Sviluppiamo metodi IC microfili ad alto rendimento per studiare la diversità della popolazione cellulare e le interazioni cellula-cellula. In questo contesto, le microgoccioline di gel ci consentono di eseguire utili passaggi del protocollo, come la manipolazione del DNA con colorazione della lisi e la microscopia in modo altamente paralizzato nelle cellule intrappolate. I flussi di lavoro microfili a goccia sono noti per l'altissima produttività e versatilità, ma l'adozione è spesso limitata dalla necessità di strumentazione di fascia alta e competenze specializzate.
Il nostro protocollo migliora le tecniche tradizionali utilizzando l'analisi di singole cellule ad alto rendimento con colorazione fluorescente e un flusso di lavoro di microscopia open source accessibile. Incapsula le cellule in microgoccioline di gel tramite microfluidica per analizzare contemporaneamente minicelle e microcolonie. Sebbene le colture di massa e su piastra manchino di specificità e risoluzione, questo metodo fornisce statistiche precise e rappresentative di diversi fenomeni.
I nostri protocolli combinano microfluidica a gocce, microscopia a fluorescenza e hardware open-source in un metodo basato su etichette. Questo approccio rende l'analisi di singole cellule più flessibile e conveniente, consentendo alla comunità scientifica di affrontare complesse questioni scientifiche riguardanti le comunità microbiche. Per iniziare, scaldare l'agarosio a bassissima temperatura di gelificazione a una concentrazione compresa tra il 2% e i 90 gradi Celsius in Luria Bertani o brodo LB.
Agitare la miscela per 10 minuti in uno shaker a temperatura controllata, quindi ridurre la temperatura del thermo shaker a 39 gradi Celsius per raffreddare la soluzione di agarosio. Posizionare il tubo di sospensione di Escherichia coli nell'agitatore termico per quattro minuti per riscaldarlo a 39 gradi Celsius. Mescolare la sospensione batterica e la soluzione di agarosio in un rapporto uno a uno per ottenere una concentrazione di agarosio dell'1% con una sospensione cellulare di 3,1 volte 10 alla potenza di sei cellule per millilitro.
Preparare la soluzione di controllo negativo per il monitoraggio della contaminazione utilizzando LB e sospensione di agarosio in un rapporto di uno a uno. Ottieni la piattaforma di flusso open source completa, inclusi i driver di pressione del gas e i sensori di flusso. Includere un vetrino in vetro e riscaldatori per puntali per pipette nella configurazione per controllare la temperatura del campione di cellule di agarosio quando entra nel chip.
Quindi, posizionare il chip microfluidico sul tavolino di microscopia stroboscopica, assicurandosi che la giunzione di generazione delle goccioline sia visibile. Impostare il riscaldatore del puntale della pipetta e il riscaldatore del vetrino in vetro a 40 gradi Celsius utilizzando l'interfaccia del software di controllo. Utilizzando una siringa con tubo e un tappo PDMS, caricare la miscela di sospensione cellulare all'1% in un puntale per pipetta da 200 microlitri.
Inserire la punta nel riscaldatore della punta e posizionarla sull'ingresso della fase acquosa nel chip microfluidico. Sostituire la guarnizione PDMS del puntale con quella collegata al tubo del sistema di controllo del flusso. Quindi, inserire il tubo dell'olio nel secondo ingresso e l'estremità del tubo di uscita in un tubo di scarico.
Quindi impostare la pressione a 80 millibar per le fasi di acquiescenza e olio sull'interfaccia utente e avviare l'infusione della sospensione cellulare e dell'olio. Regolare la fase dell'olio a 320 millibar e la fase di acquiescenza a 180 millibar. Attendere un minuto per stabilizzare la generazione di goccioline.
Una volta stabilizzata la generazione di goccioline, trasferire il tubo di scarico dal tubo di scarico al tubo di raccolta. Continuare a raccogliere le goccioline sul ghiaccio fino a quando il serbatoio del campione non è vuoto. Dopo la raccolta, posizionare i tubi a quattro gradi Celsius per un'ora per far entrare il gel di agarosio all'interno delle goccioline.
Incubare le microgoccioline di gel contenenti batteri e le goccioline di controllo negativo a 37 gradi Celsius per quattro ore o durante la notte per la crescita delle colonie. Dopo l'incubazione, utilizzare una siringa da tre millilitri con un ago calibro 21 per rimuovere con cura quanto più olio possibile dalla base dell'emulsione di microgocce di gel. Trasferire 50 microlitri di microgoccioline di gel in una nuova microprovetta e conservarla a quattro gradi Celsius per un'ulteriore analisi delle goccioline, aggiungere una miscela uno a uno di olio fluorurato con PFO in un volume pari all'emulsione rimanente.
Successivamente, aggiungere circa 200 microlitri di tampone di cloruro di sodio allo 0,9% sopra l'emulsione. Agitare la miscela e farla girare brevemente in una centrifuga a velocità fissa. Rimuovere con cautela la fase oleosa dal fondo dell'interfaccia liquida e scartare 100 microlitri di soluzione di cloruro di sodio dalla parte superiore.
Trasferire due microlitri di microgoccioline di gel in un vetrino della camera di imaging e aggiungere cinque microlitri di olio fluorurato per aiutare a formare un monostrato di goccioline per un imaging ottimale. Sul microscopio, attivare l'illuminazione a matrice di LED bianchi dall'alto per l'imaging in campo chiaro. Montare il vetrino preparato.
Concentrati sul campione per individuare un monostrato di goccioline e acquisire un'immagine in campo chiaro. Quindi, regolare la ruota portafiltri in modo che si allinei con il filtro della lunghezza d'onda verde. Passa al LED a 470 nanometri per l'eccitazione e, senza spostare il campione, cattura un'immagine fluorescente delle colonie.
Trasferire due microlitri di micro-gel colorati con ioduro di propidio in un chip della camera di imaging e aggiungere cinque microlitri di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% per formare un monostrato di micro-gel. Sigillare l'ingresso e l'uscita del chip per evitare l'evaporazione durante l'imaging. Regola il filtro dell'intervallo della lunghezza d'onda rossa per l'imaging dello ioduro di propidio e acquisisci le immagini in campo chiaro e fluorescenti.
L'incapsulamento cellulare in microgoccioline di gel è stato confermato dalla microscopia in campo chiaro, che mostra goccioline uniformi con cellule incapsulate distinte. Le colonie che hanno perso la fluorescenza codificata dai plasmidi sono state identificate utilizzando l'analisi del rapporto di fluorescenza. Su 2.785 colonie analizzate, 100 colonie hanno perso la fluorescenza, indicando un tasso di perdita di plasmidi del 3,6%
