt; 200 NG /注射用溶液、最大1μg/μLの場合dsRNAの濃度は最高です。 </li><li> -20℃で保存注射用混合物を融解後、注射針を詰まらせることができる破片の粒子を除去するために5分間14,000 rpmでチューブをスピンダウン。 </li></ol> 3。マイクロインジェクション：導入遺伝子および/またはdsRNAの注射のためのプロトコル<ol><li>注射針<ol><li>温度：ナリシゲ針プラーを（PC - 10モデル＃）に設定します： <ol><li>に底のつまみを回して、&quot;第2のヒーター。&quot; </li><li> &quot;第2のヒータAdjを。&quot;回しパネルまでのノブは様々な長さのテーパー針の先端のための55.0から60.0 ° Cを読み取ります。 </li></ol></li><li> （一度に針を引っ張る）&quot;ステップ1&quot;に戻って一番下のノブを回します。 </li><li>チャンバー内に針をロードし、それが安全であることを確認してください。 </li><li> &quot;スタート&quot;ボタン（赤いボタン）を押すと針はすべての重み（これは反対方向に2つの同一の針を作成してください）​​でプルアップすることができます。 </li><li>針に蓄積からほこりを防ぐためにプレードウによって所定の位置に固定プラスチック培養プレートでチャンバーとストアからニードルを取り外します。 </li></ol></li><li>取付パッド<ol><li> 1.5 mlの遠心管に、H 2 O 1ml中にNoble寒天の0.02 gを追加して2％ノーブル寒天溶液を作る寒天は、4 °年度までのCで保存することができる。 </li><li>完全に混和し、&gt; 88℃に設定したヒートブロックに寒天を溶かす</li><li> 1 mlのマイクロピペットを用いて、スライドガラスの中央（フィッシャー、12 544 - F）に液体2パーセントNoble寒天のドロップを置きます。 </li><li>ドロップの上に別のスライドガラスを配置することで平らに。 </li><li>五スライドガラスの層があるまで&quot;ドロップステップを&quot;繰り返します。 </li><li>お互いからスライドガラスをスライドさせて、各ガラススライドを削除します。 </li><li> 70℃の真空オーブン中でスライドガラス上の寒天パッドを平らに乾かし℃で一晩に4時間（または室温で一晩）。 </li><li>将来使用するために複数の注入パッドとストアを行います。 </li></ol></li><li>雌雄同体の生殖腺へのマイクロインジェクション</li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig1.jpg" /> 図1。 P.の概略図pacificusの解剖学。明確な有核細胞は、雌の生殖細胞（卵母細胞）であり、灰色の網掛け部分は腸です。唯一の遠位前生殖腺が表示されますが、2つの遠位生殖腺が半ば体の近くに背側に互いに交差に気づく。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig2.jpg" /> 図2。マイクロインジェクションの画像。（A）注射針の先端が引っ張らキャピラリー部分の右端のラインにフォーカスされている。それでも鋭いポイントを保持しながら、軽くその辺に針の先端に触れることにより、針の先端が切断してください。 （B）上に針の挿入はちょうど、最初の注射のための腸内の曲率の上に生殖腺。 （C）底部に針の挿入はちょうど目の注射のための腸内の曲率の下に生殖腺。 <ol start="3"><li><ol><li>コントラストとDIC剪断設定は両性生殖腺を表示するための理想であることを確認してください。 </li><li>引っ張らキャピラリー針に注入混合物の1.0から2.0μlをロードする。 </li><li>マイクロインジェクションのマニピュレータに針を置き、窒素タンクの圧力計は理想的な条件（10〜20 psiに設定する必要があります。0.5から1秒間）。 </li><li>スライド（図2A）上に配置薄く引かキャピラリーチューブの端にわずかに触れて、針の先端を破る。 <ol><li>針ブレーカのスライド：プルオイルを一滴でスライドガラス上に配置キャピラリーの最薄部</li></ol></li><li>針が壊れているしたら（P. pacificusは彼らドライアウトする前に注射のために5分のウィンドウを持っていると死ぬ）パッドにあなたのワームを選んでいる間はアイドル位置に位置することができます。 </li><li> J4 -若い成虫のフルプレートを使用して、ちょうどOP50細菌の芝生内のすべてのワームをカバーするのに十分なパラフィン油を（重い）注ぐ。 </li><li>ワームを選択し、注入パッドの上に置きます。 </li><li>位置針と離れて針（図2B、2C）から外陰部の方向にワームの生殖腺、顕微鏡でのワームのガラススライドを置きます。 </li><li>顕微鏡の視野の位置に針を下ろします。 </li><li>同じ焦点面（図2B）のトップ生殖腺と針を合わせます。</li><li>注射の混合物にゆっくりとワームとポンプを突く、遠位端に向かって分離ooctyesが導入遺伝子またはdsRNAを配信を最適化するには成功した注射を（示すためには、注入時には、遠位に近くなるまで続けて生殖腺の拡大の波が見えるはずヒント）。 </li><li>下の生殖腺に注入し、注入を繰り返すように針の位置を、この生殖腺は、消化管の下にあるしかしながらので卵母細胞の広がりが見られるため、より困難に達成することである（図2C）されません。 </li><li>通常の探してこのワームは、注射後の成功注入を示し、損傷した生殖腺（外陰部から突き出たまたは体腔内ポップ）があってはならない。 </li><li>アイドル位置にニードルバックを置きます。 </li><li>ワームを救うために準備する。 </li><li>注入されたワームが配置されているパッドの上にM9バッファーの低下（0.5μl）を追加します。 </li><li>お好きなものをいくつかOP50バクテリアを使用して、OP50とワームに触れ、そしてそれは守らなければならない。 Weは口のピペットを使用しないでください。 </li><li> OP50の50μlのスポットを接種したプレートの上にワームを配置、2-4ワームはそのようなプレートに救出することができます。 </li></ol></li><li>遺伝子導入のためのポスト噴射ストレージ＆スクリーニング<ol><li> 20℃で注入したワーム（P 0）を格納° C〜4日間、卵を産むとF 1を成長する。 </li><li>選択された表現型（PPA - PRL - 1優性マーカーを発現しているローリング動物のための遺伝子導入、検索用画面へ）のため4日目の画面のワーム。 </li><li>単一の独立したF 1ピックアップ、秒&#39;25で新しいシードプレートとストアに観察された表現型との動物を° Cこの温度は、F 1から安定した線の形成を促進&quot; </li><li>独立したF 1行から単一のF 2。個々のF 2行は同じような導入遺伝子の伝達率を持っている。私たちはしばしば、変換F 1動物当たり&gt; 15 F 2行を取得します。 </li><li> 25℃で、その後の世代保存</li><html><li>各々のラインのために：ローラーの伝送速度は、通常、それゆえに、ターゲット遺伝子の発現レベルを（GFP：PPA - EGL - 4P）を決定するために、この時点で必要な、F 4世代後に一定のままである。 GFPの発現は、支配的なローラーの表現型の浸透の程度と相関しないことがあります。 </li></ol></li><li> RNAiの表現型のポスト噴射ストレージ＆スクリーニング<ol><li> 20℃で注入したワーム（P 0）を格納° C〜4日間F 1を置くと成長する。 </li><li>選択された表現型（RNAiノックダウン表現型をスクリーニングするために、標的遺伝子の活性の損失に関連する可能性がある浸透表現型を検索し、我々の場合におけるPPA - PRL - 1表現型の損失）のため4日目画面F 1のワーム。 </li><li>我々の経験では、非ローラーノックダウン表現型は、F 2の&gt; 97％が失われている。 </li></ol></li></ol> 4。代表的な結果： <html>遺伝子導入のp&quot;&gt; 1。結果<table border="1"><tbody><tr><td> セッション </td><td> 注入されたP 0 </td><td> F 1ローラー </td><td> ％トランスジェニックF 2 </td><td> F 2の後に平均％の透過 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 2 </td><td> （1行目）0％ （ライン2）13パーセント</td><td> NA 13パーセント± 10 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 40 </td><td> 1 * </td><td> （3行目）0％ </td><td> NA </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 0パーセント</td><td> NA </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> （4行目）0％ </td><td> NA </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0パーセント</td><td> NA </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> （5行目）26％ </td><td> 22パーセント± 10 </td></tr></tbody></table>クロスしなかったコンテンツ&quot;&gt; *男性ローラー、NA：該当なし ：GFP（サル私は消化）、pRL3（ローラー）（PST私は消化）、とgDNA PS312（PstIおよびSalIでの消化）：。PPA - EGL - 4Pと注入されたPS312の表3の結果。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig3.jpg" /> 図3（A）野生型（B、C）安定したF 4 pRL3、PPA - EGL - 4P：：ヘッドニューロンGFPの発現を示すGFPトランスジェニックライン。 2。 RNA干渉の結果<img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig4.jpg" /> 図4。 RNAが注入されたPRL - 1変異体では、&quot;ローリング&quot;運動の完全なノックダウンを示しています。（）PRL - 1ローラーの機能獲得型変異体tu92。 （B）PRL - 1変異体展示正常な野生型の姿勢や運動を&quot;ノックダウン&quot;。 （C）PRL - 1（下）もある長いB注入されたPRL - 1変異体（上部）よりody。 （D）注入PRL - 1（下）の長い体は野生型PS312（上）よりも長いもです。長い体の表現型は、CのROL - 5（SQT - 1）RNAiノックダウンが観察されたelegansの N2（データは示さず）。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> ロール </td><td> 非ロール </td></tr><tr><td> PRL - 1本鎖RNA（200 ng /μlに） </td><td> 13 </td><td> 21 </td></tr><tr><td> B PRL - 1本鎖RNA（ng /μLの1000） </td><td> 9 </td><td> 16 </td></tr><tr><td>の制御</td><td> 20 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> 表4。PPA - PRL - 1 dsRNAを注射のまとめ。 （A）[二本鎖RNA] = 200 ng /μlに、（B）[二本鎖RNA] = 1000 ng /μlに。 P =それぞれ200および1000 ng /μLの注入のための両側フィッシャーの正確確率検定、、、で0.0019と0.041。

<ol>
	<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongyloides+stercoralis:+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3'+UTR.">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li><li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus.">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pristionchus+pacificus:+a+well-rounded+nematode.">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li><li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition.">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li><li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution:+development,+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad.">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+Microinjection.">Transformation and Microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

P. pacificusの集団は、世界の様々なコガネムシの種と密接に関連して発見し、自由生活と寄生線虫の中間のモデル線虫であるされています。 P.の強さ新興モデル生物としてpacificus、公正な前進遺伝子スクリーニング（ すなわちだけでなく、以前にC.エレガンスを特徴とする候補遺伝子のための）6,10から分離された変異体の位置的なマッピングを促進し、その遺伝的および物理的地図の統合に横たわっていた。しかし、C. elegansの遺伝学的手法は、P.に容易に譲渡することはできません臓器の形態に大きな違い、プライマリーDNA配列だけでなく、外来DNAへの応答に起因するpacificus。私たちの本研究では、以前にSchlager ら 5によって説明する、安定したレポーター遺伝子を導入する方法と、RNAiにより、同じ支配的なローラーの変異体をノックダウンする方法を詳細に示しています。我々のプロトコルには、事前にKNを想定していませんCの遺伝子導入やRNAiのowledge エレガンス 。 この研究（〜2％）に示すようにF 1の変換率はP.のPRL - 1マーカーを使用して、以前の結果に匹敵するpacificus（2-10％）5、しかし、S.で発見率よりも小さい糞線虫 （3〜22パーセント）4。まだP.におけるトランスジェニック技術の向上のための多くの可能性があるpacificus。であっても一般的に使用されるROL - 6（su1006）Cの対立遺伝子に相同PRL - 1（tu92）支配的なローラーのマーカーを使用して虫、P.の遺伝子導入の有効性pacificusは、最初のCのために説明したものより大幅に少ないです。複数のトランスジェニックF 1子孫が専門家の手の中に注入された動物ごとに得ることができるのメロと同僚3で虫 。 P.の移動期の卵母細胞の（1）より低い番号：いくつかの要因がこの違いを説明することがありますpacificus女性の生殖細胞系列（AVE生殖腺あたり激怒1）8は、有糸分裂生殖細胞のより低い率はP.に減数分裂への移行を反映することがありますpacificusはCに比べエレガンス11。したがって、少数の卵母細胞は、それぞれの注射後のDNAを取るとRNAができます。 P.における両性あたり全体的に低いひなのサイズpacificus PS312（〜200）と比較してC. elegansの N2は（〜300）にも注入された動物あたりのトランスジェニックF 1の低い数字を悪化させることができる。 （2）F 2〜F 1から外来DNAの伝達のための注射ミックスにおけるゲノムDNAのための要件は、より強力な遺伝子サイレンシングのメカニズムはまた、P.に関与している可能性を示唆C.よりpacificusエレガンス 。それにもかかわらず、P. pacificus導入遺伝子の発現は、S.に見られる極端な遺伝子サイレンシングを受けていないようです導入遺伝子の発現がF 1動物4に制限されている糞線虫 。我々は現在、PPA - EGL - 4Pの発現を予想されています。：F 6匹のGFPライン。遺伝子導入の速度を改善する1つの簡単な方法は、ローラー共射出マーカー（ 線虫C. elegansにおけるpRF4の25〜50 ng /μLのに比べてpRL3の現在は1 ng /μL）の濃度を増加させることです。 RNAiと遺伝子導入による生物レベルでの遺伝子機能を操作する機能は、Cを高める技術の双子の柱です。他の多くのモデル生物上記のエレガンス 。我々は、現在の研究は大幅にP.を高めることを期待トランスジェネシスとRNAiのための簡単にアクセスできる指示を提供することにより、開発および行動の遺伝学研究のためのpacificusモデル 。

<table border="1"><tbody><tr><th>製品： </th><th>カタログ番号： </th><th>サプライヤー： </th></tr><tr><td> DMI3000インジェクション顕微鏡</td><td> DMI3000 </td><td>ライカ</td></tr><tr><td>マイクロインジェクターのマニピュレータ（ダイレクトドライブ） </td><td> Narashige BC - 3ボールジョイント</td><td> Tritech研究</td></tr><tr><td>ニードルプラー</td><td> Narashige PC - 10 </td><td> Tritech研究</td></tr><tr><td>マイクロインジェクター™全てのデジタルマルチ圧力システム</td><td> Narashige MINJ - D </td><td> Tritech研究</td></tr><tr><td> GeneElute™哺乳類のゲノムDNAミニプレップキット</td><td> G1N70 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td> pJetクローニングジェットキット</td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJETプラスミドミニプレップキット</td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> DNAクリーン＆コンセントレータ™ </td><td> D4005 </td><td> ZYMO研究</td></tr><tr><td> BLOCK - IT™RNAiのTOPO ®転写キット</td><td> K3500 - 01＆K3650 - 01 </td><td>インビトロジェン</td></tr><tr><td>ディフコ™寒天ノーブル</td><td> DF0142 - 15から2 </td><td>フィッシャーScientifi </td></tr><tr><td>顕微鏡のカバーガラス（1.5 - 0.16〜0.19ミリメートルの厚さ、サイズ：50 × 45ミリメートル） </td><td> 12から554 - F </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー（フィラメント） </td><td> 615000 </td><td> AMシステム</td></tr><tr><td>パラフィンオイル（ヘビー） </td><td> O122 - 1 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386 - 500 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td>のNa 2 HPO 4 </td><td> AC20651 - 5000 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td> NaClを</td><td> BP3581 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td> MgSO 4を </td><td> M80 - 500 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus

それは、RNA干渉と安定した遺伝子導入による遺伝子機能と発現解析-深さで、さらに、完全に配列のゲノムを取得し、特定の解剖学と生物の分子細胞生物学のために多くの種に限られている。ために新たなモデル生物にとってますます手頃な価格ですが、例えば、 線虫（Caenorhabditis elegans）3を含むクラウングループの線虫の外で、非線虫種で安定的に伝送されるトランスジェニック系統は、 糞線虫 4とPristionchus pacificus 5の例外を除いて、このもっともらしい門（線虫）で報告されていない。 P.の拡大する役割を容易に開発、進化、そして行動6-7の研究ではpacificusは 、我々はここにトランスジェニック動物や遺伝子のRNAiによるノックダウンを行うためのマイクロインジェクションを使用する現在の方法を説明します。の生殖腺のような<em&gt; C.虫や他のほとんどの線虫、P.の生殖腺pacificusは syncitialと直接マイクロインジェクションによって提供される卵母細胞にDNAとRNAを組み込むことが可能です。 C.とは異なり、 P.の虫はしかし、安定した導入遺伝子の継承と身体表現pacificusは、ターゲットの導入遺伝子と共射出マーカー5の両端に相補的なエンドヌクレアーゼで消化し ​​、自己ゲノムDNAを追加する必要があります。キャリアのゲノムDNAの添加は、 糞線虫 4とCの生殖細胞における遺伝子発現のための要件と同様ですエレガンス 。動物の独自のゲノムDNAの特定の要件がある場合は、それが明らかでないため、P. pacificus相馬は非複雑なマルチコピー遺伝子またはP.でその染色体外配列を黙らせるには非常に効率的です。 pacificusは、有糸分裂時の適切な動原体のアセンブリのためのゲノム配列が必要です。二軍の腹の移行（二子宮の）雌雄同体の生殖腺では、さらに個々のワーム8の両方の生殖腺を注入する能力を複雑にしています。我々はまた、ノックダウン、非ローリングF 1子孫を得るために生殖腺に二本鎖RNA（dsRNA）を注入することにより、優性突然変異体を（ローラー、tu92）にマイクロインジェクションの使用方法を示しています。 C.とは異なり、 虫 、他のほとんどの線虫のように、P. pacificus PS312は、餌と浸すため、dsRNAをsyncitial生殖巣にマイクロインジェクションによって投与されている必要がありますを介して全身性のRNAiを受け入れるではありません。この現在の研究では、PPA - EGL - 4プロモーターを変換するために必要なマイクロインジェクションのプロセスを記述することを望む：：GFP融合レポーターとノックダウン支配的なローラーPRL - 1（tu92）視覚的に有益なプロトコルの変異体。

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RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAiは、特定のmRNAの転写産物が1〜2ノックダウンできますが、モデル生物において、遺伝子導入は遺伝子の機能を操作することができます。このプロトコルは、necromenic線虫に安定的に伝送されるDNAと一時的な二本鎖RNAを導入するために必要な手法を例示することを目指して<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;、進化の発達、および行動生物学の研究のため。

RNAiは、Necromenic虫にマイクロインジェクションによる遺伝子ノックダウンとトランスジェネシスを媒介 Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

rnai-mediated-gene-knockdown-transgenesis-microinjection-necromenic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

16.4K ビュー.  California State University. RNAiは、特定のmRNAの転写産物が1〜2ノックダウンできますが、モデル生物において、遺伝子導入は遺伝子の機能を操作することができます。このプロトコルは、necromenic線虫に安定的に伝送されるDNAと一時的な二本鎖RNAを導入するために必要な手法を例示することを目指して Pristionchus pacificus、進化の発達、および行動生物学の研究のため。

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、<em&gt;チチュウカイミバエ</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

遺伝学

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

遺伝子編集アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ胚に CRISPR/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

環境学

Electroporation-mediated RNA Interference Method in Odonata

Dragonflies and damselflies (order Odonata) represent one of the most ancestral insects with metamorphosis, in which they change their habitat, morphology, and behavior drastically from aquatic larvae to terrestrial/aerial adults without pupal stage. Odonata adults have a well-developed color vision and show a remarkable diversity in body colors and patterns across sexes, stages, and species. While many ecological and behavioral studies on Odonata have been conducted, molecular genetic studies have been scarce mainly due to the difficulty in applying gene functional analysis to Odonata. For instance, RNA interference (RNAi) is less effective in the Odonata, as reported in the Lepidoptera. To overcome this problem, we successfully established an RNAi method combined with in vivo electroporation. Here we provide a detailed protocol including a video of the electroporation-mediated RNAi method as follows: preparation of larvae, species identification, preparation of dsRNA/siRNA solution and injection needles, ice-cold anesthesia of larvae, dsRNA/siRNA injection, in vivo electroporation, and individual rearing until adult emergence. The electroporation-mediated RNAi method is applicable to both damselflies (suborder Zygoptera) and dragonflies (suborder Anisoptera). In this protocol, we present the methods for the blue-tailed damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) as an example of damselfly species and the pied skimmer dragonfly Pseudothemis zonata (Libellulidae) as another example of dragonfly species. As representative examples, we show the results of RNAi targeting the melanin synthesis gene multicopper oxidase 2. This RNAi method will facilitate understanding of various gene functions involved in metamorphosis, morphogenesis, color pattern formation, and other biological features of Odonata. Moreover, this protocol may be generally applicable to non-model organisms in which RNAi is less effective in gene suppression due to the inefficiency and low penetrance.

We provide a detailed protocol for electroporation-mediated RNA interference in insects of the order Odonata (dragonflies and damselflies) using the blue-tailed damselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) and the pied skimmer dragonfly (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

オドナタにおけるエレクトロポレーション媒介性RNA干渉法

Dragonflies and damselflies (order Odonata) represent one of the most ancestral insects with metamorphosis, in which they change their habitat, ...

発生生物学

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

トウモロコシウンカ、 ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

生物工学

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

のマイクロインジェクション法<em&gt; Patiria minata</em&gt;接合体

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

生物学

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

RNAiのトリガ配信へ<em&gt;ハマダラカ</em&gt;蛹

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

RNAiは、Necromenic虫にマイクロインジェクションによる遺伝子ノックダウンとトランスジェネシスを媒介 Pristionchus pacificus

要約

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世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、

遺伝子編集アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ胚に CRISPR/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉

オドナタにおけるエレクトロポレーション媒介性RNA干渉法

トウモロコシウンカ、ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

のマイクロインジェクション法

RNAiのトリガ配信へ

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

RNAiは、Necromenic虫にマイクロインジェクションによる遺伝子ノックダウンとトランスジェネシスを媒介 Pristionchus pacificus

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世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、

遺伝子編集アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ胚に CRISPR/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉

オドナタにおけるエレクトロポレーション媒介性RNA干渉法

トウモロコシウンカ、 ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

のマイクロインジェクション法

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ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

トウモロコシウンカ、ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション