我々は、この原稿の彼らの注意深い読書のためにハラルドヒュ​​ッターとヘレナデッカーに感謝。我々はまた、彼の技術的な専門知識のためにライカマイクロシステムズからREG Sidhuに感謝。この研究は、国立科学及びカナダの技術評議会、賞＃327100から06、及び科学のサイモンフレーザー大学の学部によってサポートされていました。

パート1：リポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いて神経細胞のトランスフェクション機器のセットアップ： ラットまたはマウスの海馬ニューロンをKaechとバンカー、2006 [4]に従って培養されています。トランスフェクションのために使用される典型的な細胞密度は、250,000 cells/6-cm皿です。必要な試薬と装置は、50mMのキヌレン酸、定期的なベンチトップ型のチューブホルダー、ベンチトップクーラーを（最高のリポフェクトアミン試薬の寒さを保つために）、含まれています リポフェクタミン試薬、MEM、マイクロチューブ、micropipetters、および滅菌ピンセット。 手順： <ol><li>各トランスフェクションのラベルのための2つの1.5 mLチューブ、プラスミドDNA、トランスフェクション試薬を含む1つを含む1つ。以下のインキュベーションは、室温で進むことができます。 <ol><li>つのチューブに100μLMEMでプラスミドDNA 1.0μgを組み合わせる（あらゆるタイプのサプリメントなしで、MEMは、平衡pHの温度である必要はありません）。 </li><li>他の1.5 mlチューブに100μLMEMを6.0μLリポフェクタミンを組み合わせる。 <ol><li> DNAの比がこのような場合には半減されます：ダブルトランスフェクションのための調整はリポフェクタミンがいても必要ありません。リポフェクタミンの比率：DNAは、製造業者の提案の中ではまだです。最適な発現のためにそれぞれのプラスミドに対して0.5〜1.0μgのをテストするのが最善です。 </li><li>リポフェクタミン試薬の貯蔵寿命を維持するために、それは可能な限り短い時間のために冷蔵庫から取り出し、使用していないときは、ベンチトップクーラーに配置する必要があります。 冷蔵庫の合計時間は最小限に抑える必要があります。 </li></ol></li></ol></li><li>室温で5分間チューブをインキュベートします。 </li><li>脂質チューブにDNAインMEM液を移し、ゆっくりと室温で30分間インキュベートし、ピペットで混ぜる。 </li><li> 25分後、カバースリップを反転する前に、培養神経細胞のディッシュにexcitoxic被害を最小限に抑えるために50mMのキヌレン酸60μLを加える。 <ol><li>慎重にフリップカバースリップは、足側を上向きにして、滅菌ピンセットを用いて、それらが重複しないように手配する。ニューロンでコーティングされたカバースリップの表面または皿のグリアコーティングされた表面をこすり取るように注意してください。 </li></ol></li><li> 6cmシャーレから培地の約0.5 mLをとり、軽くチューブにDNAを混ぜ、培地の表面に均一に滴下皿に戻ってDNA溶液を移す。 </li><li>渦巻きにはない、しかし優しく一方向に前後に料理をスライドさせ、その後、均等にDNA -リポフェクタミン複合体を配布するために垂直方向に停止し、繰り返します。組織培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で90分間インキュベートする。 </li><li>彼らは重複しないようにフリップカバースリップは、足側のダウン、および手配。式が48時間に一般的に一晩、希望の時間を進行することができます。 </li></ol>パート2：培養海馬神経細胞におけるGFP -タグ付き高密度コア小胞のライブイメージング機器のセットアップ： <ol><li>生細胞のイメージングは​​、CCDカメラを装備した蛍光顕微鏡が必要です我々は、ライカの変数を装備したライカDMI 6000B倒立顕微鏡、蛍光灯を使用してください。また、温度コントローラと客観的なヒーターの撮像室がある必須。我々は、ワーナーインスツルメンツRC - 21BRは（カタログ番号TC324B）プラットフォームのヒーターに加えて、直径18mmのカバースリップのために変更（カタログ番号PH2）と温度コントローラを使用してください。チャンバーは開いているポート、チャンバーを注文するときに含めることができる修正が含まれていません。客観的なヒーターは非常にカバースリップの温度を維持し、温度変化によるフォーカスの変化を最小限に抑えることをお勧めします。画像は、買収のドロップインの&quot;ストリーミング&quot;モードを含む、Metamorph（Molecular Devices社）のソフトウェアを使用して、浜松オルカ- ERで取得されています。注 - 我々は全体の顕微鏡を囲む気象室を使用しないでください。このほか、高価とここで説明する短期的なイメージングのための必要はありません。 </li><li>他の機器と試薬は、作りたてのライブイメージングの培地（1XのCa 2ハンクス+およびMg 2 +、0.6％グルコース、および10mMのHEPES）、さらに18 mmのカバーガラス、滅菌ピンセット、非滅菌ピンセット、キムワイプ、真空グリースが含まれています、およびグリースを適用すると注射器（針なし、または変更されたワイドボア針付き）。 </li></ol>手順： <ol><li> （1XのCa 2ハンクス+およびMg 2 +、0.6％グルコース、および10mMのHEPES）、新鮮なライブイメージングの培地を準備します。使用しないときに我々は通常、4℃で、時間と店舗で50mls準備。一度に1週間以内に十分な準備をするのが最善です。約5〜10 mLをニューロンの皿ごとに使用されています。 </li><li>顕微鏡、カメラ、蛍光灯、および画像集録ソフトウェアを起動します。またチャンバーのプラットフォームと客観のヒーターの電源を入れます。 </li><li>想像を準備グラムチャンバー。 <ol><li>ワーナーチャンバーは、カバースリップをマウントするためのテフロンインサートが含まれています。永久的なマーカーを含むINSERT&quot;トップ&quot;の操作、ラベル一面の容易さのため。 </li><li> &quot;トップ&quot;とラベルされたチャンバーの側面に穴を囲む溝にグリースのリングを適用する。それはチャンバーに入ると観察可能な領域を削減するように過剰な使用は避けてください。 </li><li>鉗子を使用して、チャンバーの&quot;上&quot;側にきれいな、未使用の18 - cmのカバーを取り付け、チャンバーの凹溝内に密封を作成するには、その端にカバースリップに穏やかな圧力を与える。 </li><li>チャンバーを裏返しにして、チャンバーの反対側（下）側の溝にグリースの同じようなリングを適用する。 </li><li>理想的なチャンバーの所有者である50 - mLのチューブの蓋のアップで、準備室から下側に置きます。 </li><li>チャンバーにイメージング培地750μLを加える。これは過剰な量ですが、グリースが溢れ出るの培地を防ぐ必要があり、過剰の細胞で覆われたカバースリップが適用されるときにトラップされる気泡を防ぐことができます。 </li><li>必要になるまで組織培養インキュベーターで準備室を維持する。イメージング培地が蒸発し、組成物中に変更されるように長時間のインキュベーションは、〜1時間は避けてください。 </li></ol></li><li>最終的なチャンバーの組立と生細胞イメージングを実行します。 <ol><li>準備室やインキュベーターからの組織培養フードにトランスフェクトされたカバースリップの皿を移動します。 </li><li>最後のチャンバアセンブリは、細胞を培地にし、℃で連続して37℃で浸漬されたまま確保するために迅速に実行する必要があります。 </li><li>滅菌ピンセットを使用して、慎重にトランスフェクトされた皿から一カバーを取り外し、増殖培地を離れて描画するキムワイプにカバースリップの端に触れる。 </li><li>準備室の上にカバースリップのニューロンサイドダウン置きます。第一グリースにカバースリップの片側をタッチし、気泡をトラップせずにフラットなカバースリップを持って来るためにエッジの周りの圧力を適用する。過剰イメージング媒体は期待通りにこぼれるでしょう。 </li><li>過剰イメージング培地を拭き取ったが、位置からカバーグラスをスライドさせしないように注意してください。 </li><li>予備加熱プラットフォームのヒーターにチャンバーを移動し、場所でチャンバーを固定します。 </li><li>ステージにチャンバーを転送する。 </li><li>退色とphotoxicityを減らすために、トランスフェクションされた細胞を見つけるために必要な強度の最小量にランプを調整する。 </li><li>低倍率の油浸対物（40倍速）で目的の細胞を見つける。それは右に向かって、最大のスキャンとダウン、、カバースリップの左上の最大のカバースリップのカバレッジを確保するために、冗長な画像の取得、などを避けるために計画された検索パターンに固執することは有益である。 </li><li>目的のフィールドが配置された後、高倍率の油浸対物（60〜100倍）に切り替えます。 </li><li>蛍光標識タンパク質のダイナミクスの映像を記録する&quot;ストリームの取得&quot;またはイメージングソフトウェアの同等の機能を使用してください。 </li><li>後の分析とプレゼンテーションのための位相画像及びその他の付随する画像（例えば可溶性GFP）を取る。 </li><li>さらにカバーを探索し、次のビデオを記録する前にすべての画像を保存します。 </li><li>一般に、1つのカバースリップ3から5のビデオは成功したとみなされます。トランスポートが損傷を受けた細胞で減少すると光毒性と一般的な細胞の健康を心に留めておく必要があります。細胞の健康は、位相差顕微鏡を用いて観察して監視できます。通常は録音はカバースリップあたり約30分間実行されます。 </li></ol></li></ol>パート3：代表的な結果： ライブセルイメージング観測は、通常のビュー（図1A）のフィールド内に蛍光タグ付き小器官の動きを示すビデオ（また、画像の&quot;スタック&quot;とも呼ばれる）で構成されています。各ビデオを伴い、しばしば細胞体に関して、タンパク質の発現および/または細胞の健康状態のレベルでの視野の方向を示す画像をサポートしています。輸送のビデオはkymographs（図1B）に形質転換により定量分析を行うことができる。 Kymographsは、各時点がカイモグラフの列で表される行のスキャンを並べることによって粒子の運動を説明する画像です。図2は、反対方向に動いつの粒子がカイモグラフで表現される方法を示しています。 kymographsのさらなる分析は、粒子フラックス、速度、ランレングス、反転、および静止した粒子に関する情報を提供することができます。 <img src="/files/ftp_upload/1144/fig1.jpg" alt="" /> 図1代表的な生細胞イメージングの観測。mCherryタグ付き組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）輸送の映像から（A）選択されたフレーム。順行性に移動する個々の粒子（緑の矢印）との逆行（赤矢印）の方向が示されている。（B）を説明するKymographsは、TPA - mCherry運動軸索。斜めの線が細胞体から（正のスロープ）または（負勾配）に向かって遠ざかってオルガネラを表してkymographsの水平線は、静止オブジェクトを表します。長い緑と赤の矢印は、（）内の粒子に対応する実行を示しています。微小管脱重合試薬、ノコダゾールによる輸送の変化は、またカイモグラフで示されています。斜め線の有無によって細胞小器官の移動の削減に注意してください。

<ol>
	<li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport.">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li><li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon.">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li><li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides.">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

ライブセルイメージングには、培養神経細胞でのオルガネラの輸送の直接観測のための挑戦的な、しかし強力な手法です。困難は、文化の合併症のために貧しい人々のニューロンの健康と手順の上流に起こることができます。したがって、細胞の健康状態は（例については文献4参照）増殖培地で組織培養光顕微鏡を使用中にカバースリップを観察することによってトランスフェクションの前と後に評価されるべきである。イメージングチャンバーにニューロンを含むカバースリップを転送するプロセスは、それゆえに、カバースリップを操作するときに注意を行使することが重要である、細胞にストレスになること。健康そうな顔をしている細胞は手続きの遅れに起因する輸送、またはイメージングメディアの装置または平衡の予熱不完全を表示しないすることが一般的であるができます。輸送解析の軸索と樹状突起の向きは、すなわち順行性と逆行性輸送を区別する、知られている必要があります。したがって、細胞体の位置が決定されていることと、連続神経セグメントが細胞体への関心の領域を接続して見ることができることを確認することが重要です。多くの場合、可溶性GFPの重複する画像を保存、またはinformatively保存されたビデオファイルを命名、&quot;Cell1CellBodyUpperLeft&quot;、など、分析のためのプロセス&quot;の向きを確認するのに十分です。

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David M. Kwinter, Michael A. Silverman

instead of:

David Kwinter, Michael Silverman.

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Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>Transfection reagent</td>
</tr>
<tr>
<td>10X Hanks with Ca2+ and Mg2+</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>14185-052</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>15630-130</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons

観測とダイナミックな細胞プロセスを特徴付けることは、静止画像から得られることができない細胞の活動に関する重要な情報を得ることができる。バイタル蛍光プローブ、特に緑色蛍光タンパク質（GFP）は、特定の細胞内区画と細胞構造を標識するために能力に起因する細胞生物学に革命をもたらしています。例えば、GFP（とそのスペクトル変異体）キメラのライブイメージングは​​、生物や細胞の種類[1-3]の多数の細胞骨格、オルガネラ輸送、および細胞膜のダイナミクスの動的解析のために許可されている。ライブイメージングが普及しているが、このアプローチは、まだ特に初代培養神経細胞で、多くの技術的課題があります。 1つの課題は、有糸分裂後のニューロンでGFP -タグ融合タンパク質の発現であり、他には、光毒性を最小限に退色し、一般的な細胞の健康を維持しながら蛍光画像をキャプチャする機能です。ここでは、比較的低いトランスフェクション率（〜0.5％）が得られる脂質ベースのトランスフェクション法を説明するプロトコルを提供する、しかし完全に偏光ニューロンの撮影に最適です。低トランスフェクション率は、単一の軸索と樹状突起が順行性V.逆行輸送、すなわち、の方向性を確認するために細胞体にその方向へと特徴付けることができるようにすることが不可欠です。イメージングGFPを発現する神経細胞への我々のアプローチは、標準的な広視野蛍光をCCDカメラを装備した顕微鏡、画像キャプチャソフトウェア、および加熱されたイメージングチャンバーに依存しています。我々は特別な光学系や蛍光灯の光源以外の励起要件なしで、例えば、高密度コア小胞、ミトコンドリア、成長円錐、およびアクチンを細胞小器官や構造体のさまざまな画像化している。さらに、スペクトル的に異なる、蛍光標識タンパク質、例えば、GFPとDsRed -タグ付きタンパク質は、共同輸送や他のコーディネート携帯電話のイベントを特徴付けるために、同時に近くに視覚化することができます。ここで説明したイメージング手法は、各種イメージングアプリケーション用の柔軟性があり、顕微鏡が使用可能な場合、比較的少ない費用のための実験室で採用することができます。

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Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

オルガネラの人身売買のダイナミクスを研究するときに、ライブセルイメージングには特に有用です。ここでは、広視野蛍光顕微鏡を用いた培養神経細胞における高密度コア小胞のライブイメージングのためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは柔軟性があり、画像その他のようなミトコンドリアなどのオルガネラ、エンドソーム、およびペルオキシソームに適合させることができます。

初代培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞のライブイメージング

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

live-imaging-dense-core-vesicles-primary-cultured-hippocampal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K ビュー.  Simon Fraser University. オルガネラの人身売買のダイナミクスを研究するときに、ライブセルイメージングには特に有用です。ここでは、広視野蛍光顕微鏡を用いた培養神経細胞における高密度コア小胞のライブイメージングのためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは柔軟性があり、画像その他のようなミトコンドリアなどのオルガネラ、エンドソーム、およ?...

ビデオ: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Hi, I'm Kma. I work in Case Lab at Brown University Clean Slicer stage with 70%ethanol. Place plate insert into six.Well plate with medium and incubate at 37 degree whole brain with tweezers between midbrain and four brainin. Isolate hippocampus on one side, isolate hippocampus from the second side. Place hippocampi onto A PBS drop.Aspirate out the PBS make sagittal sections using the tissue slicer. Repeat transfer slicers onto a perish by squatting with PBS wash sections by adding and aspirating PBS and medium gently. Separate sections with tweezers.Wash sections with PBS and media. Again, transfer sections onto the plate and insert. Aspirate out the media in sections using tweezers.Attach gene gun hose to the helium cylinder. Attach barrel to gene gun. Fill the magazine with bullets.Insert magazine into the Jing gun. Adjust the pressure on the helium tank shoot. EGFP coated beads onto the sections.And now.

海馬ニューロンの遺伝子郡のトランスフェクション

生物学

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and memory. Primary hippocampal cell culturing allows neuroscientists to examine the activity and properties of neurons at the individual cell and single synapse level. In this video, we will demonstrate how to isolate and grow primary hippocampal cells from newborn rats. The hippocampus may be isolated from each newborn animal in as short as 2 to 3 minutes, and the cultures can be maintained for up to two weeks. We will also briefly demonstrate how to use these hippocampal neurons for ratiometric calcium imaging. While this protocol describes the process for the hippocampus, with little to no modification, it can be applied to other regions of the brain.

The dissection and growth of cells from an individual brain area facilitates investigation of cellular and physiological parameters. We describe a method for primary cell culturing that produces neuron-enriched cultures in a serum-free environment.

P0新生児ラットからの海馬ニューロンの初代培養

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

培養一次マウス胚線維芽細胞におけるシグナル伝達分子のアデノウイルス媒介遺伝子除去

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

培養中の細胞小器官輸送<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;細胞：S2細胞ラインと一次ニューロン。

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

ライブ初代細胞におけるG3BPストレス顆粒動態の可視化

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...