La terapia con cellule CAR T ha ottenuto un successo senza precedenti nel trattamento di alcuni tumori patologici. In questo studio, abbiamo introdotto un approccio non virale a lunga integrazione per la generazione di cellule CAR T transitorie e fornito procedure mirate per valutare la funzione delle cellule CAR T. La nostra ricerca mira a generare cellule CAR T sicure ed efficaci con un approccio più conveniente.
Le cellule CAR T sono tipicamente generate dalla trasduzione virale. I retrovirus e gli antivirus sono i vettori virali più comuni per la consegna del gene CAR. La produzione di vettori virali è complessa e costosa e la trasduzione virale induce l'integrazione casuale e permanente del DNA codificante CAR nel genoma delle cellule T, il che può causare problemi di sicurezza.
Il nostro protocollo offre un approccio non virale per la generazione di cellule T CAR che esprimono solo transitivamente CAR. Questo metodo utilizza l'mRNA per l'espressione di CAR e impiega l'elettroporazione per fornire l'mRNA nelle cellule T. Questo non ha alcuna integrazione genica nel genoma delle cellule T e le procedure di produzione sono più semplici ed economiche.
Per iniziare, linearizzare il DNA plasmidico CAR con l'enzima di restrizione BGL2 ed eseguire la procedura di estrazione del DNA con alcol isoamilico fenolo-cloroformio. Dopo aver purificato il DNA linearizzato, verificare le dimensioni e l'integrità del modello con elettroforesi su gel di agarosio. Per la trascrizione in vitro, mescolare i componenti della reazione e incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius per almeno due ore.
Dopo la trascrizione, aggiungere alla reazione due microlitri di ribonucleasi III, DNasi I. Mescolare delicatamente e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius per degradare il DNA stampo. Purificare l'MRNA CAR trascritto con un kit di pulizia dell'RNA e diluirlo in acqua priva di nucleasi.
Misurare la concentrazione di mRNA utilizzando uno spettrofotometro prima di conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Scongelare il campione di mRNA di auto trascritto e purificato in vitro su ghiaccio. Sospendere una volta 10 alla potenza di sei cellule mononucleate del sangue periferico umano crioconservate in un millilitro di terreno CAR T.
Per attivare le cellule T, aggiungere un numero uguale di perle CD3/CD28 di attivatore T umano prelavate. Coltivare ed espandere le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica per diversi giorni. Aggiungere un millilitro di terreno CAR T per pozzetto a due pozzetti di una piastra a 12 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per l'equilibrio.
Ora, trasferisci cinque volte 10 alla potenza di sei cellule T in una provetta sterile. Per rimuovere le perle CD3/CD28, posizionare la provetta su un supporto magnetico e pipettare con cura la sospensione cellulare in una nuova provetta. Centrifugare la provetta a 300 G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di PBS sterile. Centrifugare nuovamente la provetta e risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone Neon T.Mescolare cinque microgrammi di CAR MNA diluito nel tampone Neon T e 100 microlitri di cellule in un volume totale di 125 microlitri. Aggiungi 25 microlitri di tampone Neon T ai restanti 100 microlitri di cellule, che funge da controllo negativo.
Impostare il sistema di elettroporazione Neon su 1.800 volt, 10 millisecondi e un singolo impulso. Utilizzare la pipetta Neon per aspirare la miscela di mRNA CAR delle cellule T in una punta Neon da 100 microlitri ed elettroporare le cellule. Trasferire immediatamente le cellule elettroporate nel terreno di coltura bilanciato nella piastra a 12 pozzetti e rimettere la piastra nell'incubatore per espandere le celle fino a quando non sono pronte per l'uso.
Recuperare le cellule T trasfettate con l'mRNA CAR per l'analisi citofluorimetrica già sei ore dopo l'elettroporazione. Mescolare più volte le cellule CAR T con una pipetta e trasferire almeno una volta 10 alla potenza di cinque cellule in una provetta da cinque millilitri di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, o FACS. Aggiungere tre millilitri di tampone di lavaggio a freddo alla provetta e centrifugare la provetta a 500 G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di tampone di lavaggio. Aggiungere due microlitri di anticorpo di rilevamento marcato con fluorescenza e sette coloranti di vitalità AAD alle cellule sospese. Mescolare il campione e incubarlo su ghiaccio per 30 minuti, evitando l'esposizione alla luce, quindi lavare le cellule con tre millilitri di tampone di lavaggio a freddo e centrifugare nuovamente la provetta a 500 G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone di lavaggio e analizzare immediatamente le cellule utilizzando un citometro a flusso. Rimuovere il terreno dalle cellule tumorali che esprimono l'antigene CAR sulla superficie cellulare. Dopo aver lavato le cellule con PBS, incubarle con un millilitro di soluzione di tripsina EDTA allo 0,05% per un minuto a 37 gradi Celsius, quindi preparare una sospensione di singole cellule nel terreno di coltura appropriato a una densità da una a cinque volte 10 alla potenza di cinque cellule per millilitro.
Successivamente, aggiungere 50 microlitri di terreno di coltura di cellule tumorali preriscaldato alla piastra E e posizionarla in uno strumento di analisi cellulare in tempo reale, o RTCA, per misurare l'impedenza di fondo, quindi aggiungere 100 microlitri di sospensione di cellule tumorali a ciascun pozzetto ed equilibrare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti. Riposizionare la piastra E nello strumento RTCA e monitorare l'indice cellulare per 24 ore, con misurazioni effettuate ogni 5-15 minuti. Il giorno seguente, preparare la sospensione della cellula T CAR.
Mettere in pausa la registrazione dell'indice cellulare e rimuovere la piastra E dallo strumento RTCA. Inclinare leggermente la piastra e rimuovere con cura 50 microlitri di terreno di coltura da ciascun pozzetto senza disturbare le cellule tumorali, quindi aggiungere 100 microlitri di cellule T CAR o cellule T di controllo a ciascun pozzetto. Riportare la piastra E nello strumento RTCA e riprendere il monitoraggio dell'indice cellulare per almeno 24 ore, con scansioni effettuate ogni 5-15 minuti.
Interrompere il monitoraggio dell'indice cellulare e analizzare il risultato della citotossicità. Per l'analisi della secrezione di citochine, trasferire il surnatante da ciascun pozzetto in una piastra a fondo rotondo o a 96 pozzetti a forma di V. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 300 G per cinque minuti a temperatura ambiente e trasferire con cura i surnatanti in una nuova piastra a 96 pozzetti.
Infine, misurare i livelli di citochine nei surnatanti utilizzando kit ELISA commerciali. La sequenza di mRNA CAR è stata convalidata per avere una dimensione di circa due kilobasi mediante elettroforesi su gel. Oltre il 50% delle cellule T attivate ha espresso il CAR il primo giorno dopo l'elettroporazione, aumentando a oltre il 70% il secondo giorno prima di scendere a circa il 10% entro il quinto giorno.
Le cellule T CAR hanno mostrato una citotossicità significativa contro le cellule tumorali SK-OV-3 HER2 positive, indicata da una forte riduzione dell'impedenza tumorale, mentre le cellule T di controllo hanno dimostrato un effetto minimo. Alti livelli di secrezione di interferone gamma sono stati rilevati nel terreno di coltura delle cellule T CAR, ma non nel gruppo di controllo.
